intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE)

Chia sẻ: Tomjerry010 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:18

Thêm vào BST
Báo xấu
32
lượt xem 3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE) cung cấp cho người học những kiến thức như: Phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm màu gram; quan sát hình thái vi sinh vật; phương pháp làm môi trường; nuôi cấy vi sinh vật; đánh giá sinh trưởng của vi sinh vật trên các môi trường nuôi cấy; các phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực hành Vi sinh vật đại cương (Chương trình POHE)

  1. 10/21/2018 Bài 1: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN SOI TƯƠI THỰC HÀNH NỘI DUNG: 1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi 2. Quan sát tiêu bản nấm mốc Vi sinh vật đại cương MỤC ĐÍCH: (Chương trình POHE) Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang học. Nắm được cách sử dụng Học cách làm tiêu bản soi tươi (không nhuộm) Quan sát tiêu bản nấm mốc II. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi NỘI DUNG - Tiêu bản soi tươi: Lấy trực tiếp mẫu đặt lên phiến kính để quan sát, không cần nhuộm màu. BÀI 1. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ - Tiêu bản này không thể bảo quản lâu dài NHUỘM MÀU GRAM - Thực hành: BÀI 2. QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT + Phương pháp làm tiêu bản giọt ép (quan sát nấm men) + Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc BÀI 3. PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG 2.1. Các bước chuẩn bị: BÀI 4. NUÔI CẤY VI SINH VẬT - Mẫu vi sinh vật cần quan sát: BÀI 5. ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CỦA VSV TRÊN CÁC + Mẫu lỏng: Dung dịch nuôi cấy nấm men Saccharomyces sp. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY + Mẫu rắn: Đĩa nuôi cấy nấm mốc: Aspergillus sp., Rhizopus/Niger, Penicillium BÀI 6. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG TB VSV - Các dụng cụ khác: Lam kính, que cấy, ống hút Pasteur, đèn cồn, bút viết kính, panh kẹp, lamen, dao cắt mẫu … - Dung dịch soi tươi: Dung dịch phenol
  2. 10/21/2018 2.2. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần. Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản Bước 2: Sử dụng ống hút Pasteur lấy một giọt mẫu, đặt lên lam kính  nhỏ 1 giọt phenol  trộn đều. Bước 3: Đặt lamen nghiêng 1 góc 45o, từ từ đậy lamen xuống sao cho lamen phủ kín giọt dung dịch mẫu và không có bọt khí. Bước 4: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x 2.3. Phương pháp làm tiêu bản nấm mốc (soi tươi) Bước 1: Tiệt trùng lam kính bằng cách hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn vài lần. Sau đó, ghi tên mẫu lên tiêu bản Bước 2: Sử dụng que cấy đầu nhọn hoặc dao cắt mẫu cắt một phần thạch có chứa mẫu  đặt lên lam kính Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 4x và 10x
  3. 10/21/2018 Yêu cầu báo cáo thực hành I. Phương pháp làm tiêu bản cố định - Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái 1. Quan sát tiêu bản làm sẵn học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống… + Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x) - Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài 2. Quan sát tiêu bản tự làm - VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý  an toàn cho người quan sát 1.1. Các bước chuẩn bị: + Tiêu bản nấm men với vật kính 40x - Chuẩn bị mẫu vật gồm: + Tiêu bản nấm mốc với vật kính 4 và 10x + Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic 3. Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình) + Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men  Hình thái: Cho biết hình thái của nấm men và nấm mốc - Chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút viết kính, lam  Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?, hình thành bào tử gì? kính sạch - Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn lửa đèn cồn để làm sạch. + Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm 1.2. Các bước làm tiêu bản cố định Bài 2: PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH VÀ NHUỘM MÀU GRAM Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết kính vẽ lên một vòng tròn  định vị vùng làm vết bôi. Bước 2: Làm vết bôi NỘI DUNG: + Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt