XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

Chia sẻ: Nguyen Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

135
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mở đầu: Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA SIÊU VI VIÊM GAN B BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI Tóm Tắt Mở đầu: Tám kiểu gen của siêu vi viêm gan B (HBV) đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8 % của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Việc xác định kiểu gen của HBV ngày càng được quan tâm bởi vì kiểu gen HBV có liên quan đến biểu hiện triệu chứng lâm sàng, diễn tiến của bệnh cũng như đáp ứng với điều trị của viêm gan siêu vi B. Bên cạnh đó, vấn đề phát hiện đột biến kháng thuốc, đặc biệt là các đột biến kháng Lamivudine trong điều trị HBV giữ một vai trò rất quan trọng để từ đó chúng ta mới có lựa chọn thuốc đúng và hiệu quả trong điều trị viêm gan siêu vi B. Mục tiêu và phương pháp: Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) trên hệ thống OpenGene với bộ thuốc thử TruGene (Bayer) trong việc xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc Lamivudine đã được công bố của HBV. Trong thời gian từ tháng 8/2004 đến tháng 5/2006, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi
thực hiện giải trình tự chuỗi cho 122 trường hợp bệnh nhân Việt Nam viêm gan siêu vi B mãn tính đang điều trị Lamivudine. Kết quả: Nam chiếm 97 trường hợp (79,5%), nữ 25 trường hợp (20,5%), với tuổi trung bình của bệnh nhân 33,9 ± 10,4. Tất cả các trường hợp đều HBVDNA [+], trong đó HBeAg [+] là 100 trường hợp (82,0%) và HBeAg [-] là 22 trường hợp (18,0 %). Chỉ có 2 kiểu gen của HBV là kiểu gen B và C, trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3 %) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7 %). Tổng cộng có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine, tỷ lệ và các kiểu đột biến như sau: L180M & M204I (11,5%); L180M & M204V (36,1%); L180M, M204V & V173L (0,8%); L180M, M204V & V207I (0,8%); M204I (12,3%); M204I & V207I (0,8%); M204V (1,6%). Trong 76 trường hợp kiểu gen B có 49 trường hợp (64,5%) có đột biến kháng Lamivudine, và 46 trường hợp kiểu gen C có 29 trường hợp (63,0%) có đột biến kháng Lamivudine. Tất cả bệnh nhân đang điều trị Lamivudine với thời gian điều trị trung bình là 2,5 ± 0,9 năm với số trường hợp tương ứng cho điều trị 1, 2, 3, 4 năm là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Tỷ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine là 27,8%; 63,4%; 71,1%; 83,3%. Kết luận: Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng trong việc xác định kiểu gen
siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điề u trị tối ưu. ABSTRACT APPLYING SEQUENCING TO IDENTIFY HEPATITIS B VIRUS GENOTYPES AND Background: Hepatitis B Virus (HBV) can be classified into 8 genotypes A through H based on an intergroup divergence of 8% or more in the complete nucleotide sequence, and the different distribution of various genotypes in different continents, countries. The identification of HBV genotypes are more concerned as it is HBV genotypes relating to clinical manifestation, activity of liver disease as well as treatment responses of Hepatitis B. Additionally, the discovery of resistance to medicines in HBV treatment plays a very important role from which we can have an appropriate and effective choice in Hepatitis B treatment. Objective and methods: We have applied the Sequencing by OpenGene system with Trugene HBV Genotyping kit (Bayer) to identify Hepatitis B Virus Genotypes and Lamivudine – resistant mutation. From August 2004 to May 2006, in MEDIC laboratory, we have implemented sequencing for 122 cases Vietnamese with Chronic Hepatitis B on Lamivudine treatment.
