zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Bài giảng Thí nghiệm vi sinh vật học - Nguyễn Thanh Hòa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Báo xấu

25
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Thí nghiệm vi sinh vật học - Nguyễn Thanh Hòa" trình bày các nội dung chính sau đây: Môi trường dinh dưỡng, các phương pháp gieo cấy vi sinh vật; Phân lập và định hướng vi sinh vật; Kính hiển vi, các loại tiêu bản quan sát vi sinh vật sống, quan sát nấm men;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thí nghiệm vi sinh vật học - Nguyễn Thanh Hòa

15/11/2021 AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Thí nghiệm vi sinh vật có thể là trải nghiệm lý thú và vui vẻ, tuy nhiên các bạn cần phải chú ý những nguy cơ tiềm ẩn. Một số nội quy trong phòng thí nghiệm các bạn phải chú ý như sau: ¢ Giữ gìn trật tự, vệ sinh của phòng. Bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối khi cấy truyền vi sinh vật. ¢ Tuyệt đối không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. ¢ Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dây ra quần áo, sách vở, dụng cụ cá nhân. Không tự ý sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC ¢ khi chưa được phép và chưa được hướng dẫn. GV: Nguyễn Thanh Hoà ¢ Kết thúc thí nghiệm và bài thực hành, các dụng cụ, thiết bị, hoá chất vừa sử dụng xong đều phải được vệ sinh theo đúng quy trình và xếp vào nơi quy định. ¢ Ghi nhật ký sử dụng thiết bị đầy đủ và theo đúng yêu cầu. ¢ Khi rời phòng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nước, khoá cửa. 1 2 NHỮNG QUY ĐỊNH VỀ AN TOÀN ¢ Khi sử dụng hoá chất cần đọc kỹ hướng dẫn sử dụng hoặc tuân theo BÀI 1: những hướng dẫn của kỹ thuật viên, cán bộ phòng thí nghiệm. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG ¢ Sinh viên sử dụng áo blouse khi thực hiện thí nghiệm CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT ¢ Những hoá chất độc hại phải được xử lý riêng, tuân theo yêu cầu của quản lý PTN ¢ Chất thải sinh học (vi sinh vật) phải được xử lý nhiệt (thanh trùng 121oC trong 30 phút) trước khi thải ra ngoài môi trường. ¢ Chất thải lỏng cần được phân loại (axit, bazơ, dung môi, dung dịch có kim loại nặng) và chứa vào các thùng đựng chất thải riêng biệt. ¢ Chất thải rắn (hoá chất, lọ đựng hoá chất) có tính chất độc hại phải để trong tủ hút và xử lý theo lịch riêng của nhà trường. ¢ Các dung môi độc hại, dễ bay hơi phải được tiến hành trong tủ hút. ¢ Trước khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay. 3 4 1
15/11/2021 I. KHÁI NIỆM CHUNG 1. Mục đích, ý nghĩa: Có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh vật. A. MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật. 2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng: Thành phần phải có : - Các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ), - Các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt,..), một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden,..). - Các yếu tố sinh trưởng: Phải cân đối về thành phần để đảm bảo các yêu cầu hóa lý như độ ẩm, độ nhớt, áp suất thẩm thấu, pH thích hợp Phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng. 3. Cách gọi tên : theo tên tác giả hoặc theo nguồn thức ăn N và C 5 6 II. PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG III. CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG 1. Theo thành phần 1. Pha chế : Môi trường tự nhiên Cân đong, pha chế chính xác theo đơn. Môi trường tổng hợp Thử pH môi trường. Môi trường bán tổng hợp Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng. 2. Theo mục đích sử dụng Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người Môi trường phổ dụng chuẩn bị. Môi trường riêng biệt Môi trường chuẩn đoán phân biệt 2. Lọc : tách cặn bã, bụi bẩn bằng phương pháp Lọc qua bông, vải màu, giấy lọc 3. Theo tính chất lý học ¢ ¢ Lọc bằng lòng trắng trứng Môi trường lỏng ¢ Dùng phễu lọc nóng Môi trường đặc Môi trường xốp 7 8 2
15/11/2021 III. CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG III. CÁCH LÀM MÔI TRƯỜNG 4. Khử trùng môi trường : tất cả môi trường đều phải vô 3. Phân phối môi trường trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm ¢ Môi trường được phân phối vào bình cầu, mà chọn chế độ thanh trùng. bình tam giác, ống nghiệm,.. sau thanh Phương pháp Pasteur : đun nóng phân đoạn ở trùng vào ống nghiệm hoặc hộp petri. nhiệt độ 60-75oC trong 15 đến 30 phút hay ở ¢ Thạch nghiêng khoảng 5ml 80oC trong thời gian 10-15 phút Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm ¢ Phương pháp Tinđan : thanh trùng ở nhiệt độ cao ¢ Hộp petri tráng đều dầy 3mm. liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất. 5. Bảo quản và kiểm tra môi trường 9 10 B. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT 11 12 3
