Ứng dụng RT-PCR để chẩn đoán sớm virus dengue ở bệnh nhi sốt xuất huyết tại Cần Thơ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 12 * Phụ bản của Số 4 * 2008<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ỨNG DỤNG RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN SỚM VIRUS DENGUE<br /> Ở BỆNH NHI SỐT XUẤT HUYẾT TẠI CẦN THƠ<br /> Phạm Hùng Lực*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Vấn đề chẩn đoán sốt xuất huyết trong thời kỳ đầu của bệnh là khó, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi<br /> hỏi cận lâm sàng như Mac-ELISA, kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription–polymerase chain reaction) sẽ chẩn<br /> đoán nhanh, nhạy và đặc hiệu SXH-D, phân loại vi-rút dengue.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính xác vi-rút dengue trong máu<br /> bệnh nhi sốt xuất huyết giúp bác sĩ lâm sàng xác định sớm SXH-D.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Đây là một nghiên cứu áp dụng kỷ thuật RT-PCR để xác định virus Dengue<br /> trong máu bệnh nhi đang bị bệnh sốt xuất huyết dengue trong vòng 3 ngày đầu tiên mắc bệnh. 30 ca trẻ bệnh Sốt<br /> xuất huyết Dengue đang nằm theo dõi điều trị trong bệnh viện Nhi đồng Cần thơ đã được chọn v ào nghiên cứu,<br /> năm 2006. Số liệu được phân tích bởi chương trình SPSS để đo lường xác xuất các biến số.<br /> Kết quả nghiên cứu: đã chỉ rõ Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80% virus sốt xuất huyết trong<br /> vòng 3 ngày đầu mắc bệnh sốt xuất huyết.<br /> - RT-PCR có thể định rõ các typ virus DenI, DenII, DenIII tại Cần Thơ trong năm 2006.<br /> - RT-PCR có giá trị chẩn đoán nhanh và chính xác Virus Dengue trong sốt xuất huyết.<br /> Kết luận: Kỷ thuật RT-PCR có khả năng xác định 80% virus sốt xuất huyết trong vòng 3 ngày đầu mắc<br /> bệnh sốt xuất huyết.Do đó có thể dùng phổ cập trên lâm sàng.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> USING RT-PCR TEST TO IDENTIFY DENGUE VIRUS IN CHILDREN OF CASES DENGUE<br /> HEMORRHAGIC FEVER DURING EARLY DAYS IN CANTHO<br /> Pham Hung Luc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 12 - Supplement of No 4 - 2008: 263 - 267<br /> Background: The diagnosis of Dengue fever during early days is dificulty, clinical symtoms are not clear, It<br /> is required doing some specicial tests to confirm virus Dengue. As Elisa test,RT-PCR test are necessary.<br /> Objective: To use RT-PCR test to identify Dengue virus in the blood of patients.<br /> Method: This study is applied RT-PCR technic to identify virus Dengue in blood of the cases Dengue<br /> hemorrhagic fever durring the first 3 day of disease. 30 children of cases Dengue hemorrhagic fever in the<br /> Children hospital of Cantho to be selected in research, in the year 2006. Data was analized by SPSS pragramme to<br /> measure the frequency of variables.<br /> Rresult: This study was showed that RT-PCR technic is capable to determine 80% of cases Dengue Fever<br /> Virus durring the first 3 day of disease.