lên vòng tròn trên lam kính và dàn mỏng ra. 1. Phương pháp làm tiêu bản cố định + Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất đặt lên vòng tròn; 2. Phương pháp nhuộm màu Gram Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống; hòa tan cùng với giọt nước cất  dàn mỏng ra Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn vài MỤC ĐÍCH: lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản: Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương - Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu tốt hơn pháp nhuộm Gram - Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính  khi rửa không bị trôi đi - Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn + Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng
  4. 10/21/2018  Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi  để 1-2 phút. Sau đó rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi nước chảy ra không còn màu tím  Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa với nước sạch  vẩy khô  Bước 3: Tẩy màu với cồn axeton: Nghiêng phiến kính 45o, để cồn chảy từ đầu đến cuối phiến kính cho đến khi không còn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.  Bước 4: Nhuộm màu với đỏ Fuchsin: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút  Rửa thuốc Cố định tiêu bản nhuộm thừa với nước sạch làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn Tiêu bản sau khi cố định II. Phương pháp nhuộm Gram 2.1. Lịch sử: - Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram âm và Gram dương - Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch phát minh 2.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm Pseudomonas (gram -) E. coli (gram -) Salmonella (gram -) - Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet - Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol - Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton - Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/ Safranin - Nước rửa: Nước sạch 2.3. Các bước nhuộm Gram Gồm 4 bước Bacillus cereus (gram +) Lactobacillus sp. (gram +) Staphylococcus aureus (gram +)
  5. 10/21/2018 Bài 3: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT NỘI DUNG: 1. Hướng dẫn sử dụng kính hiển vi quang học 2. Quan sát tiêu bản nhuộm Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên) Nấm men Saccharomyces MỤC ĐÍCH: Nắm được và thực hành cách làm tiêu bản cố định và phương pháp nhuộm Gram nảy chồi (mũi tên) Quan sát một số hình thái cơ bản của nấm mốc, vi khuẩn và nấm men Nấm men nảy chồi (mũi tên) Yêu cầu báo cáo thực hành I. Sử dụng kính hiển vi quang học (light microscope) 1. Mô tả và thực hành được phương pháp làm tiêu bản cố định 1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học + Tiêu bản vi khuẩn lactic + Tiêu bản nấm men 2. Thực hành phương pháp nhuộm Gram với 2 tiêu bản tự làm + Trình bày trình tự các bước nhuộm Gram + Cho biết tại sao khi nhuộm màu vi khuẩn lại có tính chất bắt màu Gram khác nhau? + Trong trường hợp nào, khi nhuộm Gram chỉ cần sử dụng 1 loại thuốc nhuộm?
  6. 10/21/2018 a. Phần cơ học Vật kính  Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để đưa ảnh  gồm một hệ thống thấu kính hội tụ của vật quan sát vào đúng tiêu điểm có tiêu cự ngắn khoảng vài mm, đặt trong một vỏ bọc kim loại - Bàn xoay (mâm kính): gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật kính - Ống kính: Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục thẳng  Chức năng: Tạo ảnh thực ngược đứng tùy theo vị trí quan sát. Phía trên ống kính có gắn thị kính chiều với vật quan sát. - Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu bản quan sát. Trên bàn kính có các kẹp  Độ phóng đại của vật nghiên cứu phụ giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính. thuộc vào tiêu cự và độ cong của - Đế kính (chân kính): cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV thấu kính ngoài cùng. Độ cong càng lớn, thì tiêu cự càng ngắn độ - Ốc điều chỉnh: gồm phóng đại của vật kính càng lớn + Ốc điều chỉnh tiêu bản;  Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x (vật + Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn); kính khô), 90x, 100x (vật kính dầu) + Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ) b. Phần quang học d. Thị kính  Bộ phận chiếu sáng: - Gồm 2 thấu kính: thấu kính mắt phía trên, thấu kính tụ phía dưới. Giữa hai Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại với thấu kính có màn chắn giữ lại các nhau hội tụ các tia sáng xuất phát từ nguồn sáng tia sáng xung quanh, chỉ để các tia vào tiêu bản sáng gần với trục quang đi qua  Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền sáng và hình rõ nét hơn tụ quang kính nền đen - Vai trò: Phóng đại ảnh của vật kính thu được-vai trò giống kính lúp - Các loại thị kính: 7x, 10x, 15x, 20x  Độ phóng đại của mẫu quan sát bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính
  7. 10/21/2018 Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác Kính HV điện tử truyền qua (TEM) Kính hiển vi điện tử - KHV điện tử truyền qua (Transmission electron microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1x106 lần). Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số - KHV điện tử quét (Scanning electron microscope – SEM): là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu, do đó cho phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus… Scanning transmission electron microscope (STEM) KHV huỳnh quang Kính hiển soi nổi (fluorescence microscope) (stereoscopic microscope) SIGMA Advanced Analytical Scanning Electron Microscope SEM
  8. 10/21/2018  Kính hiển vi phản pha (Phase c. Quan sát với vật kính dầu (100x) contrast microscopy-Nobel prize - Nếu dùng vật kính dầu chú ý: 1953): Ánh sáng xuyên qua các vật + Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí thể trong suốt, không màutiêu vùng định quan sát trên tiêu bản (Hình A) bản không cần nhuộm + Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm A C nhẹ vào giọt dầu (Hình B) + Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh trên vi trường  Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm B bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu soi (Hình C) D + Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp cho A. Nấm men quan sát vơi KHV quang học B. Nấm men quan sát dưới KHV nền đen rõ nét. C. Nấm men quan sát dưới KHV phản pha D. Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang 1.2. Cách sử dụng kính hiển vi quang học a.Chuẩn bị: d. Bảo quản sau khi sử dụng kính - Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút… - Chuẩn bị tiêu bản quan sát - Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra. - Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên tay phải - Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính (nếu thuận tay phải) b. Quan sát với vật kính khô: xylene lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch. - Cắm điện và bật công tắc đèn - Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý; - Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu bản. + Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được ảnh của mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn. - Tắt công tắc đèn, rút phích cắm khỏi ổ điện. - Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát trên tiêu bản - Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng bao nilon. - Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x - Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính; Mắt nhìn - Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống đèn bật thường xuyên để vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp ảnh thì sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh. chống mốc và bụi bẩn.
  9. 10/21/2018 Bài 4: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI 2. Quan sát tiêu bản SINH VẬT 2.1. Quan sát tiêu bản nấm mốc - Sử dụng vật kính 4x và 10x Nội dung: - Quan sát ở vật kính 4x: cho biết đặc điểm hình thái của nấm mốc, vẽ hình 3.1. Chuẩn bị dụng cụ - Quan sát ở vật kính 10x: Cho biết đặc điểm bào tử của nấm mốc, vẽ hình 3.2. Phương pháp làm môi trường nuôi cấy VSV 2.2. Quan sát tiêu bản nấm men - Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và hình thức sinh sản Mục đích của nấm men. Vẽ hình Biết cách bao gói, hấp sấy dụng cụ thí nghiệm 2.3. Quan sát tiêu bản vi khuẩn lactic Nắm được các thao tác kỹ thuật trong pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh - Sử dụng vật kính dầu 100x: Cho biết đặc điểm hình thái và tính chất sắp xếp vật của vi khuẩn lactic. Vẽ hình 3.1. Chuẩn bị dụng cụ, môi trường nuôi cấy vi sinh vật Yêu cầu báo cáo thực hành 3.1.1. Chuẩn bị dụng cụ Các dụng cụ thường được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy VSV 1. Quan sát tiêu bản tự làm - Hộp lồng (đĩa Petri), ống nghiệm, bình tam giác, pipet, cốc đong, đũa thủy tinh, ống + Tiêu bản nấm men với vật kính 100x (vật kính dầu) hút Pasteur …. + Tiêu bản vi khuẩn lactic với vật kính 100x (vật kính dầu) Vệ sinh dụng cụ: 2. Báo cáo:  Dụng cụ thuỷ tinh mới chưa sử dụng: ngâm nước lã hoặc dung dịch H2SO4 loãng/ 24 - Cho biết tính chất bắt màu của vi sinh vật ở mẫu nhuộm giờ. Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới khi dung dịch rửa có pH trung tính. -Mô tả đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic và nấm men. Vẽ hình minh họa  Các dụng cụ đã qua sử dụng (VSV gây bệnh): trước khi rửa phải được khử trùng bằng -Mô tả tính chất sắp xếp của vi khuẩn lactic: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối hơi nước cao áp giết chết các VSV  đảm bảo an toàn cho người rửa, không cho chuỗi? mầm bệnh cũ nhiễm vào môi trường mới. -Mô tả đặc điểm sinh sản của nấm men: tìm tế bào nảy chồi. Vẽ hình  Sử dụng dung dịch sunfocromat để ngâm tẩy các vết bẩn trên dụng cụ thuỷ tinh  Dụng cụ sau khi rửa, cần được làm khô trước khi bao gói
  10. 10/21/2018 Bao gói dụng cụ để khử trùng: Tủ sấy Nồi hấp hơi nước cao áp  Dụng cụ trước khi khử trùng phải được rửa sạch, làm khô và bao gói bảo đảm vô trùng sau khi sấy. Khử trùng dụng cụ  Dụng cụ thủy tinh sau khi được bao gói thì được khử trùng bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 160-180oC/2h.  Các dụng cụ đã khử trùng được bảo quản trong tủ chuyên dụng đựng dụng cụ hoặc bảo quản trong túi nilon kín. Chỉ bóc giấy bao gói ngay trước khi sử dụng.  Sau khi khử trùng, các que gạt, que cấy chỉ nên sử dụng trong vòng 24 giờ, hộp petri trong vòng 3 ngày, ống nghiệm, bình nón khoảng 7-10 ngày nếu bảo quản tốt. Nếu để lâu, dụng cụ phải được khử trùng lại trước khi sử dụng.  Một số dụng cụ như que gạt, que cấy, ống hút Pasteur, chày cối, hộp đựng đầu pipet… được khử trùng bằng phương pháp hấp hơi nước cao áp ở 121oC/1atm/30 phút. Làm nút bông cho ống nghiệm, bình tam giác Bao gói dụng cụ thí nghiệm để khử trùng 3.2. Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv 3.2.1 Môi trường đặc (rắn) Môi trường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2% thạch (agar). Một số loại môi trường chủ yếu:  Môi trường dinh dưỡng: • Môi trường đơn giản/MT cơ sở  peptone + agar; môi trường nước thịt peptone • Môi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt, cao nấm men, casein… + các chất khoáng hoặc các chất đặc hiệu  Môi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự sinh trưởng của một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)  Môi trường chẩn đoán/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa chất giúp phân biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: môi trường MacConkey phân biệt E. coli và Salmonella)
  11. 10/21/2018 Một số loại môi trường chọn lọc 3.2.2. Môi trường dịch thể (lỏng)  Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch) Mannitol salt agar MacConkey agar Casein media: chọn lọc Protease MT dinh dưỡng Môi trường thạch nghiêng 43 Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm Một số môi trường chẩn đoán, phân biệt 3.3. Phương pháp làm môi trường dịch thể a. Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth) Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng. Thành phần: Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ, gân, Thịt bò (lợn): 500g xay nhỏ. Thêm 1000ml nước cất, để ở nhiệt độ Peptone: 10g phòng 12h. Sau đó đem đun sôi 30 phút. Đợi nguội lọc qua bông/giấy lọc. Thạch máu: blood agar NaCl: 5g Nước cất: 1000ml - Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit, thêm 0,5% NaCl và 1% pepton. Điều chỉnh pH. pH: 7.5±0.2 (25 °C) - Hấp khử trùng ở 121o/1atm/20 phút Sau khi hấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam giác để sử dụng b. Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water) • Hòa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước. • Môi trường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung thêm 1% đường) và MT phân biệt Salmonella và Shigella với E. coli. MT kiểm tra phản ứng indole.