Results: 97 cases are males (take 79.5%) and 25 cases are females (take 20.5%), medium age: 33.9±10.4. All cases are HBVDNA [+] in which: 100 cases are HBeAg [+] (82.0%) and 22 cases are HBeAg [-] (18.0%). There are only two genotypes of HBV: genotype B and genotype C, in which 76 cases are genotypes B (62.3%) and 46 cases are genotype C (37.7%). Totally there are 78 cases (63.9%) mutations with following established proportion and types: L180M & M204I (11.5%); L180M & M204V (36.1%); L180M, M204V & V173L (0.8%); L180M, M204V & V207I (0.8%); M204I (12.3%); M204I&V207I (0.8%); M204V (1.6%). There are 49 cases mutations in 76 cases of genotypes B (64.5%) and 29 cases in 46 cases of genotypes C (63.0%). All patients are on Lamivudine treatment with average time is 2.5±0.9 years, the corresponding number of patients in treatment period of 1, 2, 3, 4 year are 18, 41, 45, 18. The proportion of developing mutations after 1, 2, 3, 4 years of treatment with Lamivudine is 27.8%; 63.4%; 71.1%; 83.3%. Conclusions: We have found that - with above preliminary results - the sequencing plays a very important role in identifying Hepatitis B Virus Genotypes and Mutations. From those results we can approach an optimal treatment course. Đặt vấn đe
Những tiến bộ mới trong điều trị viêm gan do siêu vi B (HBV) đã góp phần đáng kể trong việc hạn chế những biến chứng của bệnh. Cho đến nay đã có 4 loại thuốc điều trị HBV đã được FDA (Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ) công nhận là Entecavir1,6,7,10,17, trong đó Interferone, Lamivudine, Adefovir và Lamivudine vẫn được xem là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên. Tuy nhiên trong quá trình điều trị Lamivudine đã có vấn đề phát sinh: Vấn đề đột biến kháng Lamivudine của HBV, tỉ lệ đột biến kháng này xảy ra ngày càng cao tăng theo thời gian dùng thuốc Lamivudine1,6,18,19. Một vấn đề mới ngày càng được quan tâm là kiểu gen của HBV (HBV Genotype). Khác với kiểu gen siêu vi viêm gan C (HCV) có vai trò quan trọng trong việc đánh giá điều trị đặc hiệu thì vai trò của kiểu gen HBV chưa được rõ ràng lắm. Sự phân bố của kiểu gen HBV thay đổi tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước sẽ có các kiểu gen vượt trội khác nhau4,8. Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử có thể dùng để xác định các đột biến kháng thuốc của HBV cũng như xác định kiểu gen của HBV. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để đồng thời vừa xác định các đột biến kháng thuốc Lamivudine của HBV vừa xác định đ ược kiểu gen HBV, khảo sát kiểu gen nào vượt trội ở người Việt Nam cũng như đánh giá
các loại và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Lamivudine. Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HBV ở bệnh nhân Việt Nam; (2) Khảo sát các kiểu đột biến và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine liên tục. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân người Việt Nam, đã được chẩn đoán viêm gan siêu vi B mãn tính đang được điều trị liên tục bằng Lamivudine. Các bệnh nhân được chia làm 4 nhóm với thời gian điều trị liên tục Lamivudine tương ứng là 1, 2, 3, 4 năm. Có xét nghiệm HBVDNA dương tính. Không bị đồng nhiễm siêu vi viêm gan C. Kỹ thuật thực hiện Kỹ thuật giải trình tự chuỗi Huyết thanh bệnh nhân được tách và lưu trong ống mẫu tinh sạch, nếu mẫu chưa thực hiện ngay thì được lưu ở nhiệt độ – 200C. DNA của HBV được tách chiết theo nguyên tắc hấp thụ trên hạt Silicate (Phương pháp
