Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán sốt dengue/ sốt xuất huyết dengue

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÉT NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1<br /> TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE<br /> Phan Văn Bé Bảy*, Hoàng Tiến Mỹ**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm quan trọng<br /> nhất tại Việt Nam. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue trong huyết thanh<br /> bệnh nhân giúp phát hiện nhiễm virút Dengue trong giai đoạn sớm.<br /> Mục tiêu: Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và giá trị tiên đoán âm của xét<br /> nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag.<br /> Phương pháp: Tiền cứu, mô tả cắt ngang.<br /> Kết quả: Độ nhạy của xét nghiệm ELISA bằng kít Platelia™ Dengue NS1 Ag là 94,90%, độ đặc hiệu là<br /> 100%, giá trị tiên đoán dương là 100% và giá trị tiên đoán âm là 94,44%.<br /> Kết luận: Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 của virút Dengue có thể ứng dụng rộng rãi<br /> để chẩn đoán sớm sốt Dengue/SXH Dengue.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ELISA TO DETECT NS1 ANTIGEN FOR THE DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER<br /> AND DENGUE HAEMORRHAGIC FEVER<br /> Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 249 - 255<br /> Background: Dengue fever/Dengue haemorrhagic fever is one of the most important emerging<br /> infectious diseases in Vietnam. Recently, detecting NS1 Dengue antigen in patients’ sera has been described<br /> as an alternative method for early diagnosis.<br /> Objectives: Evaluating the sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative<br /> predictive value of the Platelia™ Dengue NS1 Ag.<br /> Method: Prospective, description, cross-sectional study<br /> Results: The sensitivity, the specificity, the positive predictive value and the negative predictive value<br /> are 94.9%, 100%, 100%, 94.44%, respectively.<br /> Conclusion: Detecting NS1 Dengue antigen can be used in early Dengue fever and Dengue<br /> haemorrhagic fever diagnosis.<br /> vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương.<br /> ĐẶT VẤNĐỀ<br /> Có khoảng 2,5-3,0 tỉ người sống trong vùng có<br /> Sốt Dengue (SD)/sốt xuất huyết (SXH)<br /> nguy cơ bị nhiễm bệnh, ước tính số trường<br /> Dengue là bệnh nhiễm virút cấp tính gây ra<br /> hợp mắc hàng năm khoảng 50-100 triệu người,<br /> bởi 4 týp virút Dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3<br /> trong đó hơn 90% trường hợp là trẻ em dưới<br /> và DEN-4. Bệnh được truyền từ người sang<br /> 15 tuổi(3,8,23,32,33). Sốt Dengue/SXH Dengue vẫn<br /> người qua trung gian muỗi Aedes aegypti. Bệnh<br /> còn là thách thức cho các nhà dịch tể học lẫn<br /> đang lưu hành trên 100 quốc gia thuộc các khu<br /> thầy thuốc lâm sàng và vẫn chưa có vắcxin<br /> vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới ở<br /> phòng bệnh(17).<br /> * Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Đồng Tháp ** Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP. HCM<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa<br /> <br /> 1<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Tại Việt Nam, sốt Dengue/ SXH Dengue là<br /> một trong những bệnh truyền nhiễm có tỉ lệ<br /> mắc và chết cao nhất ở trẻ em và bệnh đã và<br /> đang trở thành vấn đề y tế nghiêm trọng.<br /> Trong năm 2007, trong 20 tỉnh thành khu vực<br /> phía Nam ghi nhận có 87.950 trường hợp mắc<br /> và có 81 trường hợp chết. Đồng Tháp là một<br /> trong những tỉnh có số mắc và chết cao nhất<br /> trong khu vực này với số mắc là 13.012 và có 9<br /> trường hợp tử vong(4,5,6,11).<br /> <br /> xét nghiệm này trên người Việt Nam còn chưa<br /> được ghi nhận đầy đủ.<br /> <br /> NS1 của virus Dengue là 1 glycoprotein,<br /> trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2<br /> dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết<br /> (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài.<br /> Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác<br /> định đầy đủ nhưng người ta nhận thấy nó<br /> tham gia vào quá trình sao chép RNA của<br /> virút, cần thiết cho sự tồn tại của virút (20,33).<br /> Lượng NS1 dạng tiết (sNS1) có nồng độ cao<br /> trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm virút<br /> Dengue trong giai đoạn sớm khi có biểu hiện<br /> lâm sàng và có liên quan với mức độ virút<br /> trong máu(22).