PCR & realtime PCR

Chia sẻ: Vo Canh Tung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

419
lượt xem 177
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: PCR (Polymerase Chain Reaction) là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Nguyên tắc của PCR: Giai đoạn biến tính: nhiệt độ được đưa lên 94 độ C, các liên kết hydro của mạch đôi DNA bị mất đi, nhờ đó DNA đích bị biến tính thành 2 mạch đơn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PCR & realtime PCR

PCR & REALTIME PCR ÖÙNG DUÏNG TRONG CHAÅN ÑOAÙN TAÙC NHAÂN NHIEÃM TRUØNG Phaïm Thaùi Bình NGUYEÂN TAÉC CUÛA KYÕ THUAÄT PCR 1
Khaùi nieäm veà PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) laø thöû nghieäm nhaân baûn moät ñoaïn DNA trong oáng nghieäm döïa vaøo caùc chu kyø nhieät. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Lòch söû phaùt minh PCR Taùm naêm sau (1993), Kary Mullis nhaän ñöôïc ½ giaûi Nobel hoùa hoïc. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 2
Nguyeân taéc cuûa PCR Giai ñoaïn bieán tính: nhieät ñoä ñöôïc ñöa leân 94oC, caùc lieân keát hydro cuûa maïch ñoâi DNA bò maát ñi, nhôø ñoù DNA ñích bò bieán tính thaønh 2 maïch ñôn. Giai ñoaïn baét caëp: nhieät ñoä ñöôïc haï xuoáng 55-65oC, caùc ñoaïn moài (primer) tìm ñeán vaø baét caëp boå sung vaøo hai ñaàu cuûa ñoaïn DNA ñích. Giai ñoaïn keùo daøi : nhieät ñoä ñöôïc ñöa leân 72oC, Tag polymerase keùo caùc dNTP laïi ñaàu 3’ cuûa ñoaïn moài ñang baét caëp treân ñaàu 5’ cuûa sôïi DNA ñích vaø toång hôïp maïch boå sung. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Nguyeân taéc cuûa PCR Qua moät chu kyø nhieät, moät DNA ñích ñöôïc nhaân thaønh 2 baûn sao. Neáu chu kyø nhieät laëp laïi lieân tuïc n laàn thì töø moät DNA ñích nhaân baûn ñöôïc 2n baûn sao. 3
YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG ÑEÁN KYÕ THUAÄT PCR DNA ñích Ñoaïn gen ñaëc hieäu cho HBV daøi khoaûng 190bp DNA ñích laø ñoaïn DNA coù trình töï ñaëc hieäu vôùi taùc nhaân nhieãm truøng. Trình töï DNA ñaëc hieäu chæ coù treân boä gen cuûa moät taùc nhaân nhieãm truøng maø khoâng coù treân caùc taùc nhaân nhieãm truøng khaùc hoaëc töø cô theå vaät chuû. DNA ñích coù vai troø laøm khuoân ñeå toång hôïp sôïi DNA boå sung. Boä gen cuûa M. tuberculosis goàm khoaûng 4000 gen. Löôïng DNA ñích cho moät theå tích Trong ñoù coù gen IS6110 phaûn öùng: naèm raõi raùc nhieàu nôi trong – Plasmide: 1pg ® 10ng boä gen vaø ñaëc hieäu cho M. tuberculosis. Ñoaïn gen – Genome: 50 ® 500ng chuyeân bieät cho IS6110 coù ñoä daøi khoaûng 249bp. 4