<br /> - RT-PCR can identify Dengue type I, type II, Type III at Cantho in the year 2006.<br /> - RT-PCR is a value test to diagnosis Virus Dengue in case of hemorrhagic fever dengue.<br /> aegypti(6,16,26). Theo báo cáo năm 1999 của Bộ Y tế,<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> SXH-D ở nước ta có tỷ lệ chết/mắc trung bình là<br /> Sốt xuất huyết Dengue (SXH-D) do vi-rút<br /> 0,23%. Bệnh có nhiều thể lâm sàng, thể nhẹ có<br /> dengue thuộc 4 týp (DEN-1, DEN-2, DEN-3 và<br /> sốt phát ban đến thể nặng có xuất huyết dễ dẫn<br /> DEN-4) và lây truyền qua muỗi Aedes<br /> *Trường Đại học Y Dược Cần Thơ<br /> <br /> 262<br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng và Y Học Dự Phòng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 12 * Phụ bản của Số 4 * 2008<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> đến tử vong nếu không được xử trí tích cực kịp<br /> thời.<br /> <br /> tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới trong việc chẩn<br /> đoán sớm bệnh sốt xuất huyết.<br /> <br /> Về điều trị, chủ yếu là bồi hoàn dịch một<br /> cách thận trọng, đủ và đúng. Vì vậy, việc chẩn<br /> đoán sớm và nhanh có ý nghĩa rất lớn với kết<br /> quả điều trị và diễn tiến của bệnh. Vấn đề là<br /> những ngày đầu của bệnh khó chẩn đoán là do<br /> sốt xuất huyết, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi<br /> cận lâm sàng như Mac-ELISA, sắc ký miễn dịch,<br /> kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription–<br /> polymerase chain reaction) sẽ chẩn đoán nhanh,<br /> nhạy và đặc hiệu SXH-D, có khả năng phân loại<br /> vi-rút dengue. Nghiên cứu này ứng dụng kỹ<br /> thuật RT-PCR phát hiện sớm và chính xác vi-rút<br /> dengue trong máu bệnh nhi sốt xuất huyết giúp<br /> bác sĩ lâm sàng xác định sớm SXH-D.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> 1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để phát hiện<br /> sớm vi-rút dengue ở bệnh nhi sốt xuất.<br /> 2. Xác định týp vi-rút dengue bằng kỹ thuật<br /> RT-PCR.<br /> 3. Xác định giá trị của RT-PCR với xét<br /> nghiệm chẩn đoán nhanh và chẩn đoán dựa theo<br /> <br /> Các bệnh nhi theo dõi SXH-D vào điều trị tại<br /> khoa Sốt xuất huyết Bệnh viện Nhi đồng Cần<br /> Thơ từ 01/10/2006 đến 31/12/2006.<br /> * Tiêu chuẩn chọn bệnh: Tuổi ≤ 15h, Sốt cao<br /> ( ≥ 390C) từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 của bệnh<br /> không có tiêu điểm nhiễm trùng. Có dấu dây<br /> thắt dương tính hoặc biểu hiện những dấu xuất<br /> huyết.<br /> * Tiêu chuẩn loại trừ: + Những bệnh nhi mắc<br /> các bệnh khác như xuất huyết giảm tiểu cầu,<br /> thiếu máu tán, huyết tự miễn, viêm đa khớp<br /> dạng thấp, lupus, suy tủy, leucemie,<br /> hemophilie,..<br /> + Sốt ≥ 4 ngày kèm hay không kèm dấu xuất<br /> huyết.<br /> Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Tuy nhiên do<br /> kinh phí có hạn không cho phép nghiên cứu<br /> mẫu lớn cho nên chúng tôi chọn cỡ mẫu 30 là cỡ<br /> mẫu nhỏ nhất nhưng vẫn đáp ứng được độ tin<br /> cậy trong thống kê số liệu.