Xác định đồng thời paracetamol và ascorbic acid trong thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong bài viết "Xác định đồng thời paracetamol và ascorbic acid trong thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18" nhóm tác giả trình bày kết quả nghiên cứu xác định đồng thời PAR và AA trong thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định đồng thời paracetamol và ascorbic acid trong thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ ASCORBIC ACID TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO SỬ DỤNG CỘT PHA ĐẢO C18 Lê Thị Huỳnh Như 1 1. Viện Phát triển Ứng dụng, Trường Đại học Thủ Dầu Một TÓM TẮT Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp đơn giản, chọn lọc, nhanh chóng và chính xác đã được áp dụng để xác định đồng thời paracetamol (PAR) và ascorbic acid (AA) trong mẫu thuốc với pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,05 M (pH 3,5) : acetonitrile (90 : 10); tốc độ dòng pha động là 1,0 mL/phút; thể tích mẫu bơm là 20 µL; bước sóng phát hiện là 235 nm; cột Shimpack C18 pha đảo (4,6 × 250 mm, 5 µm). Kết quả cho thấy phương pháp phân tích có độ lặp lại nhỏ hơn 3% với RSD của PAR là 0,5%; của AA là 0,9%, độ thu hồi Rev của PAR từ 101,2% đến 103,7%; của AA từ 98,3% đến 104,5%. Từ khóa: ascorbic acid, paracetamol, HPLC 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol) là thuốc có tác dụng hạ sốt và giảm đau, tuy nhiên không như aspirin nó không hoặc ít có tác dụng chống viêm. So với các thuốc chống viêm không steroit (nonsteroidal antiinflammatory drugs, viết tắt là NSAIDs), paracetamol có rất ít tác dụng phụ. Ascorbic acid (5-(1,2- Dihydroxyethyl)-3,4-dihydroxy-2(5H)-furanone) hay vitamin C là một chất chống oxy hóa cần thiết đối với dinh dưỡng của con người nếu thiếu vitamin C có thể dẫn đến bệnh scorbut đặc trưng khiến cho xương và răng không bình thường (Trần Thu Nga, 2010). Thuốc chứa hỗn hợp paracetamol và ascorbic acid đã được sản xuất và đưa vào sử dụng từ lâu, được phối trộn nhiều trong các loại dược phẩm giảm đau, hạ sốt có trên thị trường như Hapacol Kids, Effe Paracetamol, Efferalgan Vitamin C, Effer-Paralmax C… Hình 1. Cấu trúc của paracetamol (a) và ascorbic acid (b) Đã có nhiều phương pháp dùng để xác định đồng thời PAR và AA như phương pháp quang phổ (Trần Thu Nga, 2010; Trần Thúc Bình và nnk, 2015), phương pháp điện hóa (Lê Thị Hòa và nnk, 2019; Trần Thanh Tâm Đoàn, 2020), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Yara Elkady và nnk, 2020; Petra Koblová và nnk, 2012, Boyka Tsvetkova và nnk, 206
2012). Trong đó phương pháp HPLC được xem là phương pháp chuẩn được các trung tâm kiểm nghiệm áp dụng do có các ưu điểm như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt (Mai Xuân Trường và cộng sự, 2014). Trong bài viết này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu xác định đồng thời PAR và AA trong thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị và hóa chất Chất chuẩn paracetamol, ascorbic acid do Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh, Bộ Y tế sản xuất. Các hóa chất: KH2PO4, acetonitrile, methanol... của Merck (99,9%). Thuốc Effer-Paralmax C (mỗi viên chứa 500 mg paracetamol và 150 mg ascorbic acid): sản xuất bởi công ty Boston – Việt Nam. Ngày sản xuất: 06/2021. Hạn sử dụng: 06/2024. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimazu SPD - 20A với detector UV - Vis SPD - 20A / 20AV; cột Shimpack C18 pha đảo (4,6 × 250 mm, 5 µm); thể tích mẫu bơm 20 µL; cân phân tích OHAUS PA214 có độ chính xác 0,0001 g; máy đo pH; máy rung siêu âm và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp HPLC Xác định đồng thời PAR, AA trong thuốc bằng phương pháp HPLC dựa trên sự phân bố qua lại giữa hai pha của các phân tử chất tan dẫn đến việc khác nhau về thời gian lưu của các chất. Bước 1: Hòa tan mẫu bằng dung dịch đệm Bước 2: Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm. Bước 3: Pha nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Bước 4: Tiến hành định lượng các chất theo phương pháp đường chuẩn. 2.2.2. Phương pháp đánh giá độ tin cậy - Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng cách phân tích mẫu thực tế thêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức: x2 − x0 Rev (%)= × 100% x1 Trong đó: x2: nồng độ chất phân tích trong mẫu đã thêm chuẩn; x1: nồng độ chất phân tích thêm chuẩn vào mẫu; x0: nồng độ chất phân tích trong mẫu (không thêm chuẩn). - Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá qua giá trị độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD) khi tiến hành phân tích lặp lại: ∑n (xi − x)2 i=1 SD =√ n−1 207
SD RSD (%) = ×100 x Trong đó: xi: giá trị nồng độ tính được tại lần đo thứ i; x: giá trị trung bình của nồng độ sau n lần đo; n: số lần thí nghiệm. - Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định theo quy tắc “3”: LOD = 3Sy/x/b LOQ = 10Sy/x/b Trong đó: Sy/x là sai số chuẩn của đường hồi quy tuyến tính; b là hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính 2.2.3. Phương pháp thống kê Phương pháp thống kê được áp dụng để xử lý số liệu thực nghiệm, phân tích hồi quy tuyến tính và đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký 3.1.1. Khảo sát bước sóng đo Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký hỗn hợp PAR : AA (tỉ lệ 200 : 200 µg/mL) tại các bước sóng 210, 215, 220,…, 260 nm. Sự thay đổi bước sóng đo làm thay đổi đáng kể độ lớn tín hiệu cũng như hiệu quả tách. Tuy nhiên tại bước sóng 235 nm cho độ lớn tín hiệu tốt, hiệu quả tách cao với đường nền thẳng. PA R A A Hình 2. Sắc đồ của dung dịch PAR : AA (200 : 200 µg/mL) tại 235 nm 3.1.2. Khảo sát pha động Để chọn được pha động và tỉ lệ pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm KH2PO4 0,05 M : acetonitrile: methanol ở các tỷ lệ thể tích lần lượt là 70 : 0 : 30 đến 70 : 30 : 0 (mỗi điểm cách nhau 5%). Ở tỉ lệ 70 : 30 : 0 cho kết 208
quả tốt, tuy nhiên với mục tiêu đơn giản hóa thành phần pha động, không sử dụng dung môi độc như methanol. Chúng tôi tiếp tục khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm KH2PO4 0,05 M : acetonitrile ở các tỉ lệ thể tích lần lượt là 60 : 40 đến 90 : 10 (mỗi điểm cách nhau 10%) và 85 : 15; 95 : 5. Kết quả cho thấy sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc ký. Tuy nhiên ở tỉ lệ hỗn hợp đệm KH2PO4 0,05 M : acetonitrile 90 : 10 (hình 3) cho kết quả tốt nhất. PA R A A Hình 3. Sắc đồ PAR và AA với pha động đệm : acetonitrile (90 : 10) 3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng Tiến hành chạy sắc ký hỗn hợp dung dịch PAR và AA với các tốc độ dòng lần lượt là 1 mL/phút, 1,25 mL/phút, 1,5 mL/phút và 2 mL/phút. Ở tốc độ dòng pha động là 1 mL/phút cho kết quả tốt nhất, khi tăng tốc độ dòng hiệu quả tách giảm đồng thời độ lớn tín hiệu giảm dần. PA R A A Hình 4. Sắc đồ PAR và AA với tốc độ dòng 1 mL/phút 3.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích được xác định theo quy tắc “3 ” với Sy/x là sai số chuẩn của đường hồi quy tuyến tính và b là hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính. Bảng 1. LOQ và LOQ của PAR và AA Phương trình hồi quy tuyến LOD LOQ Chất Hệ số b Sy/x tính (g/mL) (g/mL) PAR y = 58525x + 1920678 58525 144224 7,39 24,64 AA y = 36685x – 154819 36685 76592 6,26 20,88 209