PCR mix Thaønh phaàn cuûa PCR mix: – Moài – Taq polymerase – dNTP – MgCl2 – PCR buffer Moài (primer) ð Moài laø moät ñoaïn oligonucleotide daøi khoaûng 20-30 bases vaø coù trình töï boå sung vôùi hai ñaàu cuûa trình töï DNA ñích. ð Moài phaûi ñaëc hieäu, ñaëc tröng cho trình töï DNA ñích, moät moài chæ baùm vaøo moät vò trí nhaát ñònh treân gen. ð Ñeå moài coù theå baét caëp moät caùch hoaøn toaøn ñaëc hieäu treân sôïi khuoân cuûa trình töï DNA ñích: – Nhieät ñoä baét caëp (Ta) phaûi toái öu vaø thöôøng Ta thaáp hôn nhieät ñoä chaûy (Tm) cuûa moài khoaûng 5-10oC. – Tm cuûa moài xuoâi vaø moài ngöôïc khoâng khaùc bieät quaù lôùn. – Tm cuûa moài phuï thuoäc vaøo chieàu daøi cuûa moài vaø tyû leä G vaø C trong thaønh phaàn cuûa moài: Tm (oC) = 2 (A+T) + 4 (C+G) – Traùnh trình töï boå sung giöõa moâi xuoâi vaø moài ngöôïc. – Nucleotide (3 nucleotide hoaëc nhieàu hôn) ôû ñaàu 3’ cuûa moài neân laø G hoaëc C do söï Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà polymer hoùa toát hôn. cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Hoà Huyønh Thuøy Döông. 2002. Phöông phaùp PCR. Sinh hoïc – Khoaûng caùch toái öu giöõa 2 moài khi baùm vaøo phaân töû. NXB Giaùo duïc. Tr. 190-198. DNA khuoân laø 150-500bp. PCR Guidelines and Optimization. www.stratagene.com 5
Moài (primer) ð Moài ñöôïc thieát keá baèng phaàn meàm chuyeân duïng (Primer Premier) döïa treân: – Trình töï DNA ñích. – Thoâng soá ñöôïc löïa choïn: chieàu daøi moài, Ta cuûa moài, chieàu daøi saûn phaåm khueách ñaïi. ð Noàng ñoä moài cho 1 theå tích phaûn öùng: – Moài xuoâi (forward primer): 10 ® 50pm. – Moãi ngöôïc (reverse primer):10 ® 50pm. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Taq polymerase ð DNA Polymerase xuùc taùc cho söï toång hôïp DNA theo chieàu töø 5’-3’. ð DNA Polymerase nhaän dieän ñöôïc nucleotide ôû ñaàu 3’cuûa moài baét caëp vôùi nucleotide ôû sôïi khuoân neân tröôït ñöôïc treân sôïi khuoân ñeå toång hôïp sôïi boå sung. ð Tag DNA polymerase (Taq polymerase) laø enzyme polymerase chòu nhieät , laàn ñaàu tieân ñöôïc taùch chieát töø vi khuaån Thermus aquaticus (phaân laäp töø buøn ñaát ôû caùc suoái nöôùc noùng taïi Myõ). ð Noàng ñoä Taq polymerase cho 1 theå tích phaûn öùng coù theå töø 1.25 ® 2.5 UI (tuøy vaøo nhaø saûn xuaát). Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 6
dNTP dNTP (Deoxyribonucleotide triphosphate) goàm 04 loaïi: – dATP (Deoxyadenosine triphosphate) – dCTP (Deoxycytidine triphosphate) – dGTP (Deoxyguanosine triphosphate) – dTTP (Deoxythymidine triphosphate) Nguyeân lieäu ñeå toång hôïp sôïi boå sung. Noàng ñoä dNTP toái öu cho moät theå tích phaûn öùng 200µM/loaïi. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Mg2+ Mg2+ (MgCl2 hoaëc MgSO4) coù vai troø laø cofactor cho hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase. Noàng ñoä Mg2+ laø yeáu toá aûnh höôûng maïnh ñeán phaûn öùng PCR vaø tuøy thuoäc vaøo töøng phaûn öùng (loaïi Taq polymerase, loaïi DNA ñích, thaønh phaàn buffer…). – Noàng ñoä Mg2+ cao: coù theå laøm xuaát hieän caùc saûn phaåm PCR khoâng ñaëc hieäu. – Noàng ñoä Mg2+ thaáp laøm giaûm löôïng saûn phaåm PCR. Noàng ñoä Mg2+ coù theå töø 1.5 ® 5mM. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Hoà Huyønh Thuøy Döông. 2002. Phöông phaùp PCR. Sinh hoïc phaân töû. NXB Giaùo duïc. Tr. 190-198. PCR Guidelines and Optimization. www.stratagene.com 7
