Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim trẻ tuổi

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN<br /> ĐỘT BIẾN - 455G/A TRÊN GEN FIBRINOGEN BETA<br /> Ở BỆNH NHÂN NHỒI MÁU CƠ TIM TRẺ TUỔI<br /> Lương Thị Lan Anh, Trương Thị Thanh Hương<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Ngày nay, các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ tuổi có tính gia đình, không rõ các nguy cơ môi trường gây<br /> bệnh, có thể liên quan đến đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta (FGB)<br /> quy định tổng hợp chuỗi fibrinogen. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR, có so sánh với giải trình<br /> tự gen để phát hiện đột biến -455G/A ở 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi được chẩn đoán xác<br /> định nhồi máu cơ tim cấp tại Viện Tim mạch Việt Nam. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen Fibrinogen<br /> Beta là 25%. Tỷ lệ phát hiện đột biến ở nam và nữ có sự khác nhau: 28,57% và 16,67%, các kết quả phù<br /> hợp với giải trình tự gen. Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật Realtime PCR để phát hiện đột biến 455G/A trên gen Fibrinogen Beta ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp trẻ tuổi.<br /> Từ khoá: Nhồi máu cơ tim cấp, gen FGB, đột biến - 455G/A<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Theo các nghiên cứu, đa phần người cao<br /> tuổi mắc phải căn bệnh này, tuy nhiên nhiều<br /> <br /> Nhồi máu cơ tim được xếp thứ nhất trong<br /> số 7 nhóm bệnh gây tử vong hàng đầu trên<br /> thế giới. Ước tính ở Hoa Kỳ có khoảng 1 triệu<br /> bệnh nhân nhập viện mỗi năm vì nhồi máu cơ<br /> tim cấp và khoảng 200.000 đến 300.000 bệnh<br /> nhân tử vong hàng năm vì nhồi máu cơ tim<br /> cấp [1]. Tại Việt Nam, nhồi máu cơ tim cấp<br /> đang có xu hướng gia tăng trong những năm<br /> gần đây, tỷ lệ tử vong vẫn còn cao và đang là<br /> vấn đề thời sự rất được quan tâm. Năm 2003,<br /> theo thống kê của Viện Tim mạch Quốc gia<br /> Việt Nam, tỷ lệ bệnh nhân vào viện vì nhồi<br /> máu cơ tim cấp là 4,2%, đến năm 2007 con số<br /> này là 9,1%. Ở Bệnh viện Chợ Rẫy, năm 2010<br /> có tới 7.421 trường hợp nhập viện vì đau thắt<br /> ngực, 1.538 ca phải nhập viện và điều trị vì<br /> hội chứng vành cấp, 267 trường hợp tử vong<br /> [2; 3].<br /> <br /> trường hợp nhồi máu cơ tim xuất hiện ở<br /> người < 60 tuổi và thậm chí ở lứa tuổi trẻ hơn,<br /> < 30 tuổi, một số dẫn đến tử vong. Các nghiên<br /> cứu gần đây trên thế giới đề cập đến mối liên<br /> quan giữa nhồi máu cơ tim với biến đổi vật<br /> chất di truyền ở cấp phân tử. Các nghiên cứu<br /> cho rằng các trường hợp nhồi máu cơ tim trẻ<br /> tuổi hoặc có tính gia đình, không rõ các nguy<br /> cơ môi trường gây bệnh, có thể liên quan đến<br /> đột biến gen, trong đó hay gặp đột biến<br /> - 455G/A của gen Fibrinogen Beta quy định<br /> tổng hợp chuỗi fibrinogen β [4 - 7]. Fibrinogen<br /> là 1 protein được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide (chuỗi α, β và γ), tham gia quá trình đông<br /> máu và đóng một vai trò quan trọng trong quá<br /> trình hình thành huyết khối. Đột biến -455G/A<br /> trên gen có thể gây tác động mạnh nhất lên<br /> tốc độ tổng hợp của toàn phân tử fibrinogen,<br /> từ đó làm tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim [8].