Độ lặp lại Độ lặp lại được xác định bằng cách đo lặp lại 4 lần với hỗn hợp dung dịch chuẩn PAR và AA ở các tỉ lệ nồng độ 500 : 200 µg/mL; 400 : 150 µg/mL với điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả thu được ở bảng 2, 3 cho thấy độ lặp lại của phương pháp là rất tốt với RSD của PAR là 0,04 - 0,85%, của AA là 0 - 0,99%. Bảng 2. Độ lặp lại của mẫu PAR : AA (500:200 µg/mL) PAR AA Mẫu tR H S tR H S (phút) (mV) (mAuxphút) (phút) (mV) (mAuxphút) 1 8,429 1557373 31058000 2,957 432298 7059262 2 8,423 1551242 31063806 2,948 431869 7110617 3 8,429 1559699 31060709 2,949 423271 7076884 4 8,430 1556307 30920291 2,950 427080 7187166 Số liệu thống kê ̅ 𝐗 8,43 1556155 31025701 2,95 428629 7108482 S 0,003 3568 70313 0,004 4284 56617 RSD (%) 0,04 0,23 0,23 0,14 0,99 0,80 tR là thời gian lưu, H là chiều cao, S là diện tích ̅ : giá trị trung bình (n = 4); S: độ lệch chuẩn; RSD: độ lệch chuẩn tương đối 𝑋 Bảng 3. Độ lặp lại của mẫu PAR : AA (400:150 µg/mL) PAR AA Mẫu tR H S tR H S (phút) (mV) (mAuxphút) (phút) (mV) (mAuxphút) 1 8,424 1271248 25302836 2,950 321648 5550069 2 8,419 1271015 25290320 2,950 320129 5430086 3 8,392 1293428 25549836 2,950 321188 5443445 4 8,418 1284007 25547909 2,950 323497 5464600 Số liệu thống kê ̅ 𝐗 8,413 1279924 25422725 2,950 321615 5472050 S 0,014 10857 145754 0 1406 53918 RSD (%) 0,171 0,85 0,57 0 0,44 0,99 3.3. Áp dụng thực tế 3.3.1. Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 20 viên thuốc Effer-Paralmax C. Sau đó tính khối lượng trung bình của mỗi viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác m (g) bột thuốc (khoảng 1/5 khối lượng viên thuốc). Hòa tan mẫu bằng dung dịch đệm sau đó chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 mL, thêm đệm đến vạch. Tiến hành rung siêu âm trong 15 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Hút 12,5 mL dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch đệm. Hàm lượng của PAR và AA trong một viên được tính theo công thức sau: ̅ C×M×0,2 a (mg/viên) = m Trong đó: a: hàm lượng của PAR, AA trong một viên C: nồng độ của chất xác định được trong dung dịch mẫu (μg/mL) ̅ M: khối lượng trung bình của một viên (g) 210
m: khối lượng bột viên đã cân để định lượng (g) 0,2: hệ số chuyển đổi 3.3.2. Xác định đồng thời PAR và AA trong thuốc Độ lặp lại: Tiến hành chạy sắc ký dung dịch mẫu thuốc Effer-Paralmax C đã chuẩn bị như trên thu được kết quả như bảng 4 và hình 5. Bảng 4. Kết quả phân tích PAR và AA trong thuốc Effer-Paralmax C Lượng thuốc S Hàm lượng Sai lệch so với Số liệu (g) mAuxphút (mg/viên) nhãn (%) thống kê PAR 0,5879 31010213 497,0 99,5 ̅X= 500,8 0,5885 31400799 503,7 100,7 SD = 2,846 0,5884 31333590 502,6 100,5 RSD (%) = 0,5 0,5881 31131573 499,4 99,8 µ = 500,8 ± 4,5 AA 0,5879 5194094 145,9 97,3 ̅X= 147,7 0,5885 5310179 148,9 99,3 SD = 1,130 0,5884 5290849 148,4 98,9 RSD (%) = 0,9 0,5881 5251070 147,5 98,3 µ = 147,7 ± 2,1 PA R A A Hình 5. Sắc đồ của mẫu thuốc Effer-Paralmax C Từ kết quả xác định PAR và AA trong thuốc Effer-Paralmax C ở bảng 4 cho thấy RSD của PAR và AA đều nhỏ hơn 3% (PAR: 0,5%; AA: 0,9%) là phù hợp với yêu cầu về phân tích định lượng (Bộ Y tế, 2017). Do đó, độ lặp lại của phương pháp phân tích là đạt yêu cầu. - Độ đúng của quy trình phân tích Kết quả bảng 5 cho thấy phương pháp thêm chuẩn đối với thuốc Effer-Paralmax C có độ thu hồi Rev của PAR từ 101,2% đến 103,7% và Rev của AA từ 98,3% đến 104,5%. Đối với các phép thử định lượng, Rev phải đạt từ 90 - 110% (Bộ Y tế, 2017). Do đó, chúng tôi kết luận phương pháp phân tích PAR và AA trong mẫu thuốc Effer-Paralmax C đạt yêu cầu về độ đúng. 211