PCR buffer (dung dòch ñeäm) Thaønh phaàn cuûa PCR buffer 10X: – Tris HCl 100mM (pH 8.3) – KCl 500mM Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Soá chu kyø PCR Treân thöïc teá soá löôïng chu kyø cho moät phaûn öùng PCR khoâng neân quaù 40 chu kyø. Nguyeân nhaân trong giai ñoaïn ñaàu soá löôïng baûn sao taêng theo caáp soá nhaân tyû leä vôùi löôïng DNA ñích ban ñaàu nhöng soá ñoù hieäu quaû khueách ñaïi giaûm: – Söï phaân huûy vaø caïn kieät caùc thaønh phaàn phaûn öùng. – Söï xuaát hieän caùc saûn phaåm phuï öùc cheá phaûn öùng. – Caùc baûn sao vöøa ñöôïc toång hôïp khoâng keát hôïp vôùi moài nöõa maø baét caëp vôùi nhau. Soá chu kyø cuûa phaûn öùng PCR tuøy thuoäc vaøo soá löôïng maãu ban ñaàu. Hoà Huyønh Thuøy Döông. 2002. Phöông phaùp PCR. Sinh hoïc phaân töû. NXB Giaùo duïc. Tr. 190-198. 8
Thieát bò PCR Maùy luaân nhieät (maùy chu kyø nhieät, maùy PCR) laø caùc maùy taïo ra chu kyø nhieät vôùi buoàng uû nhieät coù nhieät ñoä leân xuoáng chính xaùc vaø ñoàng nhaát , toác ñoä gia giaûm nhieät cöïc nhanh theo chu kyø. MOÄT SOÁ KYÕ THUAÄT PCR THÖÔØNG GAËP 9
PCR ñôn moài (monoplex PCR) PCR chæ söû duïng moät caëp moài ñaëc hieäu ñeå khueách ñaïi moät ñoaïn DNA ñích töø moät vi sinh vaät muoán phaùt hieän. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. PCR ña moài (multiplex PCR) PCR söû duïng nhieàu caëp moài ñaëc hieäu cho caùc ñoaïn DNA ñích töø nhieàu vi sinh vaät khaùc muoán phaùt hieän ñoàng thôøi. Multiplex PCR: – Thieát keá caùc caëp moài coù cuøng Ta leân DNA ñích nhöng ñoàng thôøi caùc moài naøy phaûi khoâng ñöôïc baét caëp vôùi nhau. – Ñoä nhaïy phat hieän töøng taùc nhaân ñích khoâng bò giaûm maø phaûi töông ñöông vôùi PCR ñôn moài. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 10
PCR toå (nested PCR) Nested PCR goàm 2 giai ñoaïn: – Giai ñoaïn 1 laø PCR duøng moät caëp moài ngoaøi (PCR voøng ngoaøi) ñeå khueách ñaïi moät ñoaïn DNA coù chöùa trình töï ñaëc hieäu muoán phaùt hieän. – Giai ñoaïn 2 laø PCR duøng caëp moài voøng trong (PCR voøng trong) vôùi saûn phaåm PCR voøng ngoaøi laøm khuoân ñeå khueách ñaïi trình töï ñaëc hieäu muoán phaùt hieän. Semi-nested PCR (hemi-nested PCR) laø bieán theå cuûa Nested PCR vôùi moät moài voøng ngoaøi ñöôïc duøng laø moät trong hai moài cuûa voøng trong. Nested PCR: – Taêng ñoä nhaïy cuûa PCR khi maø moài cho trình töï DNA ñaëc hieäu muoán phaùt hieän coù ñoä nhaïy thaáp. – Nguy cô ngoaïi nhieãm cao do phaûi môû naép tube PCR voøng trong ñeå cho PCR voøng ngoaøi vaøo. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. PCR toå khoâng döøng (non-stop nested PCR) Laø Nested PCR nhöng caû hai giai ñoaïn PCR voøng ngoaøi vaø PCR voøng trong ñeàu ñöôïc thöïc hieän cuøng trong moät tube PCR. Sau khi hoaøn taát chöông trình luaân nhieät PCR voøng ngoaøi thì tieáp tuïc chöông trình luaân nhieät PCR voøng trong. Non-stop Nested PCR: – Ta cuûa moài voøng ngoaøi cao hôn Ta cuûa moài voøng trong 8®10oC. Ñeå khi chaïy chöông trình cuûa PCR voøng ngoaøi khoâng coù söï baét caëp cuûa moài voøng trong leân DNA ñích. – Toái öu tyû leä moài voøng ngoaøi ñeå sau khi chaïy chöông trình PCR voøng trong seõ khoâng coøn moài voøng ngoaøi tieáp tuïc baét caëp leân DNA ñích. – Coù ñoä nhaïy cao vaø haïn cheá ñöôïc ngoaïi nhieãm. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 11
Touch-down PCR 20 chu kyø: 10 chu kyø: Laø PCR coù chöông trình luaân nhieät vôùi nhieät ñoä baét 94oC/15 giaây 94oC/15 giaây 65oC/15 giaây 65oC/15 giaây caëp giaûm daàn trong 10® 20 chu kyø ñaàu, ñeå ñaït giaûm 0.5oC sau ñeán nhieät ñoä baét caëp thích hôïp nhaát cuûa moài: moãi chu kyø – Cöù sau moãi chu kyø giaûm 0.5®10oC; hoaëc 10 chu kyø: – Qua hai böôùc giaûm nhieät ñoä, moãi böôùc giaûm 5oC. 94oC/15 giaây 35 chu kyø: 60oC/15 giaây Trong 10® 20 chu kyø coù nhieät ñoä baét caëp giaûm 94oC/15 giaây daàn, chöông trình luaân nhieät chæ coù hai böôùc bieán 55oC/30 giaây tính vaø baét caëp, khoâng coù keùo daøi. 72oC/1 phuùt 35 chu kyø: Touch-down PCR: 94oC/15 giaây – Laøm taêng ñoä ñaëc hieäu cuûa moài khi baét caëp vaøo DNA 55oC/30 giaây ñích, khi nhieät ñoä baét caëp giaûm daàn laøm moài ñöôïc 1chu kyø: 72oC/1 phuùt ñöa ñeán gaàn vò trí boå sung nhaát treân DNA ñích, traùnh 72oC/7 phuùt moài baét caëp vaøo vò trí khoâng ñaëc hieäu. – Söû duïng khi saûn phaåm khueách ñaïi khoâng ñaëc hieäu 1chu kyø: (treân gel ñieän di coù nhieàu vaïch phuï). 72oC/7 phuùt Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. RT-PCR (Reverse transcription PCR) Laø phöông phaùp PCR phaùt hieän nucleic acid laø RNA. RT PCR: – RNA ñích ñöôïc phieân maõ ngöôïc (RT, Reverse transcription) thaønh cDNA. – PCR khueách ñaïi trình töï ñích trong cDNA baèng caëp moài ñaëc hieäu. Phöông phaùp thöïc hieän RT PCR: – RT PCR hai böôùc: toång hôïp cDNA trong moät oáng nghieäm, sau ñoù laáy saûn phaåm cDNA cho vaøo oáng nghieäm khaùc coù chöùa PCR mix vôùi moài ñaëc hieäu ñeå khueách ñaïi trình töï DNA ñích muoán phaùt hieän. – RT PCR moät böôùc: giai ñoaïn RT vaø giai ñoaïn PCR cuøng thöïc hieän trong moät oáng nghieäm. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 12
RT-PCR (Reverse transcription PCR) Kyõ thuaät RT Enzyme phieân maõ ngöôïc laø Reverse transcriptase, laø moät DNA polymerase khoâng chòu nhieät, söû duïng maïch ñôn RNA laøm sôïi khuoân ñeå toång hôïp sôïi DNA boå sung (cDNA) Thaønh phaàn cuûa RT: – Enzyme Reverse transcriptase – Mg2+ – dNTP – Reverse transcription buffer – RNAae H caét boû RNA bò baét caëp vaøo cDNA. – Moài Moài trong RT: – Moài ñaëc hieäu: Duøng cho ñoaïn cDNA coù ñoä daøi treân 600bp. – Moài ngaãu nhieân (random hexamer): chæ coù 6 nucleotide coù thöù töï ngaãu nhieân ñeå phieân maõ ngöôïc toaøn boä RNA coù trong maãu thaønh cDNA. Duøng cho ñoaïn cDNA coù ñoä daøi döôùi 600bp. – Moài poly T (Oligo dT): do mRNA luoân coù ñuoâi laø poly A. Duøng laøm thö vieän cDNA cuûa bieåu hieän gen hoaëc phaùt hieän vi khuaån soáng trong beänh phaåm. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. QUY TRÌNH KYÕ THUAÄT PCR & RT PCR 13
