XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

Chia sẻ: Nguyễn Thắng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

133
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mặc dù chương trình tiêm ngừa vi rút viêm gan B (HBV) đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rút B, nhưng HBV vẫn còn là một “tên sát nhân giấu mặt” vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với một trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, và đa số trường hợp không có triệu chứng lâm sàng ở những trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà chỉ có xét nghiệm máu chúng ta mới chẩn đoán được bệnh. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI I, NHỮNG TIẾN BỘ CỦA XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B Mặc dù chương trình tiêm ngừa vi rút viêm gan B (HBV) đã làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rút B, nhưng HBV vẫn còn là một “tên sát nhân giấu mặt” vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với một trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, và đa số trường hợp không có triệu chứng lâm sàng ở những trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà chỉ có xét nghiệm máu chúng ta mới chẩn đoán được bệnh. Do đó, vai trò của xét nghiệm trong chẩn đoán viêm gan do vi rút B giữ một vai trò cực kỳ quan trọng. Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được xử dụng trong chẩn đoán viêm gan vi rút B, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau tùy vào từng giai đoạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lựa chọn xét nghiệm thích hợp. Có 5 xét nghiệm hay được dùng trong chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi B trước đây là HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM và AntiHBc
IgG. Các xét nghiệm này là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế. Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên chúng ta đã có thể chẩn đoán được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử (Đó là các xét nghiệm phân tích trên phân tử di truyền của HBV là DNA). Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch kinh điển cũng nh ư phân tích DNA vi rút giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tình trạng bệnh, khả năng diễn tiến của bệnh, theo dõi điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp. Cho đến nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở HBV như sau: F Xác định được tình trạng đang tăng sinh của vi rút trong những tr ường hợp có đột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) để từ đó có quyết định điều trị đặc trị không. Đó là xét nghiệm HBVDNA, và kỹ thuật thường dùng để xác định HBVDNA là kỹ thuật PCR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA đích, rất nhạy và đặc hiệu, được xử dụng phổ biến không chỉ ở Việt Nam mà cả trên thế giới). F Đếm số lượng vi rút B trong máu để theo d õi trong điều trị. Nhờ xác định được số lượng vi rút trước khi điều trị mà chúng ta có thể theo dõi số lượng vi rút trong quá trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu
quả. Hai kỹ thuật thường dùng để định lượng vi rút viêm gan B là Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời gian thật) và bDNA (Khuếch đại tín hiệu). F Xác định được loại vi rút (Định kiểu gen vi rút HBV: HBV Genotype). F Phân tích được các trường hợp đột biến kháng thuốc để từ đó chúng ta có cơ sở lựa chọn các loại thuốc điều trị thích hợp, đặc biệt các đột biến kháng với Lamivudine (Là thuốc uống đầu tiên và được xử dụng rộng rãi cho điều trị HBV, tuy nhiên có một nhược điểm duy nhất là rất dễ bi đột biến kháng thuốc ở vi rút). Nhờ đó mà người bác sĩ sẽ tránh được những trường hợp dùng thuốc không hiệu quả, giảm sự tốn kém cho bệnh nhân. Cho đến nay, 2 vấn đề mới nổi lên và đang được quan tâm trong việc chẩn đoán HBV là vai trò thực sự của kiểu gen vi rút viêm gan B và sự đột biến của vi rút B trong quá trình diễn tiến tự nhiên của bệnh cũng như dưới tác động của thuốc đặc trị: Kháng thuốc như thế nào và hiệu quả của các thuốc điều trị. II, PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VÀ ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VI RÚT B. Trước đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes): adr, adw, ayr, và ayw dựa trên việc xác định các kiểu kháng nguyên của kháng nguyên bề mặt vi rút B, các kiểu huyết thanh này có thể phân loại thêm ra 9 chi kiểu (Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq -. Nghiên cứu dịch tể
cho thấy sự phân bố của các serotypes khác nhau trên các vùng khác nhau trên thế giới. Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít dữ liệu về vai trò của HBV Serotypes. Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kỹ 20 đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vi rút viêm gan B, và từ đó một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype. Tám kiểu gen của HBV đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotypes có thể chỉ cần dựa trên trình tự chuỗi (sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình tự chuỗi của gen pre-S; S. Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định HBV genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-linked Immunoassay). Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ đó so sánh với th ư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả giải trình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột biến kháng thuốc của HBV để từ đó có phát đồ điều trị tối ưu.