15/11/2021 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY 1. ĐỊNH NGHĨA a. Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: tiến hành ¢ Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng). nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết cho nghiên cứu. ¢ Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống. Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Các dụng cụ cần thiết: que cấy nhọn hoặc vòng, pipet, que trang,.. 13 14 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY b. Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng Theo hình chữ chi Theo hình vòng xoắn Theo những đường song song Theo một đường thẳng c. Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng d. Cấy trên thạch hộp Hình chữ chi trên toàn mặt thạch Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp Theo các đường song song Chấm điểm Phương pháp cấy trên hộp thạch 15 16 4
15/11/2021 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY e. Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ Dùng pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọt canh trường trên mặt thạch Cấy bề sau ü Giống – ống nghiệm – hộp thạch ü Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường. Phương pháp cấy trên thạch hộp 17 18 CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM CÁC DỤNG CỤ TRONG THÍ NGHIỆM Hộp petri (wikipedia.org) Que cấy Cốc đong, ống nghiệm Chổi rửa Pipet (raylab.co.nz) Cốc đong (clarelibrary.ie) Giá đựng ống nghiệm Đèn cồn 19 20 5
15/11/2021 CÁC THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM BÀI 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 21 22 I. CANH TRƯỜNG TẬP TRUNG ¢ Canh trường tập trung : là canh trường trong đó một loài (có khi vài loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng. A. PHÂN LẬP VI SINH VẬT ¢ Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc là điều kiện chọn lọc để phân lập canh trường tập trung (môi trường hoặc điều kiện chỉ thích hợp cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển) 23 24 6
15/11/2021 A. PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG MÔI TRƯỜNG LỎNG II. CANH TRƯỜNG THUẦN KHIẾT Cách thực hiện : ¢ Canh trường thuần khiết : là canh trường mà tất cả các 1.Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế bào ban đầu. vô khuẩn ¢ Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện 2.Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên từ canh trường tập trung. cứu vào ống nghiệm thứ nhất ¢ Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết : 3.Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai v Phương pháp pha loãng môi trường lỏng 4.Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, v Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc bốn... v Phương pháp tách từng tế bào 5.Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên cho canh trường thuần khiết. Ví dụ : Pha loãng Pasteur 25 26 B. PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VSV ¢ Nguyên tắc : tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường ¢ Phương pháp tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cao đặc Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính protease cao Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính amylase cao ¢ Cách tiến hành : Tuyển chọn chủng VSV có hoạt tính cellulase cao 1. Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng trong các ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô Tuyển chọn chủng VSV có khả năng chịu mặn trùng Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VSV 2. Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô khuẩn 3. Nuôi ở điều kiện thích hợp 4. Sau 1 - 2 ngày, quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch 5. Nuôi ở nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết. 27 28 7