Quy trình kyõ thuaät PCR Ly trích DNA töø DNA ñöôïc cho vaøo PCR mix vaø Beänh phaåm beänh phaåm chaïy chöông trình chu kyø nhieät. Phaùt hieän saûn phaåm khueách ñaïi Kyõ thuaät ly trích DNA baèng phöông phaùp BOOM L6 900µL Silica 30µL Maãu thöû 100µL Vortex vaø laéc ngang 100RPM/10 phuùt. ÖÙng duïng: ly trích DNA töø caùc maãu beänh phaåm Ly taâm 13000RPM/15 giaây. khoâng quaù nhieàu DNA cuûa vaät chuû (ñaøm ñaõ Laáy phaàn caën. loaïi tröø taïp nhieãm, huyeát thanh, dòch tieát). L2 1mL Vorter vaøi giaây Nguyeân taéc: duøng Guanidine thiocyanate ñeå Ly taâm13000RPM/15 giaây. Laáy phaàn caën. phaù huûy hoaït tính caùc nuclease, caùc DNA Laëp laïi 1 laàn töông töï. baùm vaøo haït silica vaø nhôø ñoù taùch chieát ñöôïc DNA töø maãu thöû. Ethanol 1mL Thaønh phaàn thuoác thöû: Vorter vaøi giaây Ly taâm13000RPM/15 giaây. Laáy phaàn caën. – Silica Laëp laïi 1 laàn töông töï. – L6 (Guanidine thiocyanate, EDTA, Triton X100, Tris HCl) Aceton 1mL – L2 (Guanidine thiocyanate, Tris HCl) Vorter vaøi giaây Ly taâm13000RPM/15 giaây. Laáy phaàn caën. – Ethanol 70% Laøm khoâ 56oC. – Aceton 100% – TE 1X (EDTA, Tris HCl) TE 1X 100µL UÛ 56oC/10 phuùt. Ly taâm13000RPM/2 phuùt. Laáy 80µL phaàn dòch Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 14
Kyõ thuaät ly trích DNA baèng Phenol Chloroform Maãu thöû 180µL (neáu moâ hoaëc sinh thieát laáy maõnh nhoû cho vaøo 180µL TE 1X; neáu chaát dòch laáy 180µL) Prokprep 20µL ÖÙng duïng: ly trích DNA töø caùc maãu beänh phaåm coù chöùa nhieàu DNA cuûa vaät chuû (sinh thieát, moâ Troän ñeàu vaø uû 60oC/ON. Vortex Theâm vaøo 200µL TE 1X (hoaëc nöôùc caát) cho ñuû 400µL nghieàn, dòch tieát). beänh phaåm Nguyeân taéc: maãu thöû khi troän vôùi Phenol/Chloroform/Isoamyl Acohol (P/C/I) theo P/C/I 400µL tyû leä 25:24:1, caùc protein bò phenol laøm bieán tính Vorter 10 giaây vaø voùn cuïc laïi . Khi ly taâm coù söï hieän dieän cuûa Ly taâm13000RPM/2 phuùt. Huùt laáy phaàn choloroform caùc voùn cuïc taùch ra vaø taäp trung nöôùc ôû treân cho vaøo moät tube môùi. giöõa pha nöôùc vaø pha P/C/I. Pha nöôùc coù chöùa DNA, DNA ñöôïc laøm tuûa bôûi ethanol ôû noàng ñoä Sodium acetate 3M 40µL muoái cao. Troän ñeàu Ethanol 100%, laïnh 1000µL Thaønh phaàn thuoác thöû: Giöõ tube -20oC/30 phuùt hoaëc 70oC/15 phuùt. – Phenol, chloroform, isoamyl alcohoh 25:24:1 (P/C/I). Ly taâm13000RPM/5 phuùt. Huùt boû phaàn dòch noåi. – Sodium acetate 3M, pH 5.2 – L2 (Guanidine thiocyanate, Tris HCl) – Ethanol 