BOOM) rồi rửa bằng Ethanol 70%. Thực hiện phản ứng trùng hợp chuỗi (PCR) trên bộ thuốc thử TruGene HBV Genotyping (Bayer), máy luân nhiệt Bio-Rad theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi kiểm tra có sản phẩm khuếch đại (Amplicons) bằng điện di trên thạch Agarose thì tiếp tục thực hiện phản ứng cắt đoạn (Clip reaction) theo hướng dẫn của nhà sản xuất trên máy luân nhiệt, tiếp tục thực hiện điện di trên thạch Acrylamide với hệ thống OpenGene. Tín hiệu sẽ tự động thu nhận từ hệ thống điện di và phần mềm máy tính sẽ sắp xếp trình tự chuỗi của mẫu, và trình tự chuỗi này sẽ được so sánh với thư viện gen (Gene Librarian) có sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất (Bayer). Kết quả thu nhận được là kiểu gen của HBV và các đột biến kháng Lamivudine đã được công bố. HBeAg Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp điện hóa phát quang, thuốc thử của hãng Abbott, thực hiện trên máy Architect (Abbott). Phương pháp nghiên cứu Cắt ngang. Thống ke Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5. Kết qua
Tổng số có 122 trường hợp được thực hiện giải trình tự chuỗi: - Tuổi nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 63 với độ tuổi trung bình là 33,9 ± 10,4. - Nam có 97 trường hợp chiếm 79,5% và nữ có 25 trường hợp chiếm 20,5%. Kiểu gen của HBV trong 122 trường hợp: Chỉ có 2 kiểu gen của HBV được xác định là kiểu gen B và C. Trong đó kiểu gen B là 76 trường hợp (62,3%) và kiểu gen C là 46 trường hợp (37,7%). Kết quả HBeAg Tất cả 122 trường hợp đều có HBVDNA dương tính, trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Kết quả của HBeAg trong các kiểu gen khác nhau cũng được ghi nhận. Bảng 1. Tỉ lệ HBeAg và các kiểu gen B, C. Kiểu gen B Kiểu gen C Số Phần Số Phần lượng trăm lượng trăm
HBeAg 12 15,8% 10 21,7% âm tính HBeAg 64 84,2% 36 78,3% dương tính Kiểu gen HBV và các đột biến kháng Lamivudine Bảng 2. Tỉ lệ của đột biến kháng Lamivudine và kiểu gen HBV. Kiểu gen B Kiểu gen C Số Phần Số % lượng trăm lượng Không 27 35,5% 17 37% có đột biến kháng Lamivudine Có đột 49 64,5% 29 63% biến kháng Lamivudine
Các kiểu đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine theo thời gian điều trị Tổng cộng có 78 (63,9%) trường hợp có đột biến kháng Lamivudine. Bảng 3. Tỷ lệ các loại đột biến kháng Lamivudine và tỉ lệ phần trăm. L L1 L1 L1 L1 M M M oại đột 80M, 80M, 80M, 80M, 204I 204I, 204V biến M204I M204V M204V M204V V207I & V173L & V207I S 14 44 1 1 15 1 2 ố lượng T 11, 36, 0.8 0,8 12 0, 1,6 ỉ lệ % 5 1 ,3 8 Ghi chú: L (Leucine); M (Methionine); I (Isoleucine); V (Valine). Có 4 nhóm bệnh nhân được khảo sát dựa trên thời gian điều trị Lamivudine, số lượng bệnh nhân sau 1, 2, 3, 4 năm điều trị Lamivudine
tương ứng là 18, 41, 45, 18 trường hợp. Thời gian điều trị Lamivudine trung bình là 2,5 ± 0,9 năm. Bảng 4. Tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine và thời gian điều trị Lamivudine. 1 năm 2 năm 3 năm 4 năm S S S S Ph Ph Ph Ph ố ố ố ố ần trăm ần trăm ần trăm ần trăm lượng lượng lượng lượng Kh ông có đột biến 1 72, 1 36, 1 28, 16, 3 kháng 3 2% 5 6% 3 9% 7% Lamivudi ne
Có đột biến 27, 2 63, 3 71, 1 83, kháng 5 8% 6 4% 2 1% 5 3% Lamivudi ne Bàn luận Kiểu gen HBV Có 2 cách phân loại HBV Kiểu huyết thanh (Serotype) và kiểu gen (Genotype). Trước đây người ta phân HBV thành 4 kiểu huyết thanh adr, adw, ayr và ayw dựa vào các kháng nguyên c ủa kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg). Tuy nhiên những ý nghĩa của kiểu huyết thanh chưa được nghiên cứu nhiều. Với sự phát triển của sinh học phân tử, ngày nay người ta phân loại HBV dựa vào nghiên cứu trên bộ gen của HBV và phân HBV thành 8 loại đặt tên từ A đến H dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ bộ gen của HBV4,6,8. Có nhiều kỹ thuật dùng để xác định kiểu gen HBV8,13 như kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing), sự đa hình của các đoạn cắt giới hạn (RFLP), phản ứng lai các đoạn dò (LiPA), phản ứng trùng hợp chuỗi với các đoạn mồi đặc hiệu (PCR with Specific Primers), phản ứng miễn dịch gắn men (Enzyme-linked