15/11/2021 TÁCH TỪNG GIỌT CHỈ CHỨA MỘT TẾ BÀO CÓ KIỂM TRA BẰNG KÍNH HIỂN VI C. PHƯƠNG PHÁP TÁCH TỪNG TẾ BÀO ¢ Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn (nấm men, bào tử nấm mốc) 1. Pha loãng Pasteur ( đến mức mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật) ¢ Cách tiến hành : có 2 cách 2. Dùng que cấy nhọn chấm từng giọt nhỏ canh trường đã pha 1. Tách từng giọt chỉ chứa một loãng lên lá kính vô khuẩn. Chấm thành ba bốn hàng và các tế bào có kiểm tra bằng kính giọt cách xa nhau vừa phải để dễ quan sát. hiển vi 3. Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dưới rồi đặt lên phiến kính lõm, bôi vazơlin quanh mép lá kính, giữ không cho 2. Tách từng tế bào nhờ dụng các giọt bị khô cụ vi thao tác 4. Quan sát dưới kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một (micromanipulateur) tế bào 5. Đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bông hoặc giấy lọc tẩm nước, đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp Micromanipulateur (www.lavallab.com) 29 30 III. PHÂN LẬP VI SINH VẬT YẾM KHÍ 2. DÙNG HỘP PETRI LỘN NGƯỢC III. Phân lập vi sinh vật yếm khí 1. Dùng pipet Pasteur 1. Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên 1. Pha loãng vật phẩm nghiên cứu, lấy 1 giọt cho vào ống thạch, lắc đều 2. Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy 2. Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín paraphin bôi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đầu nhỏ của pipet đã vô trùng và đặt lộn ngược trước). 3. Nuôi trong tủ ấm 1 – 2 ngày 3. Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách 4. Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trường khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trường nuôi thích hợp cấy thích hợp 31 32 8
15/11/2021 I. ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP ¢ Định nghĩa: là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu ¢ Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng ¢ Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm như vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm tiêu bản. B. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT ¢ Các phương pháp định lượng trực tiếp : 1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu 2. Phương pháp Brit 3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina 33 34 P HƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU PHƯƠNG PHÁP DÙNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU ¢ Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như ¢ Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường nấm men, bào tử nấm mốc ¢ Dùng bông tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính. ¢ Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu) ¢ Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô Buồng đếm hồng cầu lớn chéo nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô (Hemocytometer) vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong (wikipedia.org) mỗi ô. a.1000.f h.S trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô Ô màu Kích cỡ Diện tích f là hệ số pha loãng của canh trường Đỏ 1 x 1 mm 1 mm2 h là bề sâu của lưới đếm Xanh lục 0.25 x 0.25 mm 0.0625 mm2 Vàng 0.20 x 0.20 mm 0.04 mm2 S là diện tích một ô Da trời 0.05 x 0.05 mm 0.0025 mm2 1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm 3. 35 36 9
15/11/2021 PHƯƠNG PHÁP VINOGRATXKI - SUNGINA PHƯƠNG PHÁP BRIT ¢ Phạm vi sử dụng : dùng để định lượng vi sinh vật có ¢ Phạm vi sử dụng: dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn. trong sữa hay một số vật phẩm lỏng. ¢ Cách tiến hành: 1) Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh ¢ Cách tiến hành: rồi chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và 1) Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng để yên trong 1 - 2 giây. khi quan sát. 2) Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một 2) Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật diện tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm 2). phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lên phiến kính sạch với 3) Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, loãng (0,1%). Lại để khô và cố định bằng cồn tuyệt đối trong 5 phút. diện tích nhất định (2 - 4 cm2). 4) Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ. Trong quá trình nhuộm phải theo 3) Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen. dõi để thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi. 4) Để khô và quan sát dưới kính hiển vi và đếm 5) Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống như phương pháp Brit. 37 38 II. ĐỊNH LƯỢNG GIÁN TIẾP PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ KHUẨN LẠC PHÁT TRIỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH ¢ Định nghĩa: là phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo cấy một lượng ¢ Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36 - 48 giờ, hộp petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu. kết quả. ¢ Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn ¢ Cách tiến hành: ¢ Nhược điểm: 1) Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng : pha loãng Pasteur ( tỷ lệ 1:10) Tốn thời gian, công sức 2) Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc lỏng bằng cách: Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả chênh nhau 10 lần vào bình tam giác dung tích 250 ml đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng. Lắc Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trên. đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành 3) Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm một khuẩn lạc. Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật pha loãng cuối cùng lên hộp petri đã chứa sẵn môi trường vô trùng. có trong vật phẩm nghiên cứu. 4) Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc. Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển. 5) Đọc kết quả 39 40 10
15/11/2021 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ ¢ Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí ¢ Cách tiến hành: B ÀI 3 : 1) Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định KÍNH HIỂN VI. nghiên cứu. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT 2) Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp SỐNG. QUAN SÁT NẤM MEN và để vào tủ ấm. 3) Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc. ¢ Tính toán: đo đường kính hộp petri để tính điện tích rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki. 41 42 Cấu tạo kính hiển vi Cách sử dụng : 1. Dùng kính tụ quang điều chỉnh ánh sáng 2. Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính. 3. Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa. Đặt tiêu bản lên khay kính và mắt nhìn bên ngoài, điều chỉnh tiêu bản để chọn A. KÍNH HIỂN VI được vùng định quan sát. 4. Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản. Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản. Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính 5. Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng, khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét. 43 44 11
15/11/2021 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI 1. Bảo quản sau khi sử dụng kính ¢ Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ ¢ Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật sạch. ¢ Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu ¢ Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục. Xếp khăn lại, đặt lên khay kính B. CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT rồi hạ vật kính chạm sát khăn. ¢ Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon. Chuyển kính vào tủ lớn có hệ VI SINH VẬT SỐNG thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn. 2. Bảo quản thông thường và định kỳ ¢ Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo ¢ Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính. ¢ Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông. ¢ Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính. ¢ Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân kính, một tay đỡ đế kính. 45 46 I. TIÊU BẢN GIỌT ÉP 1. Phạm vi sử dụng : cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật Hình 1: Cách lấy giống vi sinh vật 2. Cách làm : 47 48 12
15/11/2021 II. TIÊU BẢN GIỌT TREO III. TIÊU BẢN VẾT 1. Phạm vi sử dụng : dùng để nghiên cứu sự phân bố tự nhiên của các tế bào trong khuẩn lạc vi sinh vật hoặc phổ biến hơn là để nghiên cứu hình thái của chuỗi bào tử và cách sắp xếp cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn, nấm mốc. 2. Cách làm : ¢ Dùng dao mổ cắt lấy một khối nhỏ môi trường thạch có cấy vi sinh vật đã mọc dày đặc hay mọc thành các khuẩn lạc riêng rẽ, đặt lên phiến kính sao cho phía có vi sinh vật nằm ở bên trên. ¢ Lấy một lá kính mỏng dặt lên, dùng que cấy vòng hay kẹp sắt (pince) ép nhẹ lá kính xuống rồi rút que cấy hay kẹp sắt ra ngay và giữ đúng vị trí của lá kính. ¢ Đặt tiêu bản nhận được lên một phiến kính đã có nhỏ sẵn một giọt nước hay một giọt dung dịch xanh metylen pha loãng 1/40, cho phần vết nằm ở phía dưới, ta sẽ thu được tiêu bản "vết". Cũng có thể dùng ngay phiến kính ép nhẹ lên bề mặt của khuẩn lạc hay bề mặt của đám vi sinh vật rồi lấy ra làm tiêu bản "vết" Phạm vi sử dụng: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học. 49 50 IV. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT SỐNG 1. Nguyên tắc : sử dụng thuốc nhuộm không độc hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. 2. Các loại thuốc nhuộm : xanh metylen hay fuchsin (1/1000), đỏ công gô 3%, đỏ trung tính từ 0,001 đến 0,00001% C. QUAN SÁT NẤM MEN 3. Cách làm: có hai cách ¢ Cách 1 1. Nhỏ một giọt thuốc nhuộm (không quá lớn) lên phiến kính 2. Lấy một giọt canh trường vi sinh vật, hòa đều với thuốc nhuộm. 3. Đậy lá kính lên và đem quan sát. ¢ Cách 2 1. Nhỏ một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính. Dùng que cấy dàn đều thành một vùng nhỏ rồi để khô tự nhiên 2. Nhỏ một giọt canh trường vi sinh vật lên vùng màu đã khô. 3. Đặt tiêu bản lên khay kính và quan sát. 51 52 13
