Bài giảng Thực hành vi sinh vật học - Đào Hồng Hà

Chia sẻ: Bạch Khinh Dạ Lưu | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:146

Thêm vào BST

Báo xấu

46
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực hành vi sinh vật học - Đào Hồng Hà cung cấp cho học viên các kiến thức về những quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật; thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm vi sinh vật và các phương pháp tiệt trùng vi sinh vật; phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật; phương pháp nuôi cấy vi sinh vật; phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực hành vi sinh vật học - Đào Hồng Hà

BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC Đào Hồng Hà
NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật. Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính. Chính vì thế, người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các qui tắc cơ bản sau đây: 1. Những qui định chung: Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm. Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng. Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm. Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất. Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép. Tất cả các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để đúng nơi qui định. Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát trùng cồn 70% hoặc dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh. Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người là thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm,… Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách vở và dụng cụ cá nhân. Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm. Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn. Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không hút bằng miệng. Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể. Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng. Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng. Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng qui trình và sắp xếp vào đúng nơi qui định. Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời và xử lý. 2. Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết quả tốt trong thực hành vi sinh vật a. Trước khi thực hành Cần đọc bài trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ Trang 2
làm. Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm. Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm b. Trong giờ thực hành: Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và qui trình thực hành. Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên. Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn. Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm. c. Kết thúc thực hành: Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục 5 của từng bài thí nghiệm và theo yêu cầu của giảng viên. Trang 3
BÀI 1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT 1. Thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật học 1.1.Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng các loại dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ to và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160oC/2 giờ, hoặc 180oC/30 phút. Hình. Tủ sấy 1.2.Tủ ấm (incubator or etuve): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở t o khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt. Ví dụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E. coli thích hợp ở 44oC/24h – 48h. 1.3. Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường. 1.4. Nồi hấp ướt (Autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121oC/1 atm/ 15 phút. Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117oC/ 0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa…… Thể tích môi trường nuôi Thời gian hấp tiệt trùng cấy (ml) tối thiểu (phút) 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63 Trang 4
Chỉ số áp kế của 0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 nồi áp suất (atm) To sôi nước (oC) 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 T sôi nước ( F) o o 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 Hình. Nồi hấp cao áp (Autoclave) 1.5. Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100µg – 200g. Độ chính xác 104 g. Cân kỹ thuật (technical balance): độ chính xác 102g. Dùng cân hóa chất, môi trường. A B Hình. Cân phân tích (A) và cân kỹ thuật (B) 1.6. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ) : Có không gian vô trùng được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng. Hình. Tủ cấy vô trùng Trang 5
1.7. Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách các chất ở các pha rắnlỏng ra khỏi nhau như tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,… Hình. Máy ly tâm 1.8. Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường. Hình. Máy lắc 1.9. Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật. Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi). Trang 6
Hình. Kính hiển vi quang học 1.10. Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật A B Hình. Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B) 1.11. Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước. Hình. Máy cất nước 1.12. Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ. Trang 7
Hình. Bể ổn nhiệt 1.13. Nồi lên men (fermenter/Bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy Hình. Nồi lên men 1.14. Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô, … 2. Dụng cụ Dụng cụ thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức,… yêu cầu phải sạch, trong, trung tính. Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô. Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H 2SO4 loãng trong 24 giờ. Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính. Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô. Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau đó rửa lại bằng nước sạch. Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn. Các dụng cụ khác: như đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa, đầu típ, bếp điện,… 3. Các phương pháp khử trùng vi sinh vật * Nguyên tắc Trang 8
Diệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là giết chết các vi sinh vật không mong muốn. Người ta thường khử trùng bằng 2 phương pháp chính: 3.1. Phương pháp lý học * Nhiệt khô. Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt: đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt. Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160oC/ 1 giờ. Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun. * Nhiệt ẩm. Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn. Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử và vi khuẩn hoại sinh. Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại vi sinh vật. Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70 80 oC, mỗi lần 30 60 phút và liên tiếp trong 3 ngày liền. Phương pháp hơi nước bảo hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. * Diệt trùng bức xạ. Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật. Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử trùng phải bao gói kín. * Diệt trùng bằng sóng. Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bào vi sinh vật, làm chết các tế bào sống. * Diệt trùng bằng cách lọc. Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… thường là những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được. Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn. 3.2. Phương pháp hóa học. Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như: xanh methylene). Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất Clor,… 4. Những điểm cần lưu ý Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống nghiệm, bình tam giác. Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng hút dung dịch của pipette sau khi nút xong. Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng. 5. Báo cáo thực tập Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật? Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật? Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Trang 9
BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1. Nguyên tắc Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật. Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường Phân loại theo nguồn gốc + Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật... + Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB... + Môi trường bán tự nhiên: Potatoe glucose agar (PGA), giá đậu đường... Phân loại theo trạng thái vật lý: + Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác trong thành phần môi trường + Môi trường rắn: mỗi 1000ml môi trường có 1520g agar hay các chất làm giá thể + Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000ml môi trường có 35g agar hay các chất làm giá thể khác. Phân loại theo công dụng: + Môi trường phân lập + Môi trường tăng sinh + Môi trường lưu giữ giống + Môi trường thử nghiệm sinh hóa Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc: Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh dưỡng của từng loại sinh vật. Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vât nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường. Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng Ghi chú nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 5 3 Bình tam giác Cái 1 4 Phễu thủy tinh Cái 1 5 Đũa khuấy thủy tinh Cái 1 6 Cốc 100ml Cái 3 7 Cốc 500ml Cái 1 Trang 10
Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng Ghi chú nhóm (3 sinh viên) 8 Đĩa cân nhựa Cái 3 9 Bình tia Cái 1 10 Bếp điện Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Máy đo pH Cái 1 2 Cân kỹ thuật Cái 1 3 Cân phân tích Cái 1 4 Nồi hấp cao áp Cái 1 5 Tủ sấy Cái 1 2.2. Môi trường và hoá chất * Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường cao thịt peptone Cao thịt: 3g Peptone: 10g NaCl : 5g Agar: 20g Thêm nước cất cho đủ 1000ml. Lắc đều, điều chỉnh pH=7,0±0,2 Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút * Môi trường nuôi cấy nấm men: Môi trường Hansen Glucose, maltose (hoặc đường kính ): 50g Peptone:10g K2HPO4: 3g MgSO4.7H2O : 2 5g Agar: 20g Thêm nước cất đủ: 1000ml Lắc đều, điều chỉnh pH=6,0±0,2 Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút * Môi trường nuôi cấy nấm mốc: Môi trường Czapek Saccarose: 30g NaNO3: 30g K2HPO4:1 g Trang 11
MgSO4: 0,5g FeSO4: 0,01g Thạch (agar): 20g; Thêm nước cất đủ: 1000ml pH = 6,0±0,2 khử trùng 1atm / 30 phút. * Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Môi trường Gauze 1 Tinh bộ tan: 20g K2HPO4: 0,5g MgSO4.7H2O: 0,5g KNO3: 1,0g NaCl : 0,5g FeSO4 : 0,1g Agar: 20g Nước cất đủ: 1000 ml pH = 7,2 ÷ 7,4 khử trùng 1atm/30 phút * Môi trường nuôi cấy tảo Môi trường Tamiya KNO3: 5,000 MgSO4: 2,500 KH2PO4: 1,250 FeSO4.7H2O: 0,003 EDTA: 0,037 Vi lượng A5: 1 ml Agar: 20g Nước cất đủ 1.000 ml Thành phần vi lượng A5 H3BO3: 2,860 MnCl2.4H2O: 1,810 ZnSO4.7H2O: 0,222 MoO3: 176,4 NH4VO3: 229,6 Nước cất đủ 1.000 ml 2.3. Nguyên liệu khác Giấy lọc Bông không thấm Trang 12
Bông thấm nước 3. Tiến hành thí nghiệm Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng: 3.1. Chuẩn bị dụng cụ tất cả các dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế môi trường phải được chuẩn bị đầy đủ. Các dụng cụ được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô trước khi sử dụng. 3.2. Cân đong hóa chất pha chế môi trường Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tinh để cân đong các loại hóa chất dễ hút ẩm 3.3. Phối chế tạo môi trường nuôi cấy Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cất trước khi phối trộn. Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau. Phối trộn dựa trên nguyên tắc thể tích tăng dần. Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bông thấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) để làm trong môi trường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng. Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiến hành nấu sôi môi trường để làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa. 3.4. Điều chỉnh độ pH của môi trường Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCl 10 % hay NaCl 10 %. Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 ... Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pHmetre). Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao. 3.5. Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ống nghiệm, bình tam giác. Trình tự phân phối gồm các bước sau: + Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng cụ. + Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra. + Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại. Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 1/3 thể tích ống nghiệm. Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 1/3 thể tích của bình. Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng. Thể tích môi trường khoảng 1215ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dầy khoảng 2mm. Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin: + Tên môi trường + Ngày khử trùng + Người pha chế Trang 13
3.6. Khử trùng môi trường Tuỳ theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và phương pháp khử trùng khác nhau. Môi trường thường được hấp tiệt trùng bằng nồi ấp cao áp. Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC phụ thuộc vào lượng môi trường được phân phối vào dụng cụ chứa (xem bài 1). Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chất kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng...), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bổ sung các thành phần này sau khi hấp xong. Một số loại môi trường không được hấp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: môi trường Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliform agar...), cần chuẩn bị nước cất vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay. 3.7. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc. Ống nghiệm được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ. Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 35cm. Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,51cm. Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc. Đổ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tam giác được rót vào phần đáy của đĩa petri. Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn. 3.8 Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ. Sau thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường. Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 5 0C và không để môi trường bị khô. Thời gian lưu trữ tối đa là 15 ngày. Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 370C, trong 48 72h. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu. Thạch Canh Thạch đứng trườn nghiêng Trang 14 g Đĩa thạch