<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Lương Thị Lan Anh, Bộ môn Y sinh học Di<br /> truyền, Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: lanhluong@gmail.com<br /> Ngày nhận: 16/12/2016<br /> Ngày được chấp thuận: 26/2/2017<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> Để phát hiện đột biến điểm -455G/A trên<br /> gen Fibrinogen Beta, phương pháp sinh học<br /> phân tử thường được nghĩ tới đầu tiên là giải<br /> trình tự gen, nhưng không phải cơ sở nghiên<br /> <br /> 17<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> cứu và ứng dụng nào cũng có thể làm được<br /> <br /> được chẩn đoán xác định nhồi máu cơ tim cấp<br /> <br /> bởi yêu cầu phải có hệ thống giải trình tự gen<br /> <br /> tại Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai.<br /> <br /> và chi phí tiêu hao cho giải trình tự gen khá<br /> tốn kém. Realtime PCR là kỹ thuật khuếch đại<br /> gen, có nhiều ưu điểm so với PCR truyền<br /> thống, được ứng dụng ngày càng rộng rãi<br /> <br /> - Thời gian: từ tháng 1/2013 đến tháng<br /> 1/2016.<br /> - Địa điểm: Bộ môn Y sinh học - Di truyền,<br /> Đại học Y Hà Nội.<br /> <br /> trong di truyền học, công nghệ sinh học cũng<br /> như nhiều lĩnh vực khác. Tuy nhiên, ở Việt<br /> Nam hiện nay, chúng tôi chưa thấy tác giả nào<br /> nghiên cứu và ứng dụng kĩ thuật này trong<br /> việc phát hiện đột biến -455G/A nhằm góp<br /> phần tầm soát sớm bệnh nhồi máu cơ tim.<br /> Nghiên cứu được thực hiện nhằm: xác định<br /> <br /> 2. Phương pháp: nghiên cứu mô tả.<br /> Quy trình nghiên cứu<br /> - Lấy 2ml máu tĩnh mạch ngoại vi và chiết<br /> tách DNA tổng số. DNA được kiểm tra độ tinh<br /> sạch và hàm lượng bằng máy đo quang phổ<br /> Nano - Drop 2000.<br /> <br /> đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta<br /> - Thực hiện kỹ thuật Realtime PCR phát<br /> <br /> bằng kỹ thuật Realtime PCR.<br /> <br /> hiện đột biến -455G/A. Gen Fibrinogen Beta<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> được thiết kế nhân lên bằng kỹ thuật PCR trên<br /> vùng promoter tại vị trí nucleotide xác định<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> theo ngân hàng trình tự gen Quốc tế<br /> <br /> - 20 bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp < 60 tuổi<br /> <br /> (GenBank, M 64983.1).<br /> <br /> Bảng 1. Primer - Probe phát hiện gen FGB<br /> Mồi – Đoạn dò<br /> <br /> Trình tự 5’ - 3’<br /> <br /> Sản phẩm (bp)<br /> <br /> F -AATAACTTCCCATCATTTTGTCCAATTC<br /> Mồi (FGBf3m- FGBr4m)<br /> <br /> 730<br /> R -AGTCGTTGACACCTTGGGACTTAACTTG<br /> FGB1m (phát hiện gen không đột biến)<br /> <br /> Đoạn dò<br /> FGB2m (phát hiện gen đột biến)<br /> * FGBr4m: Mồi ngược (Fibrinogen Beta reverse); FGBf3m: mồi xuôi (Fibrinogen Beta forward).<br /> - Phản ứng Realtime PCR được tiến hành<br /> 6 phản ứng:<br /> + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe<br /> không đột biến.<br /> + Mẫu nghiên cứu với phản ứng có probe<br /> đột biến.<br /> + Chứng đột biến.<br /> + Chứng không đột biến.<br /> + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có<br /> probe không đột biến.<br /> 18<br /> <br /> + Chứng âm (nước cất) với phản ứng có<br /> probe đột biến.<br /> - Thể tích PCR: 50µl.<br /> - Khuếch đại đoạn gen Fibrinogen Beta<br /> (PCR) bằng hệ thống luân nhiệt của máy<br /> Realtime PCR (Bio-Rad CFX96).<br /> - Chu trình luân nhiệt:<br /> + Làm nóng hỗn hợp ở 40°C trong 10 phút,<br /> 95°C trong 5 phút.<br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> + 39 chu kỳ nhiệt: 95°C trong 15 giây/60°C<br /> trong 1 phút/72°C trong 30 giây.