Hiên nay, tại trung tâm y khoa MEDIC TP Hồ chí Minh xử dụng hệ thống giải trình tự Trugen của hãng Bayer (Đức). Đây là hệ thống giải trình tự xác định được cùng một lúc kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của HBV và lần đầu tiên xử dụng như một xét nghiệm thường qui. Ngoài HBV, hệ thống này còn dùng cho xác định kiểu gen vi rút viêm gan C (HCV genotype) cũng như xác định các đột biến kháng thuốc vủa HIV. 1, KHÁI NIỆM VỀ CẤU TRÚC PHÂN TỬ DNA: Nguyên tắc bổ sung trong cấu tạo phân tử DNA: DNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết Hydro. Mối liên kết này có thể bị phá vỡ bởi nhiệt độ cao (Th ường là trên 90 o C, và ứng dụng thực tế là 94 o C), làm cho phân tử DNA biến thành 2 mạch đơn. Có 4 loại Nucleotid (Nu ) căn bản cấu tạo nên DNA: A(Adenine), T(Thymine), G(Guanine), C(Cytosine).
Và ở phân tử RNA là A, U, G, C. Các Nu này bắt cặp với nhau theo nguyên tắc bổ sung: A (Hoặc U ) gắn với T, G gắn với C (Xem hình minh họa). Việc xác định được thứ tự các Nu gắn kết với nhau dọc theo chiều dài của bộ gen (DNA) gọi là việc giải trình tự chuỗi (Sequencing), và trình tự gắn kết nhau của các Nu gọi là trình tự chuỗi (Sequence). 2, CẤU TẠO BỘ GEN HBV: HBV có bộ gen là phân tử DNA, chiều dài khoảng 3200 bases. Hoạt động nhân đôi của HBV nhờ hoạt tính của men polymerase (P protein), đây l à một Protein lớn, phức tạp, và đa chức năng. Trên vùng gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có một chức năng riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H (Xem hình). Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNA-dependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A – G (Xem hình cấu tạo RT). Vì vùng RT là đích tác động của thuốc Lamivudine nên những đột biến của vùng này trong quá trình phát triển tự nhiên của siêu vi B cũng như dưới tác động của thuốc điều trị sẽ dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc.
CẤU TẠO BỘ GEN HBV
CẤU TẠO GEN P VÀ VÙNG RT 3, QUI TRÌNH THỰC HIỆN GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI TRÊN HỆ THỐNG SEQUENCING TRUGENE Để thực hiện được kỹ thuật giải trình tự chuỗi, chúng ta phải thực hiện 3 b ước chính sau: (1) Thực hiện PCR; (2) Thực hiện phản ứng cắt; (3) Điện di và phân tích kết quả. 3.1, THỰC HIỆN PCR.
Để khuếch đại gene của HBV ta dùng kỹ thuật PCR. Mục đích của giai đoạn này là khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có ở trong máu bệnh nhân: Từ một phân tử ban đầu thành hàng tỷ bản sao DNA, từ đó mới thực hiện đ ược giải trình tự chuỗi của HBV. Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định cho sự thành công khi thực hiện giải trình tự chuỗi. Kỹ thuật này gồm có 4 bước chủ yếu sau đây (Theo thứ tự từng bước thực hiện): 1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu. 2, Ly trích và tinh sạch DNA của HBV. 3, Khuếch đại DNA vi rút bằng phản ứng PCR trong máy luân nhiệt. 4, Kiểm tra & phát hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trên gel Agarose. Sau đây là chi tiết và ý nghĩa của mỗi bước thực hiện. 3.1.1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu. Yêu cầu của mẫu máu: Serum, plasma (tuyệt đối không dùng Heparin) Tách serum hoặc plasma trong vòng 4 giờ sau khi lấy máu
Nếu chưa thực hiện ly trích DNA thì mẫu phải được lưu ở –20oC. Nếu gửi mẫu phải giữ mẫu trong đá khô là tốt nhất. Tránh hiện tượng phải rả đông mẫu máu nhiều lần. Máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất Dụng cụ lấy máu: Vô trùng, loại dùng một lần, thao tác đúng nguyên tắc vô trùng, có bao tay. 3.1.2, Ly trích và tinh sạch DNA của HBV. Phương pháp ly trích của chúng tôi chọn là hấp thụ DNA lên các hạt silica, rửa bằng Ethenol 70%. 3.1.3, Khuếch đại DNA virus bằng phản ứng PCR trong máy luân nhiệt. Áp dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng tr ùng hợp chuỗi). Đây là kỹ thuật khuếch đại một đoạn gen mà chúng ta cần khuếch đại, sau khi khuếch đại chúng ta có một số l ượng rất nhiều DNA để ứng dụng vào các lĩnh vực mà ta quan tâm. Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: (1) GIAI ĐOẠN BIẾN TÍNH:
Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lên đến 94o C, ở nhiệt độ này sẽ làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các men đều dừng lại (Ví dụ hoạt động kéo dài ở chu kỳ trước). Mục đích của giai đoạn này làm cho phân tử DNA tách ra làm đôi và được duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung. Hình minh họa giai đoạn biến tính: (2) GIAI ĐOẠN BẮT CẶP: Các Primer (Các đoạn mồi) có gắn Biotin là các đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn trong ống mẫu sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gen khuếch đại. Ví dụ như ta cần khuếch đại đoạn gene của HBV thì chỉ các primer cho HBV mới bắt cặp được với các gen của HBV có trong ống mẫu, còn các gen của các loài khác sẽ không được bắt cặp (Đồng nghĩa với việc không khuếch đại được).
Hình minh họa giai đoạn bắt cặp: (3) GIAI ĐOẠN KÉO DÀI: Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng của men Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu có sẵn trong ống nghiệm vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu. Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp và kéo dài thuộc một chu kỳ của khuếch đại DNA. Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ thành 2 phân tử DNA giống hệt nhau, và sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ có khoảng 230 phân tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA). Như vậy khi số lượng DNA trong mẫu là vài triệu thì chỉ sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian khoảng 2- 3 giờ) ta đã có hàng nghìn tỷ bản sao, lượng DNA này đủ để ta làm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi.
Hình minh họa giai đoạn kéo dài: 3.1.4, Kiểm tra & phát hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trên gel Agarose. Sau khi đã thực hiện phản ứng PCR, ta điện di trên gel agarose 2%, mục đích chủ yếu của bước này là xem có sản phẩm của PCR không và đánh giá kích thước của sản phẩm khuếch đại có đúng là đoạn dài như ta đã biết (Có nghĩa là có bắt cặp của primer và chiều dài của amplicon đúng cho HBV). 3.2, THỰC HIỆN PHẢN ỨNG CẮT (CLIP). Về nguyên tắc của phản ứng này giống hệt phản ứng PCR (Cũng gồm có 3 b ước: Biến tính, bắt cặp và kéo dài). Tuy nhiên có một điểm khác biệt cực kỳ căn bản là thành phần các Nu trong Clip buffer để khuếch đại ngoài A, T, G, C còn có thêm dd Nucleotides. Như vậy trong ống nghiệm của phản ứng clip sẽ có các thành phần sau: DNA đích cần cho phản ứng clip
2 cặp mồi chuyên biệt. A, C, G, T Deoxynucleotides Triphosphate A, C, G, T DiDeoxynucleotides Triphosphate DNA Polymerase Trong giai đoạn kéo dài của phản ứng clip (Giống giai đoạn kéo dài của phản ứng PCR), lúc các Nu dưới tác động của men Polymerase gắn vào cặp mồi sẽ có sự gắn ngẫu nhiên của các dd Nucleotides, khi đó thì sự kéo dài sẽ lập tức ngừng lại ở vị trí đó (Là vị trí ta đã biết). Ví dụ ở ống cho vào A DiDeoxynucleotides Triphosphate thì sự kéo dài sẽ dừng lại ở vị trí A, như vậy sau phản ứng Clip ta sẽ có các phân tử dài ngắn khác nhau mà có đuôi tận cùng là Adenine. Khi đi ện di trong gel có độ ly giải cao (Có thể phân biệt sự dài ngắn khác nhau chỉ 1 Nu) ta sẽ có các trình tự của Nu, dựa vào phần mềm của máy sẽ cho ra được trình tự chuỗi của DNA HBV. So sánh trên thư viện gen của máy tính se cho ta biết kiểu gen của vi rút này là kiểu gen nào và các đột biến đã được công bố của HBV (Bao gồm các đột biến kháng thuốc). HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI TRUGENE
ĐIỆN DI RA CÁC VẠCH DÀI NGẮN KHÁC NHAU
HÌNH MINH HỌA CỦA CÁC ĐOẠN DNA VỚI SỰ NGƯNG KÉO DÀI Ở VỊ TRÍ ADENINE. TỪ ĐÓ TA BIẾT TRÌNH TỰ TRONG CHUỖI DNA CỦA ADENINE. TƯƠNG TỰ TA BIẾT TRÌNH TỰ CHUỖI CỦA T, G, C
KẾT QUẢ TRÌNH TỰ CHUỖI CÓ ĐƯỢC SAU KHI KẾT HỢP CẢ 2 CHIỀU ĐIỆN DI, TỪ KẾT QUẢ NÀY SẼ ĐƯỢC SO VỚI THƯ VIỆN GEN CỦA MÁY ĐỂ CÓ KIỂU GEN VÀ CÁC ĐỘT BIẾN III, VAI TRÒ CỦA KIỂU GEN VI RÚT B.