Hình. Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri 4. Những điểm cần lưu ý Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn, thành phần agar trong môi trường có thể bổ sung sau khi điều chỉnh pH của môi trường. Đối với môi trường rắn hoặc bán rắn, cần phải nấu sôi để làm tan agar hoàn toàn trước khi phân phối vào dụng cụ chứa. Khi điều chỉnh pH, cần dùng từng lượng nhỏ các dung dịch điều chỉnh (dung dịch NaOH, HCl) để tránh vượt quá pH cần. pH môi trường cần được kiểm tra trước và sau khi hấp tiệt trùng. Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. 5. Báo các thực tập Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng? Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng? Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa? Tại sao? Trang 15
BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1. Nguyên tắc Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: cấy và nuôi. Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng. Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật. Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. * Mục đích của việc nuôi cấy Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên cứu. Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng. Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết. Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật. * Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt để. Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, oxy...) để vi sinh vật phát triển thuận lợi. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất 2.1. Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị mỗi STT Đơn vị tính Số lượng Ghi chú nhóm (3 sinh viên) 1 Giá ống nghiệm Cái 1 2 Ống nghiệm Ф18 Cái 1 3 Cốc 100ml Cái 3 4 Cốc 500ml Cái 1 5 Đèn cồn Cái 1 6 Que cấy Cái 1 7 Bình tia Cái 1 STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú 1 Tủ ấm Cái 1 2 Tủ cấy vô trùng Cái 1 2.2. Môi trường, hóa chất Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở bài 2, bao gồm các loại + Môi trường cao thịt – pepton: nuôi cấy vi khuẩn + Môi trường Hansen: nuôi cấy nấm men + Môi trường Czapeck: nuôi cấy nấm mốc Cồn 96o 2.3. Chủng giống vi sinh vật Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis 2.4. Nguyên liệu khác Trang 16
Giấy lọc Bông không thấm Bông thấm nước 3. Tiến hành thí nghiệm 3.1. Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm khác. Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm bên dưới nút ống nghiệm. a. Cấy truyền bằng pipet Pasteur Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của ống giống, hơ và xoay miệng ống giống qua ngọn lửa đèn cồn để sát khuẩn. Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipet, rút pipet ra khỏi ống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá. Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn miệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn. Rút pipet ra, khử trùng miệng ống, đậy nút. Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn. b. Cấy truyền bằng que cấy vòng Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường. Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy. Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống nghiệm ra. Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm. Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi trường. Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môi trường. Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút lại Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong. * Chú ý Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay que cấy. Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã tháo giấy bao gói. Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch sunfocromic để khử trùng. Trang 17
Hình. Thao tác cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng 3.2. Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch a. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. Gồm các thao tác như sau: Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm. Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường. Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy. Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút đậy ra. Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm. Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống. Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi trường để thực hiện thao táo cấy: Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm. Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: + Hình chữ chi. + Hình vòng xoắn. + Hình vạch ngang song song. Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông. Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong Trang 18
* Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào tử khác, khi cấy trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống. Cấy truyền bào tử sang ống nghiệm môi trường mới theo 2 cách: Cấy điểm: cách cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch Cấy gõ: đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống. Hình. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng b. Cấy trên ống nghiệm thạch đứng Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí. Sử dụng que cấy đầu nhọn. Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ. Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tùy yêu cầu. Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường. Trang 19
Hình. Phương pháp cấy trên thạch đứng c. Cấy truyền trên thạch đĩa Dùng que cấy đầu tròn, hoặc que trải thủy tinh. Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã hướng dẫn ở trên. Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó để cách đèn cồn chừng 1 2cm, khẽ mở mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao cho vừa đủ để cho que cấy vào. Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau: + Theo hình zig zac trên toàn bộ mặt thạch + Theo những đường song song + Theo hình zig zac 3 hoặc 4 góc. Khi dùng que trải, hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bề mặt thạch đĩa. Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa. Làm nguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa. (d) Hình. Các kiểu cấy truyền bằng que cấy trên thạch đĩa Trang 20