<br /> <br /> chất lượng đỉnh được thu thập, kiểm định<br /> <br /> So sánh kết quả Real time PCR với giải<br /> <br /> bằng các phần mềm ABI Data Collection v2.0<br /> và Sequencing Analysis Sotwave v5.3.<br /> <br /> trình tự gen FGB<br /> Gen Fibrinogen Beta được nhân lên bằng<br /> kỹ thuật PCR (sử dụng cặp mồi FGBf3m FGBr4m) với 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5<br /> phút/ 60oC - 30 giây/72oC - 30 giây). Thể tích<br /> phản ứng 50 µl, bao gồm các thành phần:<br /> DNA mẫu, mồi, và các thành phần cho phản<br /> ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP,<br /> MgCl2, dH2O). Sản phẩm PCR được tinh sạch<br /> bằng kit PureLink<br /> <br /> Kết quả giải trình tự gen: các thông số và<br /> <br /> TM<br /> <br /> (Invitrogen). Giải trình tự<br /> <br /> gen Fibrinogen Beta bằng hệ thống ABI sequencer được thực hiện trên máy Applied Biosystems 3.100.<br /> <br /> Trình tự đoạn promoter của gen Fibrinogen<br /> Beta của mẫu bệnh và chứng người Việt Nam<br /> được so sánh với trình tự tham chiếu công bố<br /> trên GenBank thông qua sử dụng phần mềm<br /> phân tích Chromas Lite v2.1.1 và Seaview để<br /> xác định đột biến điểm.<br /> Các số liệu được tổng hợp và tính toán<br /> bằng Word và Excel 2010.<br /> 3. Đạo đức nghiên cứu<br /> Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ<br /> về mục đích nghiên cứu, được cung cấp<br /> thông tin và bệnh nhân đồng ý tự nguyện<br /> <br /> Đối chiếu kết quả phát hiện đột biến -<br /> <br /> tham gia nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu<br /> <br /> 455G/A của gen Fibrinogen Beta bằng kỹ<br /> <br /> được giữ kín bí mật cá nhân và được phản<br /> <br /> thuật realtime PCR với kết quả giải trình tự.<br /> <br /> hồi kết quả nghiên cứu.<br /> <br /> Kết quả phù hợp khi các bệnh nhân có kết<br /> quả Realtime PCR và giải trình tự tương ứng<br /> với nhau.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Thông tin mẫu nghiên cứu<br /> <br /> Phân tích và xử lý số liệu<br /> <br /> Có tổng số 20 bệnh nhân tham gia nghiên<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu gen Fibrinogen Beta<br /> <br /> cứu, trong đó có 14 nam và 6 nữ. Độ tuổi<br /> <br /> trên máy Realtime PCR được phân tích bằng<br /> <br /> trung bình của các bệnh nhân là từ 18 - 56 tuổi.<br /> <br /> phần mềm CFX Manager™Software.<br /> Bảng 2. Tuổi trung bình của các bệnh nhân nghiên cứu<br /> <br /> Chỉ số<br /> <br /> Giới<br /> <br /> Tuổi trung bình chung của các bệnh nhân ( X ± SD)<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 40,86 ± 12,25<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 34,83 ± 9,13<br /> <br /> Cả 2 giới<br /> <br /> 39,00 ± 11,15<br /> <br /> Tuổi trung bình ở những bệnh nhân nghiên cứu là 39,00 ± 11,15 tuổi. Tuổi trung bình ở những<br /> bệnh nhân nam (40,86 ± 12,25 tuổi) lớn hơn bệnh nhân nữ (34,83 ± 9,13 tuổi).<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2. Phát hiện đột biến -455G/A bằng kỹ thuật Realtime PCR<br /> 2.1. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A<br /> Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A<br /> Chỉ số<br /> <br /> n<br /> <br /> Số bệnh nhân có đột biến gen<br /> <br /> Tỷ lệ đột biến/ giới (%)<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 14<br /> <br /> 4<br /> <br /> 28,6<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 6<br /> <br /> 1<br /> <br /> 16,7*<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 20<br /> <br /> 5<br /> <br /> 25<br /> <br /> Giới<br /> <br /> *: Không khác biệt so với nam (p > 0,05).