15/11/2021 1. Đ ẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 1. Đặc điểm hình thái Nấm men có dạng : Hình cầu (Torulopsis utilis) ¢ Hình thái nấm men thay đổi trong quá trình phát triển : Hình trứng hay hình bầu dục Nấm men trẻ (qua 12 - 16 giờ nuôi cấy) màng mỏng, căng, nguyên sinh chất (Saccharomyces cerevisiae, đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản Saccharomyces ellipsoideus) chiếm tỷ lệ cao. Hình trụ (Pichia), Torulopsis utilis Nấm men trưởng thành (24 -48 giờ nuôi cấy) kích thước vuông, không bào (ageless.co.za) Hình quả dưa chuột lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm Pityrosporum ovale (Saccharomyces pasteurianus) (med.sc.edu) 10 -15%. Hình quả chanh yên (Kloekera) Nấm men đã già (nuôi cấy từ 72 giờ trở lên) màng dầy, nhăn, nguyên sinh Hình bình (Pityrosporum) chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn. Hình 1 đầu nhọn(Brettanomyces) Hình tam giác (Trigonopsis) ¢ Trong một số điều kiện môi trường mà một số nấm men có tế bào Một số hình dạng đặc biệt khác hình dài xếp nối nhau thành những đạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Saccharomyces cerevisiae Pichia farinosa (chemistrydaily.com) (anathenature.com) 53 54 2. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ 3. ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP 1)Dinh dưỡng: dị dưỡng cacbon, sống hoại sinh hoặc ký sinh. ¢ Đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất trong tự 2)Hô hấp: nấm men hô hấp tuỳ tiện nhiên, vô cơ hóa các chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường 3)Sinh sản: sinh sản theo lối nảy chồi hay tạo bào tử vô tính và sinh sản hữu tính sinh thái. nhờ kết hợp bào tử trái dấu. ¢ Sản xuất các dung môi hữu cơ ( sử dụng nấm men để nấu rượu, nấu bia, sản xuất cồn, glyxerin... ) 4)Khả năng tạo bào tử: Chỉ là một số nấm men và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định mới có khả ¢ Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzim, protein, năng hình thành bào tử. vitamin, axit amin … Nang bào tử hình thành trong các canh trường nghèo chất dinh dưỡng, nhất là ¢ Nấm men cũng được làm nở bột mỳ, gây hương nước chấm, sản nguồn cacbon. xuất một số dược phẩm... và gần đây còn được nghiên cứu sử dụng Nang bào tử thường chứa 1- 2 hoặc 4 bào tử. Một số ít loại có tới 8 bào tử. để sản xuất cả lipit. 5)Khả năng chuyển động: Nấm men không chuyển động 55 56 14
15/11/2021 II.C ÁC CHỈ TIÊU ĐỂ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CANH TRƯỜNG NẤM MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 1. ĐỘ THUẦN KHIẾT ¢ Người ta dựa trên 5 chỉ tiêu để đánh giá chất lượng ¢ Làm tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi canh trường nấm men : ¢ Nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có cùng đặc tính hình thái thì có thể sơ bộ kết luận độ sạch của canh 1. Độ thuần khiết trường 2. Tỷ lệ tế bào sống trên tổng số tế bào ¢ Nếu không, đếm số tế bào lạ trong năm đến bảy kính 3. Tỷ lệ tế bào nảy chồi trên tổng số tế bào trường, lấy trung bình rồi suy ra độ thuần khiết của canh 4. Số lượng tế bào trong 1 ml canh trường trường 5. Chỉ tiêu công nghệ 57 58 2. TỶ LỆ TẾ BÀO SỐNG TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO 3. TỶ LỆ TẾ BÀO NẢY CHỒI TRÊN TỔNG SỐ TẾ BÀO Nguyên tắc: Cách tiến hành: ¢ Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ dàng hơn đi qua ¢ Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH màng tế bào sống hoặc H 2SO 4 10% lên phiến kính trộn đều. Đậy lá kính ¢ Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu lại, đặt lên khay kính và quan sát. Đếm số tế bào chung và số tế bào đang nảy chồi rồi suy ra phần trăm. Cách tiến hành: ¢ Tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế ¢ Cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc nhuộm bào con bé hơn hoặc bằng 1/2 tế bào mẹ. (đã pha loãng 10 lần) lên phiến kính, nhẹ nhàng trộn đều, đậy Yêu cầu : trong canh trường nấm men giống đem lên lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát. Tế bào men, lượng tế bào đang nảy chồi ít nhất phải chiếm từ 10 chết bắt màu xanh còn tế bào sống không màu. đến 15%. Nếu canh trường đang ở giai đoạn sinh trưởng Yêu cầu : nấm men đang ở giai đoạn sinh trưởng lượng tế bào mạnh, số tế bào nảy chồi có thể đạt tới 70 - 80% chết không quá 2 - 4%. 59 60 15
