Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu (Nilarpavata Lugens Stal) ở một số giống lúa (Oryza Sativa L.)

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Tập 75A, Số 6, (2012), 83-90<br /> <br /> XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN KHÁNG RẦY NÂU (NILARPAVATA<br /> LUGENS STAL) Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA (ORYZA SATIVA L.)<br /> Phạm Thị Thanh Mai2, Nguyễn Thị Như Ý1, Hoàng Thi Kim Hồng1<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế<br /> <br /> Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Cao đẳng Lương thực thực phẩm Đà Nẵng<br /> <br /> Tóm tắt. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử STS BpE18-3 liên kết<br /> với gen bph1, chỉ thị KAM4 liên kết với gen bph2 và chỉ thị RG457 liên kết với gen bph10<br /> để xác định sự hiện diện của 3 gen bph1, bph2 và bph10 trong các giống lúa IRRI 352, BG<br /> 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước. Đây là những giống lúa có khả năng kháng rầy nâu,<br /> đã được Trung tâm Tài nguyên Thực vật, viện Khoa học Nông Nghiệp, Hà Nội, đánh giá và<br /> xếp loại về khả năng kháng rầy. Các giống lúa này được đưa về trồng ở Thừa Thiên Huế<br /> vào vụ Hè Thu năm 2010, thông qua việc theo dõi khả năng sinh trưởng, phát triển và đánh<br /> giá một số chỉ tiêu liên quan đến năng suất và phẩm chất, chúng tôi tiến hành thăm dò sự<br /> hiện diện của các gen kháng rầy. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các giống IRRI 352, BG<br /> 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc Nước đều có sự diện diện của gen bph1. Ba giống IRRI<br /> 352, BG 367-2, Lốc Nước có sự hiện diện của gen bph2. Giống BG 367-2 có sự hiện diện<br /> của gen bph 10. Bốn giống lúa này là nguồn vật liệu quan trọng trong việc phát triển và lai<br /> tạo các giống lúa kháng rầy nâu, có năng suất cao ở Thừa Thiên Huế.<br /> Từ khóa: chỉ thị phân tử, gen kháng rầy nâu, lúa kháng rầy, quần thể rầy nâu.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Trong số các loại côn trùng hại lúa thì rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) là loại<br /> sâu hại nguy hiểm nhất (Murai và cộng sự, 2003), (Jena và cộng sự, 2010). Miền Trung<br /> Việt Nam nói chung, Thừa Thiên Huế nói riêng trong những năm gần đây, diện tích<br /> trồng lúa đã bị thu hẹp lại, trong khi đó dịch bệnh hại lúa, nhất là dịch rầy bùng phát<br /> làm giảm đáng kể năng suất lúa thu hoạch, gây thiệt hại nhiều cho người nông dân. Do<br /> vậy, việc chọn tạo được các giống lúa mang gen kháng rầy và có khả năng kháng bền<br /> vững với quần thể rầy nâu là một trong những hướng nghiên cứu hiện nay rất được quan<br /> tâm. Phương pháp chọn giống lúa kháng rầy nâu thông qua chỉ thị phân tử liên kết với<br /> gen kháng rầy là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi, vô cùng thuận lợi cho các nhà<br /> chọn giống (Nguyễn Thị Lang, 2005) .