  12. 10/21/2018 3.4. Phương pháp làm môi trường rắn b. Môi trường thạch đĩa Bước 1: Hấp tiệt trùng Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men - MT thạch Hansen sau khi chuẩn bị xong, tiến hành đổ vào bình tam giác loại Thành phần: Chuẩn bị: 100ml Glucose: 50g - Cân chính xác thành phần của môi trường, - Lượng MT từ 50-80ml/bình, không đổ đầy bình để tránh trào ra ngoài khi hấp Pepton: 10g hòa tan với nước cất bằng cách đun sôi. - Đậy nút bông, bao gói, ghi tên môi trường và thời gian làm bên ngoài K2HPO4: 3g - Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng ở - Cho môi trường vào nồi hấp, hấp ở 121oC/1atm/15-20 phút MgSO4.7H2O: 2-5g 121o/1atm/20 phút Bước 2: Đổ môi trường ra đĩa Agar: 15-18g - MT có màu vàng nhạt - Lấy các bình môi trường từ nồi hấp ra, để nguội đến 45-50oC tiến hành đổ vào Nước cất: 1000ml - Khi sử dụng, nuôi cấy ở 30-35oC/24-48h đĩa Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men - Mỗi đĩa đổ từ 15-20ml tùy theo đường kính của đĩa. Tuy nhiên cần phải đảm Thành phần: bảo môi trường phủ kín đĩa. Chuẩn bị: - Lưu ý: Glucose: 40g/l - Cân chính xác thành phần của môi trường, đun cho +Quá trình đổ đĩa phải được tiến hành trong buồng cấy đã được khử trùng Peptone: 10g/l tan các thành phần. Chỉnh pH từ 5,6±0,2 ở 25oC; + Thao tác nhanh và đảm bảo vô trùng Thạch: 15g/l Hấp tiệt trùng ở 121o/1atm/15 phút - Các đĩa môi trường sau khi đổ xong để cho thạch đông hoàn toàn, sau đó bao - MT có màu kem hoặc vàng nhạt. gói và để vào tủ ấm ở 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm. a. Môi trường thạch nghiêng (thạch ống) Bước 1: Đổ ống nghiệm - MT thạch Hansen sau khi chuẩn bị xong, tiến hành đổ ống nghiệm. - Lượng MT từ 8-10ml/ống tùy vào đường kính của ống - Đậy nút bông, bao gói, ghi tên môi trường và thời gian làm bên ngoài Bước 2: Hấp tiệt trùng - Cho môi trường vào nồi hấp, hấp ở 121oC/1atm/15-20 phút. Bước 3: Nghiêng môi trường - Lấy môi trường từ nồi hấp ra, bỏ bao gói và nghiêng trên mặt bàn đến khi thạch đông hoàn toàn. Để MT vào tủ ấm ở 37oC/24h để kiểm tra tạp nhiễm
  13. 10/21/2018 Yêu cầu báo cáo thực hành I. Kỹ thuật ria cấy 1.1. Kỹ thuật ria cấy trên thạch ống (Agar slant culture) 1. Thực hành phương pháp làm nút bông, bao gói, sấy dụng cụ thí nghiệm Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong cấy truyền giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống 2. Thực hành làm môi trường Hansen dịch thể và Hansen rắn - MT thạch nghiêng a. Chuẩn bị - MT thạch đĩa - Môi trường thạch nghiêng Hansen 3. Đánh giá chất lượng môi trường: - Dụng cụ: que cấy, đèn cồn, bút viết kính… - Màu sắc, trạng thái - Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp. - Độ tạp nhiễm - Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước khi tiến hành - Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên ống môi trường mới Bài 5: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật b. Các bước tiến hành: Bước 1: Lấy giống cần cấy Nội dung: + Đốt đèn cồn  tiệt trùng que cấy bằng cách hơ que cấy thẳng đứng trên ngọn Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ  để nguội Quan sát hình thái khuẩn lạc + Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lòng bàn tay lấy nút bông, Đánh giá sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường dịch thể tiệt trùng miệng ống  Lấy một lượng giống cần cấy  tiệt trùng miệng ống, đậy nút bông Mục đích: Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới: - Nắm được và thực hiện tốt các kỹ thuật ria cấy sử dụng trong + Đưa que cấy đã lấy giống xuống đáy ống môi trường mới. Ria que cấy từ trái nuôi cấy vi sinh vật sang phải theo đường zich zắc chữ chi về phía miệng ống - Nắm được các tiêu chí đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật + Tiệt trùng miệng ống  đậy nút bông đem nuôi cấy trên các môi trường dịch thể và môi trường rắn Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống trong buồng cấy/phòng vô trùng + Mọi thao tác kỹ thuật cần được tiến hành xung quanh ngọn lửa đèn cồn