15/11/2021 4. SỐ LƯỢNG TẾ BÀO TRONG 1 ML CANH TRƯỜNG 5. CHỈ TIÊU CÔNG NGHỆ l Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường l Dùng bông tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm hồng cầu, Chỉ tiêu này thường được đánh giá thông qua đặt lá kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính. khả năng của nấm men chuyển hóa nguyên liệu Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng l trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu) đầu vào hay tạo thành sản phẩm sau một thời l Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô gian nhất định. Việc xác định lượng sản phẩm lớn chéo nhau tức là 80 ô vuông nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô tạo thành giúp đánh giá chính xác và dễ thực vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô. hiện hơn. a.1000.f h.S trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô f là hệ số pha loãng của canh trường h là bề sâu của lưới đếm S là diện tích một ô 1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000mm 3. 61 62 LÀM VẾT BÔI VÀ CỐ ĐỊNH VẾT BÔI B ÀI 4 : LÀM TIÊU BẢN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH QUAN SÁT VI KHUẨN Escherichia coli Staphylococcus epidermidis 63 64 16
15/11/2021 N HUỘM MÀU PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Nguyên tắc : Nguyên tắc: Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc ¢ Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie, với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng, bền vững. khi nhuộm phức chất này kết hợp với loại thuốc Thuốc nhuộm thường dùng là các chất màu anilin, chủ yếu là loại kiềm và trung tinh. nhuộm triphenylmetan (như gential violet, crystal ¢ Vì thành phần hóa học của tế bào các loài vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế bào rất violet, metyl violet...) và iôt sẽ cho màu tím rất bèn khác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu không giống nhau. Tùy theo mục đích nghiên vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi sinh vật cứu mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp. có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương (+) nếu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-) . Các phương pháp : nhuộm màu đơn giản và nhuộm màu phức tạp Dựa vào khả năng bắt màu gram người ta chia vi sinh vật thành hai nhóm: ¢ Gram dương (+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn, các trực khuẩn hiếu khí có bào tử (Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn... ¢ Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột như Bacterium coli, Bacterium typhi, Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vi khuẩn axetic... Biến đổi màu tế bào trong quá trình nhuộm Gram 65 66 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM B. QUAN SÁT VI KHUẨN 67 68 17
15/11/2021 Q UAN SÁT VÀ PHÂN BIỆT BỐN LOÀI NẤM MỐC C. QUAN SÁT NẤM MỐC ĐIỂN HÌNH : M UCOR, R HIZOPUS, A SPERGILUS VÀ P ENICILLIUM 69 70 MUCOR VÀ RHIZOPUS ASPERGILUS VÀ PENICILLIUM Sợi nấm đa bào, đầu sợi Sợi nấm đơn bào, chúng nấm mang bào tử phình to có khả năng tạo thành ra , tạo thành các tế bào bào tử nang (bào tử nội hình chai (hay thể bình) rồi sinh). Sợi màu trắng, hình thành chuỗi đính bào bào tử nang hơi vàng. tử (bào tử ngoại sinh). Mucor Rhizopus Aspergilus Penicillium Cuống của bào tử nang phân Cuống bào tử nang không phân Cuống của đính bào tử đơn bào. Cuống đính bào tử đa bào, đầu nhánh và mọc lên ở bất kỳ vị trí nhánh, chỉ mọc lên ở những chỗ sợi các tế bào hình chai và đính bào tử cuống phân nhánh nhiều lần thành nào của sợi nấm. nấm ăn sâu vào môi trường, cuống tỏa đều trên đầu sợi nấm sinh sản những đốt song song rồi mới hình bào tử mọc thành cụm ba bốn cái ở như những tia nước đi ra đầu vòi thành đính bào tử. Các tế bào hình chân của cụm này có mọc ra nhiều tưới. chai đính bào tử hướng lên cùng một sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường trông phía giống như cây chổi giống rễ bụi lúa gọi là rễ giả 71 72 18

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.