immunoassay)... Kỹ thuật chúng tôi dùng để xác định kiểu gen của HBV là kỹ thuật giải trình tự chuỗi vì bên cạnh việc xác định được kiểu gen của HBV chúng tôi còn tìm được các đột biến kháng Lamivudine chỉ trong một lần thực hiện giải trình tự chuỗi. Vai trò của kiểu gen HBV chưa được nghiên cứu nhiều cũng như có nhiều nghiên cứu với số liệu nhỏ, rãi rác công bố với kết quả không phù hợp nhau, điều này khác với vai trò của kiểu gen HCV trong vấn đề điều trị viêm gan siêu vi C4,11,23. Kiểu gen của HBV phân bố ở các châu lục và vùng lãnh thổ khác nhau thì khác nhau. Kiểu gen HBV chủ yếu ở Đông Nam Á là kiểu gen B và C4,14, điều này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi với 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi có 76 trường hợp (62,3%) kiểu gen B và 46 trường hợp (37,7%) kiểu gen C. Trong 122 trường hợp thực hiện giải trình tự chuỗi (HBV DNA dương tính) chúng tôi ghi nhận trong đó HBeAg âm tính là 22 trường hợp (18%) và HBeAg dương tính là 100 trường hợp (82%). Có vài nghiên cứu đã được công bố cho thấy đối với kiểu gen B của HBV có thải trừ HBeAg cao hơn so với kiểu gen C4,5,16. Tuy nhiên kết quả của chúng tôi (Bảng 1) không có sự khác biệt rõ rệt giữa tỉ lệ HBeAg âm tính ở kiểu gen B và C (15,8% và 21,7%). Vai trò của kiểu gen HBV trong diễn tiến của bệnh viêm gan siêu vi B cũng được nghiên cứu, kết quả cho thấy kiểu gen C dường như làm cho rối loạn chức năng gan nhiều hơn
kiểu gen B cũng như kiểu gen C dễ diễn tiến đến xơ gan nhiều hơn kiểu gen B4,6,8,11. Mối liên hệ giữa kiểu gen HBV và ung thư tế bào gan cũng được ghi nhận: Kiểu gen B thường kết hợp với sự phát triển ung thư tế bào gan ở người trẻ tuổi, một nghiên cứu khác lại cho thấy kiểu gen C thường kết hợp với ung thư tế bào gan và có tỉ lệ tái phát ung thư tế bào gan cao hơn sau khi được phẫu thuật cắt bỏ ung thư tế bào gan so với kiểu gen B4,6,15. Anh hưởng của kiểu gen HBV với đáp ứng điều trị Lamivudine cũng chưa được nghiên cứu nhiều, một nghiên cứu cho thấy dường như bệnh nhân kiểu gen B dễ phát triển đột biến kháng Lamivudine hơn các kiểu gen khác4, cũng như kiểu gen D có đột biến kháng Lamivudine cao hơn kiểu gen A2. Kết quả của chúng tôi ghi nhận (Bảng 2) tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine ở kiểu gen B (64,5%) và kiểu gen C (63%) là gần bằng nhau. Do đó các vấn đề về ảnh hưởng của kiểu gen HBV cần phải được nghiên cứu lâu dài và số lượng bệnh nhân nhiều hơn. Các kiểu và tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở bệnh nhân điều trị Lamivudine Lamivudine là thuốc uống được lựa chọn đầu tiên trong điều trị viêm gan siêu vi B mãn tính vì có nhiều ưu điểm như giá thành có thể chấp nhận được, an toàn, ít tác dụng phụ, dễ sử dụng (D ùng đường uống), tuy nhiên có một nhược điểm mà ngày càng được nhiều người quan tâm là vấn đề đột