<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU<br /> <br /> Nhiễm virút Dengue hiện nay được phát<br /> hiện bằng nhiều xét nghiệm như: phân lập<br /> virút, phản ứng chuỗi polymerase sao chép<br /> ngược (RT-PCR), ELISA phát hiện kháng<br /> nguyên, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu<br /> (HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men<br /> (MAC-ELISA, GAC-ELISA), thử nghiệm miễn<br /> dịch nhanh (sắc ký miễn dịch). Tuy nhiên một<br /> số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền,<br /> một số thì không phát hiện sớm được bệnh do<br /> đáp ứng kháng thể chậm, khi bệnh nhân đã<br /> qua giai đoạn cấp(1,3,16,23,24,25,28,31,33). Vì vậy, việc<br /> phát hiện sớm và chính xác là một nhu cầu cần<br /> thiết cho cả thầy thuốc lẫn bệnh nhân.<br /> Gần đây hãng Bio-Rad cung cấp bộ kit<br /> phát hiện kháng nguyên NS1 của virút bằng<br /> kỹ thuật ELISA. Đây là một hứa hẹn khả quan<br /> tại Việt Nam bởi vì xét nghiệm này có thể phát<br /> hiện bệnh sớm trong giai đoạn bệnh nhân còn<br /> sốt hơn nữa không đòi hỏi phương tiện đắt<br /> tiền(2,22,28,29,33,34,35). Tuy nhiên, hiện nay giá trị của<br /> <br /> 2<br /> Chuyên Đề Nội Khoa<br /> <br /> Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Xét<br /> nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên NS1<br /> trong chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết<br /> Dengue” nhằm đạt được những mục tiêu: xác<br /> định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán<br /> dương và giá trị tiên đoán âm của xét nghiệm<br /> ELISA phát hiện kháng nguyên NS1 bằng kít<br /> Platelia™ Dengue NS1 Ag.<br /> <br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Tiền cứu, mô tả cắt ngang.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Nhóm nghiên cứu: 196 mẫu máu được xác<br /> định nhiễm virút Dengue bằng xét nghiệm MACELISA Dengue (mẫu máu lần 1, khi bệnh nhân<br /> mới vào viện, là âm tính và mẫu máu lần 2, từ<br /> ngày sốt thứ 6 trở đi là dương tính).<br /> Nhóm chứng âm: 170 mẫu máu từ người<br /> khỏe mạnh hiến máu tình nguyện, có xét<br /> nghiệm MAC-ELISA Dengue âm tính.<br /> <br /> Địa điểm và thời gian nghiên cứu<br /> Nghiên cứu được thực hiện từ 29/09/06 đến<br /> 29/08/07 tại Khoa Nhiễm và Khoa Vi sinh-Bệnh<br /> viện Đồng Tháp.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> - Kỹ thuật xét nghiệm: xét nghiệm MACELISA Dengue (bộ kít do Labô Arbovirus Khoa Vi sinh Miễn Dịch - Viện Pasteur Thành<br /> phố Hồ Chí Minh sản xuất), xét nghiệm ELISA<br /> phát hiện kháng nguyên NS1 (bộ kít Platelia™<br /> Dengue NS1 Ag do hãng Bio-Rad<br /> Laboratories, Marnes La Coquette, Pháp sản<br /> xuất). Xác định týp virút Dengue bằng kỹ<br /> thuật TaqMan Real time RT-PCR thực hiện tại<br /> Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng thuộc Đại học<br /> Offord - Anh quốc tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt<br /> Đới Thành phố Hồ Chí Minh với các mẫu máu<br /> lấy lần thứ nhất khi bệnh nhân nhập viện.<br /> - Nguyên tắc của kỹ thuật ELISA phát hiện<br /> kháng nguyên NS1: áp dụng nguyên tắc miễn<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009<br /> dịch men kiểu sandwich một bước trên plaque.<br /> Bệnh phẩm và chứng được ủ trực tiếp, cùng<br /> lúc với cộng hợp trong các giếng đã gắn với<br /> kháng thể đơn dòng từ chuột (MAb) ở nhiệt<br /> độ 37ºC trong 90 phút. Nếu mẫu có kháng<br /> nguyên sẽ tạo thành phức hợp MAb-NS1MAb/peroxidase. Sau khi rửa, phức hợp miễn<br /> dịch được biểu hiện khi thêm vào giếng dung<br /> dịch sinh màu để khởi đầu cho phản ứng tạo<br /> màu. Sau khi ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng,<br /> ngừng phản ứng bằng dung dịch acid. Đọc kết<br /> quả bằng quang phổ kế với bước sóng 450/620<br /> nm. Sự hiện diện kháng nguyên NS1 trong<br /> mẫu được xác định bằng cách so sánh độ hấp<br /> thu của mẫu thử (OD) với độ hấp thu của<br /> ngưỡng phát hiện (CO).<br /> - Thu thập dữ liệu từ bệnh nhân và kết quả<br /> xét nghiệm.<br /> - Xử lý số liệu bằng phần mềm Stata 8.0.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Một số đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu<br /> Trong 196 mẫu nghiên cứu, có 102 nam<br /> (52,04%) và 94 nữ (47,96%). Độ tuổi trung bình là<br /> 11,18 ± 6,36 (2-35). Số trẻ em