<br /> Chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các gen sẽ được sử dụng để chọn lọc cá thể<br /> ngay ở giai đoạn sớm mà không phải phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Chọn giống<br /> dưới sự hỗ trợ của MAS (chọn giống nhờ marker phân tử) rất có hiệu quả trong tạo<br /> 83<br /> <br /> Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu…<br /> <br /> 84<br /> <br /> giống lúa kháng bệnh bạc lá và kháng rầy nâu, cà chua chịu bệnh nấm sương, đậu tương<br /> kháng được sâu đục quả… Kỹ thuật chỉ thị phân tử đảm bảo cho các nhà chọn tạo giống<br /> nhận diện chính xác các gen liên quan ở bất cứ bộ phận nào của cây ở giai đoạn sớm mà<br /> không bị chi phối bởi điều kiện môi trường và thời gian tạo giống rút ngắn xuống 2-3<br /> năm (Lê Thị Muội, Đinh Thị Phòng, 2004). Hiện nay, có nhiều giống cây trồng mới có<br /> mang gen kháng sâu bệnh đã được nhận diện bằng phương pháp chỉ thị phân tử (Huang<br /> và cộng sự, 1997), (Zheng và cộng sự, 1995)<br /> Ishii và đồng tác giả (1994) đã thiết lập bản đồ RFLP và xác định gen bph10<br /> kháng biotype 2 và 3, định vị trên nhiễm sắc thể 12 liên kết với RG457. Cặp primer<br /> được thiết kế từ RG457 (chỉ thị STS) đã phát hiện được gen kháng rầy nâu bph10 với<br /> khoảng cách di truyền 1,7cM trên quần thể lúa hoang Oryza australiensis và các dòng<br /> con lai (Lang và cộng sự, 1999).<br /> Nhóm nghiên cứu Kim và đồng tác giả (2005) đã sử dụng các dòng lúa kháng<br /> rầy nâu để xác định chỉ thị phân tử đối với gen kháng rầy nâu biotype 1. Dựa trên 520<br /> primer RAPD, các tác giả đã thiết kế được chỉ thị STS BpE 18-3 liên kết với gen kháng<br /> rầy nâu bph1, khoảng cách di truyền là 3.9 cM (Kim và cộng sự, 2005). Dựa trên các<br /> chỉ thị AFLP, Murai và đồng tác giả (2001) đã thiết kế marker STS KAM4 liên kết chặt<br /> với gen bph2. Kết quả nghiên cứu này hứa hẹn khả năng ứng dụng của chỉ thị STS trong<br /> phương thức chọn giống nhờ marker phân tử.<br /> 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bốn giống lúa được đánh giá khả năng<br /> kháng rầy dựa vào kiểu hình, bao gồm: IRRI 352, BG 367-2, Sài Đường Kiến An, Lốc<br /> Nước. Đây là những giống lúa lai tạo từ các nguồn khác nhau do Trung tâm Tài nguyên<br /> Thực vật, Viện Khoa học Nông Nghiệp, Hà Nội cung cấp. Điểm kháng rầy ở bảng 1 đã<br /> được đánh giá và phân cấp dựa trên tiêu chuẩn IRRI (IRRI, 1996).<br /> Bảng 1. Các giống lúa dùng làm nguyên liệu nghiên cứu<br /> <br /> Kí hiệu<br /> <br /> Tên giống<br /> <br /> Nguồn nhập<br /> <br /> Điểm kháng rầy<br /> <br /> L1<br /> <br /> IRRI 352<br /> <br /> Nghĩa Hưng, Nam Định<br /> <br /> 1<br /> <br /> L3<br /> <br /> BG 367-2<br /> <br /> IRRI<br /> <br /> 1<br /> <br /> L25<br /> <br /> Sài Đường Kiến An<br /> <br /> IRRI<br /> <br /> 3<br /> <br /> L27<br /> <br /> Lốc Nước<br /> <br /> IRRI<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của lúa<br /> Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp Kang và cs (2003).