100% Ethanol 70% 1mL – Ethanol 70% UÙp ngöõa vaøi laàn. Ly taâm13000RPM/5 phuùt. – TE 1X (EDTA, Tris HCl) Huùt boû phaàn dòch noåi, laøm khoâ caën. Hoøa tan caën trong 50®100µL TE 1X – Proteinase K, Triton X100, Tris HCl (Prokprep) Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Quy trình kyõ thuaät RT PCR cDNA ñöôïc cho vaøo PCR Ly trích RNA töø RT ñeå chuyeån mix vaø chaïy chöông trình Beänh phaåm beänh phaåm RNA thaønh cDNA chu kyø nhieät. Phaùt hieän saûn phaåm khueách ñaïi 15
Kyõ thuaät ly trích RNA toaøn phaàn Neáu maãu moâ laáy 10mg cho vaø tube, nghieàn vôùi 200µL nöôùc caát. Ly taâm 13000RPM/30 giaây vaø huùt laáy 100µL phaàn dòch noåi laøm maãu thöû. ÖÙng duïng: taùch chieát thoâ RNA toaøn Maãu thöû 100µL phaàn treân caùc maãu thöû. R1 300µL Huùt pipet leân xuoáng nhieàu laàn. UÛ 30oC/10 phuùt. Nguyeân taéc: duøng Guanidine 14M vaø R2 80µL ure phoái hôïp vôùi phenol vaø caùc chaát Laéc nhanh trong 15 giaây. UÛ 30oC/10 phuùt. taåy khaùc laøm bieán tính protein. Keát Ly taâm laïnh 13000RPM/ 15 phuùt. Huùt laáy phaàn dòch noåi. quaû protein bò voùn laïi , DNA tan trong pha phenol, RNA tan trong pha nöôùc ñöôïc taùch vôùi pha phenol nhôø theâm Dòch noåi 200µL vaøo chloroform vaø ly taâm. RNA ñöôïc R3 200µL laøm tuûa nhôø isopropanol. Troän ñeàu. Giöõ tube 30 C/10 phuùt. o Thaønh phaàn thuoác thöû: Ly taâm laïnh 13000RPM/15 phuùt. Huùt boû phaàn dòch noåi. – R1: Guanidine, Urea, Phenol, chaát taåy. – R2: Chloroform. – R3: Isopropanol. R4 700µL – R4: Ethanol 75%. UÙp ngöõa vaøi laàn. Ly taâm laïnh 13000RPM/5 phuùt. – R5: Nöôùc tinh saïch. Huùt boû phaàn dòch noåi, laøm khoâ caën. Hoøa tan caën trong 30µL R5. Giöõ tube 55®60oC/10 phuùt. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Kyõ thuaät loaïi tröø ngoaïi nhieãm saûn phaåm khueách ñaïi (PCR carry-over) DNA ñích luoân PCR vôùi PCR mix coù dUTP & UNG dUTP (Deoxyuracil triphosphate) coù chöùa T Saûn phaåm khueách ñaïi coù T ñöôïc thay theá baèng U vaø UNG (Uracil DNA glycosilase) cho theâm vaøo PCR mix ñeå loaïi tröø ngoaïi nhieãm. Saûn phaåm khueách ñaïi ngoaïi nhieãm coù chöùa U – Saûn phaåm khueách ñaïi töø DNA ñích DNA ñích luoân coù chöùa T ñöôïc thay theá baèng U coù chöùa T taïi nhieàu vò trí. 40oC/ 10’ PCR vôùi PCR mix – Neáu saûn phaåm khueách ñaïi ngoaïi coù dUTP & UNG nhieãm vaøo PCR mix môùi thì seõ bò UNG phaù huûy vì UNG nhaän dieän Saûn phaåm khueách ñaïi ngoaïi nhieãm ñöôïc U vaø caét boû U. bò phaù huûy do UNG caét boû U. DNA ñích khoâng – UNG bò baát hoaït ôû giai ñoaïn bieán bò UNG phaù huûy tính cuûa PCR. tham gia vaøo PCR – Saûn phaåm khueách ñaïi töø DNA ñích 30X-40X taïi nhieàu vò trí bò thay theá bôûi U. 94oC/30’’-1’ PCR vôùi PCR mix coù dUTP & UNG. 55-60oC/30’’-1’ UNG bò baát hoaït ôû giai ñoaïn bieán Haøm löôïng dUTP vaø UNG trong 72oC/30’’-1’ tính (94oC) PCR mix : – dUTP: 200µM – UNG: 0.1 ® 1U Saûn phaåm khueách ñaïi coù T Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà laïi ñöôïc thay theá baèng U cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 16