<br /> <br /> Bệnh nhi theo dõi SXH-D<br /> <br /> Rút máu<br /> Công thức máu:<br /> - Hematocrite<br /> - Tiểu cầu<br /> - Bạch cầu<br /> - Công thức bạch cầu<br /> <br /> Trích huyết thanh<br /> <br /> Kỹ thuật RT-PCR<br /> (ngay sau nhập viện)<br /> <br /> Phân loại vi-rút<br /> Dengue<br /> <br /> Test nhanh<br /> (ngày 5 của bệnh)<br /> <br /> Chẩn đoán SXHD<br /> Thu thập số liệu<br /> <br /> Sơ đồ nghiên cứu:<br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng và Y Học Dự Phòng<br /> <br /> Xử lý số liệu<br /> <br /> 263<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 12 * Phụ bản của Số 4 * 2008<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Phương pháp thu thập số liệu<br /> Tất cả bệnh nhi đúng với tiêu chuẩn chọn bệnh được đưa vào nhóm nghiên cứu, sẽ<br /> được khám và làm các xét nghiệm, theo dõi diễn tiến bệnh cho đến khi ra viện hay tử vong<br /> và được thu thập số liệu theo bộ thu thập số liệu soạn sẵn ở phần phụ lục.<br /> Các xét nghiệm được thực hiện trên mỗi bệnh nhi:<br /> + Công thức máu: Hematocrite, tiểu cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu.<br /> + Xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết.<br /> + Kỹ thuật RT-PCR.<br /> <br /> Phân tích số liệu<br /> Nhập và phân tích số liệu theo phần mềm SPSS 12.0. Từ đó tính tỷ lệ các bảng phân phối<br /> tần suất hay vẽ biểu đồ. Dùng phép kiểm định χ 2 hoặc phép kiểm định Fisher’s Exact Test ở<br /> bảng 2×2. Phân tích, so sánh, diễn giải kết quả.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Từ ngày 01 tháng 10 năm 2006 đến ngày 31 tháng 12 năm 2006, chọn được 30 bệnh nhi<br /> đạt điều kiện chọn mẫu, qua theo dõi không có trường hợp nào tử vong.<br /> Bảng 1: Phân bố mẫu nghiên cứu theo tuổi và giới<br /> Nhóm tuổi<br /> < 7 tuổi<br /> 7-11 tuổi<br /> 12-15 tuổi<br /> Tổng số<br /> <br /> Nam %<br /> 3(10)<br /> 4(13,3)<br /> 8(26,7)<br /> 15<br /> <br /> Nữ %<br /> 1(3,3)<br /> 8(26,7)<br /> 6(20)<br /> 15<br /> <br /> n (%)<br /> 4(13,3)<br /> 12(40)<br /> 14(46,7)<br /> 30<br /> <br /> Nhận xét: Trong 30 mẫu nghiên cứu có 15 nam (50%) và 15 nữ (50%).<br /> Nhóm tuổi 12 - 15 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (46,7%).<br /> Bảng 2: Phân bố mẫu nghiên cứu theo giới và địa dư<br /> Địa dư<br /> Cần Thơ<br /> Hậu Giang<br /> Vĩnh Long<br /> Tổng số<br /> <br /> Nam(%)<br /> 7(23,3)<br /> 5(16,7)<br /> 3(10)<br /> 15<br /> <br /> Nữ(%)<br /> 6(20)<br /> 6(20)<br /> 3(10)<br /> 15<br /> <br /> n(%)<br /> 13(43,3)<br /> 11(36,7)<br /> 6(20)<br /> 30<br /> <br /> Nhận xét: Ca bệnh ở Cần Thơ chiếm tỷ lệ cao nhất 43,3%, nam 23,3%, nữ 20%.<br /> <br /> Kết quả RT-PCR<br /> Bảng 3: Kết quả RT-PCR<br /> RT-PCR (%)<br /> Dương tính<br /> <br /> 24 (80)<br /> <br /> Âm tính<br /> <br /> 06(20)<br /> <br /> Tổng số<br /> <br /> 30(100)<br /> <br /> Nhận xét: Kết quả RT-PCR có 24/30 mẫu huyết thanh dương tính (80%).