biến kháng Lamivudine của siêu vi viêm gan B và tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine tăng theo thời gian sử dụng Lamivudine. Vị trí đột biến kháng Lamivudine xảy ra trên vùng C (Domain C) của đoạn gen sao chép ngược (RT: Reverse Transcriptase) của HBV chủ yếu là kiểu YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate), ở đó Methionine sẽ được thay bằng Valine, Isoleucine và hiếm khi là Serine (Đột biến rtM204V/I/S). Những đột biến khác cũng liên quan đến kháng Lamivudine như đột biến thay Leucine thành Methionine ở vùng B (Domain B) là đột biến rtL180M; Đột biến V173L; Đột biến V207I3,9,12,19,20,21,24. Trong 122 trường hợp giải trình tự chuỗi thì có 78 trường hợp (63,9%) có đột biến kháng Lamivudine. Có nhiều kiểu đột biến kháng Lamivudine, chủ yếu là đột biến ở vị trí 204 và có kèm hoặc không các đột biến rtL180M, V173L, V207I. Kết quả của chúng tôi cho thấy có rất nhiều dạng của đột biến kháng Lamivudine (Bảng 3) trong đó chiếm nhiều nhất là đột biến rtL180M và M204V (36,1%). Lamivudine được dùng điều trị viêm gan siêu vi B thường với thời gian điều trị kéo dài, tối thiểu phải là 1 năm. Nhiều nghiên cứu đã công bố cho thấy tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine của HBV lại tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine. Theo Guan R. và cộng sự, tỉ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 14%, và tỉ lệ
này tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine là 38%, 49%, 66% và 69% tương ứng với thời gian điều trị Lamivudine là 2, 3, 4, và 5 năm1. Một nghiên cứu khác của T-T Chang và cộng sự cũng đã cho thấy tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine sau một năm điều trị Lamivudine là 17%, và tăng dần theo thời gian điều trị Lamivudine 2, 3, 4 năm tương ứng là 40%, 57%, 67%22. Kết quả khảo sát tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine trong 4 nhóm bệnh nhân có điều trị liên tục Lamivudine với 4 nhóm thời gian điều trị khác nhau (Bảng 4) của chúng tôi cũng cho thấy tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị Lamivudine là 27,8%, và tỉ lệ này cũng tăng dần theo các nhóm có thời gian điều trị Lamivudine tăng dần là 2, 3, 4 năm là 63,4%, 71,1% và 83,3%. So sánh với các công trình đã công bố chúng ta có thể thấy rằng tỉ lệ có đột biến kháng Lamivudine sau một thời gian điều trị bằng Lamivudine ở nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Có rất nhiều nguyên nhân ảnh hưởng đến việc xuất hiện đột biến kháng Lamivudine trong quá trình điều trị, tuy nhiên có một yếu tố quan trọng có thể làm cho tỉ lệ đột biến kháng Lamivudine cao là vấn đề sử dụng thuốc Lamivudine có đúng theo hướng dẫn bác sĩ điều trị không, điều trị Lamivudine thành nhiều đợt khác nhau trước khi bệnh nhân được đưa vào nhóm nghiên cứu. Kết quả này cho chúng ta thấy một tỉ lệ khá cao của đột biến kháng Lamivudine, và việc phát hiện đột biến kháng Lamivudine kịp thời giữ một vai trò cực kỳ quan
trọng trong quá trình điều trị viêm gan siêu vi B bằng Lamivudine để từ đó chúng ta có thể thay đổi thuốc điều trị thích hợp nhằm đạt được mục tiêu điều trị. Kết luận Kiểu gen HBV ở Việt Nam chủ yếu là B và C, tuy nhiên vai trò của kiểu gen HBV trong diễn tiến bệnh cũng như đáp ứng điều trị chưa được biết rõ. Các kiểu đột biến kháng Lamivudine của nhóm bệnh nhân chúng tôi thì đa dạng, đặc biệt tỉ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudine cao và tăng dần theo thời gian dùng thuốc Lamivudine. Qua kết quả bước đầu đạt được chúng tôi thấy rằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi giữ một vai trò rất quan trọng và có thể được áp dụng như một xét nghiệm thường qui trong việc xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B cũng như việc nhận diện được các đột biến kháng thuốc Lamivudine để từ đó chúng ta có một phác đồ điều trị tối ưu.