<br /> <br /> PHẠM THỊ THANH MAI, NGUYỄN THỊ NHƯ Ý, HOÀNG THI KIM HỒNG<br /> <br /> 85<br /> <br /> Lá mạ non (0,5-1 g) của cây lúa sau khi gieo 20 ngày, được nghiền thành bột mịn trong<br /> dung dịch nitơ lỏng, sau đó cho vào ống eppendorf (khoảng 2/3 thể tích ống). Bổ sung<br /> 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA) và 20%<br /> SDS; pH 7,5 vào mỗi ống eppendorf ở trên và ủ ở 65oC trong 30 phút. Mẫu được chiết 2<br /> lần với một thể tích tương đương của phenol và chloroform. Sau khi chiết DNA được<br /> kết tủa bằng 2 thể tích 100% ethanol lạnh. Rửa kết tủa DNA bằng 70% ethanol lạnh và<br /> làm khô mẫu bằng máy cô chân không (Modul 3180C, BioTron). Tiểu thể DNA được<br /> hòa tan trong 20 L nước cất vô trùng, sau đó xử lý bằng enzyme RNase để sử dụng cho<br /> các thí nghiệm về sau.<br /> Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ<br /> (SmartSpec3000, BioRad) ở bước sóng λ260/280 nm. Chất lượng DNA được kiểm tra<br /> bằng điện di trên agarose gel 0,8% ở 100V. Đệm điện di được sử dụng là 1 TAE (0,04<br /> M Tris-acetate và 0,001 M EDTA). Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch<br /> ethidium bromide (EtBr) (0,5 g/L) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel<br /> Documentation (BioRad).<br /> 2.2.2. Phản ứng PCR<br /> Sử dụng cặp mồi BpE18-3 (F:5′-CGCTGCGAGAGTGTGACACT-3′; R:5′TTGGGTTACACGGGTTTGAC-3′) để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu<br /> bph1 ở các giống lúa nghiên cứu (Kim và cộng sự, 2005).<br /> Sử dụng cặp mồi KAM4 (F:5′-TAACTGGTGTTAGTGCGAATGC-3′, R:5′AATTCACGGCATGTGAAGCCCTAG-3′), để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy<br /> nâu bph2 ở các giống lúa nghiên cứu (Murai và cộng sự, 2001).<br /> Sử dụng cặp mồi RG 457FL/RL (F: 5'-GCAGTGGCAGATGGGATCGT-3’, R:<br /> 5'-GCTCCGAAATCCCAAGCGAT- 3'), để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy<br /> nâu bph10 ở các giống lúa nghiên cứu (Lang và cộng sự, 1999).<br /> PCR được thực hiện trong tổng số 50 µL dung dịch phản ứng gồm 250 ng - 300<br /> ng DNA tổng số, 10 pmol mỗi loại mồi (mồi xuôi, mồi ngược), 2  Master mix<br /> (GoTaq® Green Master Mix 2, Promega). Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành<br /> trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 95oC-5 phút; 30 chu kỳ:<br /> 95oC-1 phút, 55oC đến 60oC-1 phút và 72oC-1 phút; 72oC-10 phút<br /> Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong<br /> đệm 1TAE. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch Ethidium bromide (EtBr; 0,5<br /> µg/mL) và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel<br /> Documentation (BioRad).<br /> 2.2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme HinfI<br /> Thành phần phản ứng cắt bao gồm: 3,2 µl nước cất; 1,5 µl buffer (10X); 0,3 µl<br /> enzyme HinfI (10U/µl); 10 µl sản phẩm PCR.<br /> <br /> 86<br /> <br /> Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu…<br /> <br /> Hỗn hợp trên được ủ ở 37oC trong 1,5h; sau đó ủ 4oC qua đêm.<br /> Điện di sản phẩm cắt trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1TAE.<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> 3.1. Tách chiết DNA tổng số của các giống lúa<br /> DNA tổng số được tách chiết từ 0,5-1 g lá mạ non được hòa tan trong 20 μL<br /> nước cất vô trùng. Nồng độ DNA tổng số được xác định bằng máy quang phổ<br /> (SmartSpec3000, BioRad) đạt từ 4 μg/μL đến 6 μg/μL. Độ tinh sạch của DNA được<br /> xác định ở bước sóng λ260/280 nm cho kết quả từ 1,80 đến 1,90. Chất lượng DNA tổng số<br /> còn được kiểm tra bằng điện di agarose gel 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 1.