Không giống như kiểu gen của vi rút viêm gan C, vai trò của kiểu gen vi rút viêm gan B cho đến nay vẫn chưa được biết rõ ràng. Nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu gen HBV đã được đặt ra và các nhà chuyên môn vẫn đang cố gắng để trả lời: (1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng nhân đôi của vi rút, hoạt tính của bệnh gan, sự khỏi bệnh, và đáp ứng với điệu trị. (2) Kiểu gen nào chủ yếu ở các nước. Sự phân bố kiểu gen HBV theo các vùng địa lý có liên quan với dịch tể nhiễm HBV. (3) Anh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến đến viêm gan B mạn tính. (4) Khi nhiễm với một kiểu gen này thì có được bảo vệ khỏi nhiễm với kiểu gen khác không. Cho đến hiện nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số liệu không được nhiều cũng như các kết quả chưa được thống nhất hoàn toàn. Kiểu gen HBV ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, chủ yếu là kiểu gen B và C. Có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa kiểu gen HBV và các đột biến ở vùng Precore và Core Promoter: Ki ểu gen B, C và D thường có đột biến hơn kiểu gen A. Về độ thanh thải HBeAg và kiểu gen HBV, các nghiên cứu trên bệnh nhân Châu Á cho thấy ở kiểu gen B có sự thanh thải HBeAg cao hơn so với kiểu gen C.
Mối quan hệ giữa kiểu gen vi rút viêm gan B và diễn tiến của bệnh cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rối loạn chức năng gan hình như ít gặp ở kiểu gen B so với kiểu gen C, và kiểu gen C thì thường gặp ở bệnh nhân xơ gan. Vai trò của kiểu gen HBV và đáp ứng điều trị cũng được quan tâm. Trong điều trị với Interferon, kiểu gen A có đáp ứng điều trị tốt nhất, kiểu gen B có đáp ứng điều trị tốt hơn kiểu gen C. Đối với Lamivudine, kiểu gen B dễ phát triển kháng thuốc hơn. IV, CÁC ĐỘT BIẾN CỦA VI RÚT B Hơn một thập kỷ nay, nhiều kiểu đột biến của HBV đã được nhận diện. Đa số các đột biến này là thầm lặng hoặc không có một ý nghĩa lâm sàng nào, tuy nhiên có một số đột biến có ý nghĩa trong quá trình diễn tiến của bệnh từ việc tiêm chủng phòng ngừa (S escape mutants), diễn tiến tự nhiên của bệnh (Pre-core, Core promoter, Core mutations), đến đột biến gây kháng thuốc đặc trị (DNA Polymerase mutations) và đột biến liên quan đến ung thư tế bào gan (X mutants). 1, Đột biến trên gen S (S mutants): Một số đột biến trên gen S có ý nghĩa là đột biến “thoát”, ví dụ như đột biến G145A, làm cho việc tiêm ngừa không có hiệu quả và bệnh nhân vẫn nhiễm bệnh. 2, Đột biến vùng trước lõi (Pre-core) và Core promoter: Đột biến hay gặp là đột biến Pre core (G1896A), từ đó làm không tạo ra HBeAg cho nên dù tình trạng vi