  14. 10/21/2018 Các bước ria cấy trên thạch ống Các bước kỹ thuật ria trên thạch đĩa (ria 3 lần đốt que cấy) Ria Xoắn ốc Ria ngang Ria zic zắc 1.2. Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa (Streaking culture plates) Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu phân lập, chọn lọc giống nhằm tách thuần khuẩn lạc. a. Chuẩn bị Các bước chuẩn bị như phương pháp ria trên ống. Chỉ khác phần kỹ thuật ria b. Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy: Ria đúng kỹ thuật Bước 1: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy 1 ít giống cần cấy - Vô trùng miệng đĩa, hé mở nắp hộp lồng, đưa que cấy đã lấy giống vào, ria ở 1/3 đĩa  dừng lại, đốt que cấy lần 1 Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que cấy vào đường ria cuối cùng của lần ria thứ nhất ria ngang tiếp 1/3 đĩa  đốt que cấy lần 2 Bước 3: Làm tiếp tục như bước 2, ria nốt 1/3 đĩa còn lại  vô trùng miệng đĩa, nuôi cấy trong tủ ấm ở trạng thái úp ngược Ria bị tạp Ria không đúng kỹ thuật
  15. 10/21/2018 II. Đánh giá sinh trưởng của VSV Một số dạng khuẩn lạc của vsv 2.1. Trên môi trường rắn  VSV sinh trưởng trên môi trường đặc (rắn) sẽ hình thành khuẩn lạc  Khuẩn lạc là sự tập trung một số lượng lớn tế bào ở cùng một nơi, được hình thành từ một tế bào ban đầu.  Sự sinh trưởng được đánh giá thông qua các tiêu chí: - Số lượng khuẩn lạc (đếm bằng phương pháp pha loãng nồng độ) - Hình thái, kích thước của khuẩn lạc - Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc - Màu sắc của khuẩn lạc; - Mùi của môi trường  Hai dạng khuẩn lạc thường gặp: - Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn, mặt láng bóng, nhẵn. - Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh. Mô tả đặc điểm của khuẩn lạc Bề mặt khuẩn lạc Staphylococcus khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae khuẩn lạc trực khuẩn Bacillus Rìa/ bờ viền TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê khuẩn lạc nấm mốc khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus khuẩn lạc nấm men
  16. 10/21/2018 2.2. Đánh giá sinh trưởng của VSV trên môi trường dịch thể (lỏng) Đánh giá sinh trưởng qua các tiêu chí: Bài 6. ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT  Đếm số lượng tế bào qua phương pháp so màu hoặc pha loãng nồng độ  Độ đục của môi trường (so màu): đục đều hay ở dạng bông, dạng vẩn mây 1. MỤC ĐÍCH  Sự lắng căn hay kết tủa: dày hay mỏng, xốp hay kết chặt, dạng hạt hay keo  Hình thành màng: màng tròn hay màng kín, bề mặt màng thô hay mịn, dày Nắm được và vận dụng tốt phương pháp xác định số lượng TB vi sinh hay mỏng vật qua phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm  Sự đổi màu của môi trường  Sinh khí; Mùi hồng cầu và đếm gián tiếp bằng phương pháp pha loãng nồng độ. 2. NỘI DUNG Tạo màng - Thực hành phương pháp đếm số lượng nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer - Đếm số lượng TB bằng phương pháp pha loãng nồng độ Đục, đổi màu Sinh khí (CO2) Yêu cầu báo cáo I. Phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi  Là phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu 1. Thực hành phương pháp ria cấy trên thạch đĩa và thạch nghiêng Neubauer. Ứng dụng cho các vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, vi tảo, vi khuẩn lam. Còn gọi là phương pháp đếm nhanh. 2. Đánh giá sinh trưởng của nấm men trên môi trường Hansen dịch thể  Ưu điểm: Cho phép xác đinh nhanh chóng số lượng tế bào có trong mẫu 3. Quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc ở các đĩa nuôi cấy:  Nhược điểm: không phân biệt được các tế bào sống và chết; độ chính xác không - Hình thái khuẩn lạc cao với mật độ