<br /> <br /> L1<br /> <br /> L3<br /> <br /> L25<br /> <br /> L27<br /> <br /> Hình 1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của bốn giống lúa<br /> L1: IRRI 352; L3: BG 367-2; L25: Sài Đường Kiến An; L27: Lốc Nước<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy DNA tổng số không bị đứt gãy thành các đoạn nhỏ, sạch<br /> và đảm bảo chất lượng cho việc phân tích PCR trong các mẫu lúa cần nghiên cứu.<br /> 3.2. Xác định sự hiện diện của gen bph1<br /> <br /> 500 bp<br /> <br /> SM<br /> <br /> L1<br /> <br /> L3<br /> <br /> L25<br /> <br /> L27<br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi BpE18-3<br /> SM: Chuẩn kích thước DNA (1kb DNA Ladder),<br /> L1: IRRI 352, L3: BG 367-2, L25: Sài Đường Kiến An, L27: Lốc Nước<br /> <br /> PHẠM THỊ THANH MAI, NGUYỄN THỊ NHƯ Ý, HOÀNG THI KIM HỒNG<br /> <br /> 87<br /> <br /> Kết quả PCR với cặp mồi BpE18-3 được trình bày ở hình 2, từ kết quả này cho<br /> thấy tất cả các giống lúa nghiên cứu đều có băng DNA khuếch đại với kích thước<br /> khoảng 523 bp. Các băng DNA khá rõ chứng tỏ tính đặc hiệu cao của mồi. Theo báo<br /> cáo của Kim và cộng sự (2005), giống Samgangbyeo là giống lúa kháng rầy có mang<br /> gen kháng rầy nâu biotype 1, sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu BpE18-3 cho băng ở<br /> kích thước 523bp. Nagdongbyeo giống nhiễm rầy nâu, không có băng ở vị trí đó. Bước<br /> đầu chúng tôi có thể kết luận ở 4 giống lúa nghiên cứu là IRRI 352, BG 367-2, Sài<br /> Đường Kiến An, Lốc Nước đều có sự hiện diện của gen bph1.<br /> 3.3. Xác định sự hiện diện của gen bph2<br /> <br /> 250 bp<br /> <br /> SM<br /> <br /> L1 L3<br /> <br /> L25 L27<br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi KAM4<br /> SM: Chuẩn kích thước DNA (1kb DNA Ladder),<br /> L1: IRRI 352, L3: BG 367-2, L25: Sài Đường Kiến An, L27: Lốc Nước<br /> <br /> Kết quả PCR với cặp mồi KAM4 trình bày ở hình 3 cho thấy giống Sài Đường<br /> Kiến An không có đoạn DNA được khuếch đại. Ba giống lúa còn lại xuất hiện băng<br /> DNA ở kích thước khoảng 300bp, theo nghiên cứu của Murai và cộng sự (2001) thì chỉ<br /> thị KAM4 liên kết chặt chẽ với gen bph2, băng đa hình được khuếch đại bởi cặp primer<br /> KAM4 sẽ cho kích thước 300bp, một số tác giả khác cũng đã sử dụng chỉ thị này trong<br /> việc xác định các giống lúa mang gen kháng rầy nâu (Sharma và cộng sự, 2004). Do<br /> vậy có thể kết luận ở 3 giống lúa nghiên cứu là IRRI 352, BG 367-2, Lốc Nước đều có<br /> sự hiện diện của gen bph2.<br /> 3.4. Xác định sự hiện diện của gen bph10<br /> Cặp mồi RG457L/L được thiết kế từ chỉ thị RFLP RG457, được chúng tôi sử<br /> dụng để khuếch đại đoạn chỉ thị liên kết với gen bph10 trong các giống lúa nghiên cứu.<br /> Sau khi điện di kết quả PCR với cặp mồi RG457FL/RL và kết quả cắt sản phẩm<br /> PCR bằng enzyme HinfI, chúng tôi thu được kết quả như hình 4 và hình 5. Ở hình 4,<br /> bốn giống lúa đều có sản phẩm PCR với kích thước xấp xỉ nhau khoảng gần 750bp. Tuy<br /> <br />