<br /> Có 5 trên tổng số 20 bệnh nhân phát hiện mang đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta,<br /> chiếm 25%, trong đó có 4 nam (80%) và 1 nữ (20%).<br /> Tỷ lệ phát hiện đột biến gen ở nam và nữ có sự khác nhau, tuy nhiên không có ý nghĩa thống<br /> kê (p > 0,05).<br /> 2.2. Hình ảnh Realtime PCR phát hiện đột biến -455G/A<br /> <br /> Hình 1. Kết quả Realtime PCR và giải trình tự ở mẫu không có đột biến và mẫu đột biến<br /> -455G (không đột biến); -455A (đột biến).<br /> Chứng hoặc mẫu đột biến<br /> Chứng âm<br /> Chứng hoặc mẫu không đột biến<br /> <br /> 20<br /> <br /> Chu kì ngưỡng (Ct)<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2.3. Kiểu gen đột biến -455G/A<br /> Bảng 4. Kiểu gen đột biến -455G/A<br /> Kiểu gen<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Đồng hợp tử<br /> <br /> 5<br /> <br /> 100<br /> <br /> Dị hợp tử<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 5<br /> <br /> 100<br /> <br /> Trong số 5 bệnh nhân phát hiện có đột biến -455G/A của gen Fibrinogen Beta, kiểu gen đều là<br /> đồng hợp tử, tức cả hai alen của gen đều bị đột biến, không có trường hợp nào kiểu gen là dị<br /> hợp tử (chỉ có 1 alen bị đột biến).<br /> 2.4. Đối chiếu kết quả Realtime PCR với giải trình tự đột biến -455G/A<br /> So sánh kết quả phân tích đột biến -455G/A của gen FGB ở 20 bệnh nhân bằng kỹ thuật Realtime PCR và kỹ thuật giải trình tự gen, kết quả như sau:<br /> Bảng 5. Sự phù hợp giữa kết quả Realtime PCR<br /> và giải trình tự gen Fibrinogen Beta với đột biến -455G/A<br /> Bệnh nhân<br /> nhồi máu cơ tim<br /> <br /> Phân tích bằng kỹ thuật<br /> Realtime PCR (1)<br /> <br /> Phân tích bằng kỹ<br /> thuật giải trình tự (2)<br /> <br /> Tỷ lệ phù hợp<br /> (1)/(2)<br /> <br /> Đột biến -455G/A<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Không đột biến<br /> <br /> 15<br /> <br /> 15<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 20<br /> <br /> 20<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Kết quả tìm đột biến của 2 phương pháp Realtime PCR và giải trình tự ở các bệnh nhân là<br /> như nhau, tỷ lệ phù hợp là 100%.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> tim trẻ tuổi trong nghiên cứu này là 25%. Theo<br /> Sau khi hoàn chỉnh thành công kỹ thuật<br /> <br /> một nghiên cứu năm 2004, tỉ lệ người mang<br /> <br /> Realtime PCR để phát hiện đột biến -455G/A<br /> <br /> đột biến -455G/A trong nhóm bệnh nhân xơ<br /> <br /> của gen Fibrinogen Beta, nghiên cứu này<br /> <br /> vữa động mạch là 25,8%, cao hơn so với tỉ lệ<br /> <br /> bước đầu ghi nhận và xử lý các số liệu về đột<br /> <br /> 15,2% ở nhóm chứng không mắc bệnh [9].<br /> <br /> biến -455G/A ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim<br /> <br /> Nghiên cứu khác cho thấy, tỉ lệ đột biến -<br /> <br /> trẻ tuổi. Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, tuy<br /> <br /> 455G/A ở 885 nam giới tuổi dưới 70, có tiền<br /> <br /> nhiên đây cũng là mở đầu cho các nghiên cứu<br /> <br /> sử cơn đau thắt ngực là 21%, còn một nghiên<br /> <br /> tiếp theo chi tiết hơn về đột biến này.<br /> <br /> cứu năm 2014, tỉ lệ đột biến này là 35,3% tính<br /> <br /> Tỷ lệ phát hiện đột biến -455G/A trên gen<br /> <br /> trên 486 bệnh nhân có tiền sử đột quỵ [10;<br /> <br /> Fibrinogen Beta ở các bệnh nhân nhồi máu cơ<br /> <br /> 11]. Như vậy có thể thấy, tỉ lệ phát hiện đột<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 21<br /> <br />