Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis do TS. Đinh Thị Thu Hằng biên soạn trình bày các nội dung chính sau: B. pseudomallei gây bệnh, hệ gen B. pseudomallei, kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP, thiết kế và đánh giá phản ứng TTSS1-real-time LAMP xác định vi khuẩn B. pseudomallei gây bệnh melioidosis. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng

HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020 Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS. Đinh Thị Thu Hằng Hà Nội, T12 - 2020 1
ĐẶT VẤN ĐỀ Burkholderia pseudomallei và melioidosis - Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe, tử vong 40%. - Phân bố: bùn đất, nước các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. - A. Whitmore (1911) - Melioidosis: cấp và mạn tính - triệu chứng không đặc hiệu, dễ nhầm lẫn chẩn đoán, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”). “Bom hẹn giờ Việt Nam” Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. Chen, Y. L., et al. (2014). PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877. 2
Áp-xe do melioidosis White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 3
Phân bố Melioidosis trên toàn cầu - Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B. J. 2015)) - Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/ AIDS và lao) - 1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D. et al. 2010, 2012). - NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia ( Limmathurotsakul D. et al. 2016), (Gohler A. et al. 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm. Wiersinga, W. J., et al. (2012). "Melioidosis." N Engl J Med 367(11): 1035-44. 4 Rotz, L. D., et al. (2002). Emerg Infect Dis 8(2): 225-230.
B. pseudomallei gây bệnh Độc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit) Đường lây: • Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe phủ tạng, NKH. Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD. • Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ. 5 (Perumal Samy R. et al. 2017)
Phòng và điều trị - Chưa có vắc xin, phòng không đặc hiệu - Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc • Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn công, 3- 6T duy trì (thể nặng 12T). • Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các ápxe phổi. • Dễ tái phát, thời gian, kinh phí => Quân số, sức chiến đấu 6
B. pseudomallei và vũ khí sinh học • B. pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí sinh học (VKSH). • Hệ gen B. pseudomallei giống đến 99% so với B. mallei - được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga • Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B. pseudomallei để chế tạo VKSH. 7
Hệ gen B. pseudomallei Gene TTSS1 AF074878 NST số 1: 3.460 CDS NST số 2: 2.395 CDS Trao đổi chất, tăng trưởng Thích ứng, tồn tại Holden et al. (2004),10.1073/pnas.0403302101. 8
Các phương pháp xác định Nuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngày Huyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu không cao PCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực - chưa đáp ứng thực tế hiện trường 9
Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop mediated isothermal Amplification) - Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm là DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu quả cao (Notomi T. et al. 2000 ). - Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc. 10