Bảng 5. Kết quả độ đúng của phương pháp X0 X1 X2 Số liệu thống Chất Mẫu Rev(%) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) kê 1 397,2 80 480,1 103,5 ̅ X(Rev) = 102,7 2 397,2 80 478,2 101,2 PAR SD = 1,2 3 400,1 80 483,1 103,7 RSD (%) = 1,2 4 397,2 80 479,1 102,5 1 117,9 20 137,8 99,4 ̅(Rev) = 100,5 X 2 117,9 20 137,6 98,3 AA SD = 1,3 3 158,0 20 178,9 104,5 RSD (%) = 1,3 4 117,9 20 137,9 99,7 4. KẾT LUẬN Các điều kiện sắc ký thích hợp cho phép xác định đồng thời PAR và AA: pha động là dung dịch đệm KH2PO4 0,05 M và acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 90 : 10; bước sóng đo: 235 nm; tốc độ dòng pha động: 1 mL/phút; cột: Shimpack C18 pha đảo (4,6 × 250 mm, 5 µm); thể tích bơm mẫu: 20 µL. Phương pháp phân tích có độ lặp lại cao (RSD = 0,5% với PAR, 0,9% với AA) và độ đúng tốt (Rev = 102,7% với PAR và 100,5% với AA). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2017). Dược điển Việt Nam V. Hà Nội: Nhà xuất bản Y học. 2. Trần Thúc Bình và Nguyễn Đức Thái (2015). Xác định paracetamol và axit ascorbic trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ đạo hàm. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 20(3) 29 - 39. 3. Boyka Tsvetkova, Ivanka Pencheva, Alexander Zlatkov and Plamen Peikov (2012). Simultaneous high performance liquid chromatography determination of paracetamol and ascorbic acid intablet dosage forms. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 6(17) 1332 - 1336. 4. Trần Thanh Tâm Đoàn (2020). Nghiên cứu phát triển điện cực biến tính với graphen oxit để phân tích axit ascorbic, paracetamol và caffein bằng phương pháp von-ampe hòa tan (Luận văn tiến sĩ Hóa học). Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế. Thừa Thiên Huế. 5. Lê Thị Hòa, Đoàn Thuật và Nguyễn Anh Thu (2019). Nghiên cứu khả năng phân tích đồng thời acid ascorbic và paracetamol bằng phương pháp điện hóa sử dụng điện cực biến tính UIO - 66/GEC. Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, 50(6) 5 - 7. 6. Trần Thu Nga (2010). Xác định đồng thời acetaminophen và axit ascobic trong thuốc Hapacol kids và Effe - paracetamol theo phương pháp phổ hấp thụ phân tử sử dụng chương trình lọc Kalman (Luận văn thạc sĩ Hóa học). Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Thái Nguyên. 7. Petra Koblov a, Hana Sklen arov a, Ivana Brabcov a and Petr Solich (2012). Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine using a monolithic column. Analytical Methods, (4) 1588 - 1591. 8. Mai Xuân Trường và Vũ Duy Long (2014). Định lượng đồng thời paracetamol, chlopheniramine maleate và phenylephrine HCl trong thuốc Tiffy bằng phương pháp HPLC. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 118(4) 175 - 178. 9. Yara Elkady, Sobhy M. El-Adl, Mohamed Baraka, Mahmoud M. Sebaiy (2020). HPLC method for simultaneous determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol, caffeine in their pure and dosage forms. International Journal of Advanced Research in Chemical Science, 6(7) 7 - 16. 212