<br /> Bảng 4: Kết quả RT-PCR phát hiện vi-rút dengue theo số ngày sốt<br /> Số ngày sốt Dengue (+) (%) Dengue (-) (%)<br /> Ngày 1<br /> 1(3,3)<br /> 0<br /> Ngày 2<br /> 8(26,7)<br /> 0<br /> Ngày 3<br /> 15(50)<br /> 6(20)<br /> <br /> n (%)<br /> 1(3,3)<br /> 8(26,7)<br /> 21(70)<br /> <br /> 264<br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng và Y Học Dự Phòng<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 12 * Phụ bản của Số 4 * 2008<br /> Tổng số<br /> <br /> 24<br /> <br /> 6<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 30<br /> <br /> Nhận xét: Có 15 mẫu nghiên cứu có kết quả RT-PCR dương tính vào ngày thứ 3 của bệnh (50%), 8<br /> mẫu nghiên cứu dương tính ở ngày thứ 2 của bệnh (26,7%), có 1 trường hợp cho kết quả dương tính<br /> vào ngày đầu tiên của bệnh (3,3%).<br /> Bảng 5: Kết quả RT-PCR phát hiện vi-rút dengue theo tuổi và giới của bệnh nhi<br /> Nam<br /> Dengue Dengue<br /> (+)<br /> (-)<br /> < 7 tuổi<br /> 3<br /> 0<br /> Nhóm<br /> tuổi<br /> <br /> 7-11tuổi<br /> 12-15 tuổi<br /> Tổng số<br /> <br /> 3<br /> 6<br /> 12<br /> <br /> Nữ<br /> Tổng số<br /> Dengue Dengue<br /> (+)<br /> (-)<br /> 0<br /> 1<br /> 4<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> 7<br /> 5<br /> 12<br /> <br /> 1<br /> 1<br /> 3<br /> <br /> 12<br /> 14<br /> 30<br /> <br /> Ở nhóm tuổi 12 - 15 tuổi có 11 trường hợp RT-PCR dương tính, (6 nam, 5 nữ) và ở nhóm<br /> < 7 tuổi có 3 trường hợp RT-PCR dương tính chỉ gặp ở nam.<br /> Bảng 6: Kết quả RT-PCR và xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt xuất huyết<br /> RT-PCR<br /> <br /> Dương<br /> tính<br /> Âm tính<br /> Tổng số<br /> <br /> Test<br /> nhanh<br /> <br /> Dương<br /> tính<br /> n%<br /> <br /> Âm<br /> tính<br /> n%<br /> <br /> Tổng<br /> số<br /> <br /> 18 94,7<br /> <br /> 2 5,3<br /> <br /> 19<br /> <br /> χ 2 = 5,541<br /> <br /> 6 60<br /> 24<br /> <br /> 4 40<br /> 6<br /> <br /> 10<br /> 29<br /> <br /> p = 0,019<br /> <br /> P và Test<br /> <br /> Nhận xét: Có 94,7% ca RT-PCR dương tính và test nhanh dương tính, nhưng chỉ có 60% trường<br /> hợp RT-PCR dương tính trong khi test nhanh âm tính. Sự khác biệt về RT-PCR so với test nhanh có<br /> ý nghĩa thống kê ( χ 2 = 5,541 , p = 0,019).<br /> <br /> Kết quả RT-PCR định týp vi-rút Dengue<br /> Bảng 7: Kết quả RT-PCR định týp vi-rút dengue<br /> Týp vi-rút dengue<br /> DEN-1<br /> DEN-2<br /> DEN-3<br /> <br /> n<br /> 3<br /> 17<br /> 4<br /> <br /> %<br /> 12<br /> 70,8<br /> 16,7<br /> <br /> Nhận xét: Kết quả định týp vi-rút dengue chỉ thu được ba týp (DEN-1, DEN-2 và DEN-3), trong đó<br /> DEN-2 chiếm tỷ lệ cao nhất 70,8%.<br /> Bảng 8: Kết quả định týp vi-rút dengue theo giới tính và địa dư<br /> Nam<br /> Nữ<br /> Tổng<br /> Địa dư DEN DEN DEN Tổn DEN DEN DEN Tổn<br /> số<br /> g<br /> g<br /> -1 -2 -3<br /> -1 -2 -3<br /> Cần Thơ 0<br /> 4<br /> 0<br /> 4<br /> 2<br /> 4<br /> 0<br /> 6<br /> 10<br /> Hậu<br /> 0<br /> 3<br /> 2<br /> 5<br /> 0<br /> 4<br /> 0<br /> 4<br /> 9<br /> Giang<br /> Vĩnh<br /> 1<br /> 0<br /> 2<br /> 3<br /> 0<br /> 2<br /> 0<br /> 2<br /> 5<br /> Long<br /> Tổng số 1<br /> 7<br /> 4<br /> 12 2<br /> 10<br /> 0 12 24<br /> <br /> Nhận xét: Týp DEN-3 không gặp ở nữ và ở Cần Thơ, DEN-1 không gặp ở Hậu Giang.