KYÕ THUAÄT REAL TIME PCR Khaùi nieäm veà Realtime PCR Kyõ thuaät PCR maø keát quaû khueách ñaïi DNA ñích hieån thò ngay moãi chu kyø nhieät cuûa phaûn öùng. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 17
Thieát bò Realtime PCR Thieát bò Realtime: – Coù nguoàn saùng phaùt ra tia saùng kích thích vôùi böôùc soùng xaùc ñònh leân caùc tube phaøn öùng. – Coù ñöôïc camera hoaëc caûm bieán quang ghi nhaän aùnh saùng huyønh quang phaùt ra töø caùc tube phaûn öùng khi caùc tube ñöôïc chieáu tia saùng kích thích. Thieát bò PCR (maùy chu kyø nhieät) Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Thieát bò Realtime duøng ñeøn Tungsten Thieát bò Realtime söû duïng nguoàn saùng kích thích laø ñeøn tungsten vaø duøng caùc kính loïc ñeå chieáu aùnh saùng coù ñoä daøi böôùc soùng nhaát ñònh leân caùc tube phaûn öùng. Thieát bò Realtime PCR: – IQ, My IQ, IQ5 (Biorad) Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 18
Thieát bò Realtime duøng sôïi quang hoïc Thieát bò Realtime söû duïng sôïi quang hoïc ñeå ñöa nguoàn saùng kích thích ñeán caùc tube phaûn öùng. Thieát bò Realtime PCR cuûa haõng ABI Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Thieát bò Realtime duøng ñeøn LED Thieát bò Realtime söû duïng ñeøn LED laøm nguoàn saùng kích thích. Thieát bò Realtime PCR – CFX (Biorad) – Light-cycler (Roche) – Rotor Gene (Corbett Research) Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 19
Realtime PCR mix Thaønh phaàn cuûa Realtime PCR mix: – Moài – Taq polymerase – dNTP – MgCl2 – PCR buffer – Chaát phaùt huyønh quang Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. Chaát phaùt huyønh quang Khi chieáu nguoàn saùng kích thích vaøo tube phaûn öùng, chaát phaùt huyønh quang: – Phaùt huyønh quang khi coù hieän dieän cuûa saûn phaåm khueách ñaïi töø DNA ñích. – Khoâng phaùt huyønh quang khi khoâng coù hieän dieän cuûa saûn phaåm khueách ñaïi töø DNA ñích. Moät soá chaát phaùt huyønh quang thöôøng duøng: – Maøu huyønh quang cheøn vaøo sôïi ñoâi DNA (SYBR I): + Maøu huyønh quang coù aùi löïc raát cao khi coù hieän dieän cuûa sôïi ñoâi DNA. + AÙi löïc naøy laø do khaû naêng cheøn maøu vaøo sôïi ñoâi DNA vaø laøm cho sôïi ñoâi DNA phaùt ra ñöôïc aùnh saùng huyønh quang khi nhaän ñöôïc nguoàn saùng kích thích. – Probe (Tagman probe, Beacon probe): + Moät ñoaïn oligonucleotide sôïi ñôn coù trình töï baét caëp boå sung vôùi saûn phaåm khueách ñaïi töø DNA ñích. + Khi coù saûn phaån khueách ñaïi ñaëc hieäu, thì coù söï baét caëp cuûa probe leân saûn phaåm khueách ñaïi vaø laøm phaùt huyønh quang khi nhaän ñöôïc nguoàn saùng kích thích. Phaïm Huøng Vaân. 2008. PCR vaø Realtime PCR, caùc vaán ñeà cô baûn vaø caùc aùp duïng thöôøng gaëp. NXB Y hoïc. 20