Ưu điểm của LAMP • Tiết kiệm • Độ nhạy, đặc hiệu cao • Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân • Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ • Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ không đổi từ 60 - 65°C. • Không đòi hỏi DNA tinh sạch cao. => Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, user- friendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to end users) - thực địa. - real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản hóa quá trình phát hiện B. pseudomallei 11 (Kaneko H. et al. 2007, (Njiru Z. K. 2012)
Thế giới • Hơn 100 XN LAMP chẩn đoán mầm bệnh ở người và động vật: virus Dengue (Parida M. et al. 2005), vi khuẩn lao ( Geojith G. et al. 2011), S. aureus (Lim K. T. et al. 2013), KST sốt rét (Wu L. et al. 2015)... (Eiken Chemical Co. Ltd). • B. pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá ở Đông Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N. et al. 2008). • Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi tiết (Michelle Wong Tzeling J. et al. 2016). 12
B. pseudomallei ở Việt Nam? • Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ tham chiến tại Việt Nam (Schulin T. et al. 2001)+ một số chó nghiệp vụ. ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B. pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R. et al. 2017). • 6 BN nhiễm B. pseudomallei ngoại thành Hà Nội (1993). • 73 (+)/ 147 cánh đồng lúa miền Nam (1999). • Báo cáo các ca lâm sàng: BV Chợ Rẫy 2009-2011, 80 ca/ năm; BV TƯ Quân đội 108 (2015), BV Bạch Mai (2016),…; • TT Trung&cs(2016) NC đặc điểm phân bố B. pseudomallei ở Bắc Trung Bộ, real-time PCR: 77 chủng/ 70 BN. • Mưa lũ lịch sử, đến hết tháng 11/2020, ghi nhận số ca tăng đột biến, 5 ca tử vong. Quyết định 6101/QĐ-BYT 30/12/2019 HD chẩn đoán & điều trị bệnh Whitmore BV quân đội + địa bàn đóng quân, lân cận? Công cụ phát hiện tại thực địa? 13
Đề tài cấp BQP: “Xây dựng QT và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhanh tại hiện trường VK B. pseudomallei”. Mã số: 2019.75.027. 14
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu chủng PCR, Giải trình B. p cloning tự Primer 3 PrimerExplorer V.5 B. pseudomallei, B. cepacia, Thiết kế P. aeruginosa mồi gen GenBank TTSS1 PCR, real-time PCR Thiết lập real-time LAMP LAMP • Độ nhạy, độ PP: Thực nghiệm mô tả, Đánh giá đặc hiệu phân tích trong PTN. • So sánh 15
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Gene TTSS1 AF074878 PCR: primer BpF/R, sản phẩm: 723 bp BpF qBpF qBpR BpR Real-time PCR: primer qBpF/R, probe qBp-Pr, sp: 105 bp LAMP và Real-time LAMP: các set primer LAMP gồm 2-3 cặp FIP/ BIP, F3/ B3, LB/LF vùng gene TTSS1 (The type III secretion system) TTSS1 16
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nhân dòng thiết lập chứng dương gen TTSS1 723 bp PCR TTSS1-orf11 trên gel agarose 1,2% M: Marker 100bp (Thermo Scientific); 1: ĐC âm; 2- 6: Mẫu B. pseudomallei Bp1-Bp5 17
Thiết kế phản ứng TTSS1 real-time PCR Phản ứng real-time 20 µl PCR tối ưu : QuantiTect probe PCR 1X; qBp (F1+R1) 0,2 µM; probe qBp 0,05 µM; mồi IC (F+R) 0,2 µM; probe IC 0,05 µM; 5 µl DNA. Chu trình: (50oC/ 2 phút) (95oC/ 15m) (94oC/ 15s; 60oC/ 60s; 70oC/ 30s)x 45 chu kỳ. Real-time PCR LOD95%=14,6 copy/rxn, độ tin cậy 95%. PCR LOD: 500 copy/rxn 18
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thiết kế các bộ mồi LAMP TT Trình tự (5’-3’) Kích Nguồn ên mồi o gắn mồi (Ta: thước (bp) o C) ộ mồi 1 1 215 Chantratita 3 CCTGCTCCCACACCG 8,01 N. và cs, 2 2008 [13] 3 CGCTTGCGCGTCAT 7,88 3 CCACAGCAACGGAAAGAGCAGA- IP GCTTGCGGCCGAGATC 4 GCCTCGATTGCGCGATCGCC- IP TGTTGCTAGCGGATTGTCA Bộ mồi 2, bộ mồi 3 1 Bp-F3 CAATCTCACCAGCGTTCCA 60,01 242 2 Tự thiết CCGGCCTCAATTCATC p-B3 9,48 kế 3 GCGCAGATGCCTGTCGATCA- p-FIP CCGCCAACCTTTCCACA GCGCAGATTGCCTGTCGATCA- p-FIP-4T TTTTCCGCAACCTTCCAACA 4 CGGCACAACCTGACAATCGC- 19 p-BIP TTCCGCGAACCTGGACT
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thiết kế phản ứng LAMP Quan sát bằng mắt thường Điện di UV 1 2 3 20