<br /> Bảng 9: Mối liên quan giữa týp vi-rút dengue và phân độ lâm sàng<br /> <br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng và Y Học Dự Phòng<br /> <br /> 265<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 12 * Phụ bản của Số 4 * 2008<br /> Phân độ lâm sàng<br /> Độ I+II % Độ III %<br /> DEN-1<br /> 3<br /> 12,5<br /> 0<br /> 0<br /> Týp vi-rút<br /> DEN-2 13<br /> 54,1<br /> 4<br /> 16,7<br /> dengue<br /> DEN-3<br /> 4<br /> 16,7<br /> 0<br /> 0<br /> Tổng số<br /> 20<br /> 83,3<br /> 4<br /> 16,7<br /> <br /> n<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> %<br /> <br /> 3 12,5<br /> 17 70,8<br /> 4 16,7<br /> 24 100<br /> <br /> Nhận xét: Có 4 trường hợp SXH-D độ III (16,7%) đều là DEN-2.<br /> <br /> Chẩn đoán SXH-D theo tổ chức y tế thế giới<br /> Bảng 10: Chẩn đoán SXH-D (WHO)<br /> Có bệnh<br /> Không bệnh<br /> Tổng số<br /> <br /> SXH-D (WHO) (%)<br /> 24<br /> 80<br /> 06<br /> <br /> 20<br /> <br /> 30<br /> 100<br /> Nhận xét: Có 24/30 (80%) chẩn đoán SXH-D theo WHO.<br /> <br /> Bảng 11: Số ngày chẩn đoán SXH-D theo WHO<br /> Ngày 3<br /> Ngày 4<br /> Ngày 5<br /> Ngày 6<br /> Tổng số<br /> <br /> Chẩn đoán SXH-D (WHO) (%)<br /> 13<br /> 54,1<br /> 9<br /> 37,5<br /> 1<br /> 4,2<br /> 1<br /> 4,2<br /> 24<br /> 100<br /> <br /> Nhận xét: Có 13 trường hợp (54,1%) được chẩn đoán vào ngày 3 và 1 trường hợp (4,2%) được chẩn<br /> đoán vào ngày 5, ngày 6.<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Test RT-PCR khảo sát 30 mẫu huyết thanh của những bệnh nhi theo dõi sốt xuất huyết<br /> ghi nhận được 24 trường hợp RT-PCR cho kết quả dương tính, 80% (Bảng 3). Kết quả này<br /> tương đối phù hợp với một số tác giả khác như: Hồ Minh Châu 80%, Đỗ Quang Hà 77%,<br /> Nguyễn Trung Lập 63%.<br /> Kết quả dương tính trong 3 ngày đầu của bệnh (Bảng 3.4), và ngày đầu tiên của<br /> bệnh.cho thấy được thế mạnh của RT-PCR trong việc chẩn đoán sớm bệnh.Trong các ca RTPCR cho kết quả dương tính thì test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết là 18/29 (62%)<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi dựa vào RT-PCR và test nhanh, nhằm để so sánh mức<br /> độ phù hợp giữa hai xét nghiệm này trong chẩn đoán SXH. Kết quả khác biệt giữa hai xét<br /> nghiệm là có ý nghĩa (p = 0,01). Điều này có nghĩa là RT-PCR cho kết quả chẩn đoán bệnh<br /> chính xác, còn test nhanh chẩn đoán sốt xuất huyết chỉ giúp gợi ý chẩn đoán, phải kết hợp<br /> thêm với lâm sàng thì không bỏ sót những trường hợp mà test nhanh cho kết quả dương<br /> tính giả, âm tính giả.<br /> <br /> RT-PCR định týp vi-rút Dengue<br /> Kết quả cho thấy týp vi-rút dengueI là 70,8%, týp vi-rút dengueII (12,5%) và týp vi-rút<br /> dengue III (16,7%). Tuy nhiên, không phát hiện týp vi-rút dengue 4 trong thời điểm này<br /> (Bảng 7). Cần Thơ (8DEN-2, 2DEN-1), Hậu Giang (7DEN-2, 2DEN-3) và Vĩnh Long (1DEN1, 2DEN-2, 2DEN-3).<br /> <br /> 266<br /> Chuyên Đề Y Tế Công Cộng và Y Học Dự Phòng<br /> <br />