  17. 10/21/2018 1.2. Cách tiến hành Bước 1: Pha loãng mẫu: sao cho mật độ tế bào nằm trong khoảng 250.000 TB/ml – 2,5 triệu TB/ml. Tốt nhất nên nằm ở khoảng 1 triệu tế bào/ml. - Nếu mật độ tế bào 2,5 triệu/ml thì sẽ làm tăng sai sót trong quá trình đếm do mật độ quá dày. Bước 2: Nhỏ 10µl dung dịch mẫu lên buồng đếm, đậy lamen lên trên sao cho dung dịch được dàn mỏng toàn bộ mặt buồng đếm và không tạo thành bọt khí. Nếu lấy quá nhiều dung dịch mẫu thì sử dụng giấy thấm thấm bớt dung dịch thừa. Bước 3: Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính 10x-40x để điều chỉnh đến khi rõ nét. Tiến hành đếm số lượng tế bào ở 5 ô vuông lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô vuông ở giữa). Cách đếm: Đếm lần lượt từng ô lớn, bắt đầu từ trái qua phải, từ trên xuống dưới theo hình zig- zac. Các tế bào nằm ở đường viền trên và bên trái thì đếm. Ngược lại, tế bào nằm ở đường viền dưới và bên phải thì không đếm. 1.3. Tính kết quả 2. Phương pháp pha loãng nồng độ (đếm khuẩn lạc trên thạch đĩa)  Là phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch đĩa dựa trên nguyên tắc: Mỗi một tế bào vi sinh vật sống sẽ phát triển thành 1 đơn vị khuẩn lạc (colony forming unit – CFU) • Đếm ở ô vuông trung tâm buồng đếm, gồm 25 ô vuông nhỏ. Đếm 5 ô vuông nhỏ.  Ưu điểm: Phương pháp này chỉ xác định số lượng tế bào còn sống và có độ Mỗi ô vuông nhỏ có kích thước 1mm/ 5 = 0,2mm chính xác cao • Thể tích ô vuông nhỏ được tính như sau:  Nhược điểm: • Diện tích của 1 ô vuông: 0,2 mm x 0,2mm = 0,04mm2 - Tốn thời gian: Cần thời gian cho chuẩn bị môi trường, pha loãng mẫu, cấy • Chiều sâu của buồng đếm tính từ lamen là 0,1mm hay 0,01cm mẫu và nuôi cấy • Thể tích của 1 ô vuông = 0,04mm2 x 0,1mm = 0,004mm3 = 4x 10-6 ml • Độ pha loãng: Nếu pha loãng 1:10  Độ pha loãng là 0,1 hay 10-1 - Chỉ đếm được các tế bào còn sống • Nếu pha loãng 1:100  độ pha loãng là 0,01 hay 10-2 - Các tế bào dạng chuỗi hay cụm lại thành đám cũng chỉ phát triển thành 1 • Ví dụ: Số lượng tế bào đếm được ở 5 ô vuông nhỏ là 250, biết độ pha loãng là 10-2. khuẩn lạc, vì vậy không xác định được chính xác số lượng tế bào thực có trong Tính số lượng tế bào trong 1ml dung dịch mẫu? mẫu • Số lượng tế bào/ml dung dịch = 250 /(5 x 4x 10-6 x 10-2) = 12,5 x 108 tế bào/ml - Khuẩn lạc chỉ phát triển trong điều kiện nuôi cấy phù hợp với đặc tính của VSV đó
  18. 10/21/2018 2.1. Chuẩn bị Yêu cầu báo cáo  Pha loãng mẫu: Chuẩn bị 1 dãy ống nghiệm gồm 6 ống vô trùng, số lượng ống có thể >6 tùy thuộc vào mẫu cần đếm. Cho vào tất cả các ống 9ml dung dịch nước 1. Thực hành phương pháp đếm số lượng TB nấm men bằng buồng đếm muối sinh lý 0,9% vô trùng. Hút 1ml dung dịch mẫu cho vào ống thứ nhất, trộn hồng cầu Neubauer đều và tiếp tục hút 1ml cho sang ống thứ 2. Làm như vậy đến hết. Nồng độ pha loãng mẫu lần lượt là 10-1, 10-2, 10-3 … 10-6. - Tính số lượng tế bào nấm men có trong 1ml dung dịch nuôi cấy - Tính số lượng tế bào nảy chồi/tổng số tế bào nấm men 2. Đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa thạch và tính số lượng TB vi sinh vật có trong 1g mẫu ban đầu trước khi nuôi cấy. Biết rằng: - Nồng độ pha loãng khi nuôi cấy là 10-4, 10-5, 10-6 - Lượng mẫu cấy vào mỗi đĩa là 0,1ml Cấy mẫu: Cấy mẫu ở 3 nồng độ pha loãng cuối cùng. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa thạch, mỗi đĩa 0,1ml dung dịch pha loãng. Nuôi cấy các đĩa thạch trong tủ ấm từ 24-48 giờ, sau đó đếm số lượng khuẩn lạc ở đĩa có số lượng khuẩn lạc dao động từ 30-200. Các đĩa có số lượng >200 dễ dẫn đến sai sót khi đếm. Các đĩa có số lượng khuẩn lạc
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2