Bài giảng Thực tập Dược liệu 1 - Trường ĐH Võ Trường Toản

Chia sẻ: Lôi Vô Kiệt | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:38

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Thực tập Dược liệu 1 được biên soạn nhằm cung cấp cho sinh viện những kiến thức để có thể nhận thức được bột dược liệu bằng kính hiển vi; kiểm nghiệm dược liệu chứa carbohydrat; kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin; kiểm nghiệm dược liệu chứa Coumarin; kiểm nghiệm dược liệu chứa flavonoid; kiểm nghiệm dược liệu chứa Anthranoid;... Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết nội dung bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Thực tập Dược liệu 1 - Trường ĐH Võ Trường Toản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN KHOA DƯỢC  Bài giảng thực tập DƯỢC LIỆU 1 9 Đơn vị biên soạn: TT TH Y DƯỢC Hậu Giang – Năm 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BÀI GIẢNG MÔN HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG Tên môn học: THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 1 TOẢN Trình độ: Đại học Số tín chỉ: 1 Giờ lý thuyết: Giờ thực hành: 30 tiết Thông tin Giảng viên:  Tên Giảng viên: Phạm Duy Lân  Đơn vị: Trung Tâm Thực Hành Y Dược  Điện thoại : 01202166774  Email: phamduylan1911@gmail.com
BÀI 1: NHẬN THỨC BỘT DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI Mục tiêu Sau khi thực hành bài “Nhận thức bột dược liệu bằng kính hiển vi”, sinh viên phải: - Thực hiện được tiêu bản bột dược liệu đạt yêu cầu, quan sát được bột dược liệu bằng kính hiển vi. - Tìm được và vẽ đúng những phần tử đặc trưng của bột dược liệu, xác định được bột dược liệu, độ tinh khiết và sự giả mạo nếu có của các được liệu đã học. I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT Mỗi dược liệu đều có những đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được thể hiện một phần qua đặc điểm bột dược liệu. Những đặc điểm này có thể được dùng để phân biệt dược liệu này với dược liệu khác, để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm. Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi là tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, giúp cho việc định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu, phân biệt với các dược liệu dễ bị nhầm lẫn và phát hiện sự giả mạo nếu có. - Bột lá thường có màu xanh lục tới nâu. Các cấu tử thường thấy là: biểu bì mang khí khỗng, lông che chở, lông tiết, tinh thể calci oxalat, các mạch gỗ v.v.... - Bột vỏ thân, vỏ rễ thường có màu vàng nâu tới nâu. Các cấu tử thường thấy là mảnh bần, mô mềm, các loại sợi (vách dày hay mỏng, khoang rộng hay hẹp), tinh thể calci oxalat hay calci carbonat (với các hình dạng khác nhau), mô cứng. Mô mềm chứa tinh bột, ống nhựa mủ... có thể gặp ở một số dược liệu. - Dược liệu là cành hay toàn bộ rễ thì ngoài các đặc điểm của vỏ còn có thể thấy các loại mạch gỗ và mô gỗ. - Các loại rễ củ, thân ngầm phình thành củ cần chú ý tới đặc điểm cấu tao của hạt tinh bột (hình dạng, kích thước, vân, tễ …) - Bột hoa, quả, hạt có màu sắc thay đổi tùy theo dược liệu. - Các dược liệu là hoa thì cần chú ý tới cấu tạo và hình dạng của hạt phấn, biểu bì cùng các loại lông che chở, lông tiết của bao hoa. - Các dược liệu là hạt cần chú ý biểu bì, mô chứa chất dự trữ (carbohydrat hay dầu béo), phôi. 3
Khi khảo sát vi học một dược liệu mới, để xác định các cấu tử có trong được liệu thuộc bộ phận nào, loại mô nào... thường cần kết hợp và so sánh với việc khảo sát riêng rẽ từng bộ phận của dược liệu. Ví dụ, cần xác định một cấu tử ở bột dược liệu là biểu bì cánh hoa thì phải so sánh với mảnh biểu bì quan sát được của bột từ cánh hoa tách riêng. Cách soi, làm sáng và nhuộm màu tiêu bản Trong nhiều trường hợp, có thể dùng trực tiếp bột dược liệu chưa xử lý để quan sát các thành phần của bột. Tuy nhiên cũng có những trường hợp bột cần được xử lý để tiêu bản được sáng, dễ quan sát hơn. 1. Soi thường Là phương pháp thường dùng nhất. Bột dược liệu được phân tán trong nước cất. Đối với tinh bột và các dược liệu có nhiều tinh bột (như hạt, củ - bột thường có màu trắng ngà), để quan sát cấu trúc của các hạt tinh bột có thể giảm bớt ánh sáng. Nếu không thấy rõ vân và tễ, có thể thêm 1 giọt dung dịch KOH 5% ở mép lamelle rồi quan sát ngay, dung dịch KOH sẽ khuếch tán vào bột làm cho vân và tễ của hạt tinh bột rõ hơn. 2. Phương pháp làm sáng Phương pháp này chỉ thực hiện khi cần tìm những phần tử bột bì che lấp khi soi thường. Có thể chọn một trong các cách sau : - Lấy một ít bột đun sôi vài phút trong dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch KOH 5%, để nguội. Soi trong kiềm hoặc rửa nước rồi sôi trong dung dịch glycerin. - Ngâm bột trong một ít nước Javel 50%, thỉnh thoảng khuấy đều. Thay dung dịch đến khi bột mất màu, rửa nhiều lần bằng nước cất. - Dược liệu có nhiều tinh bột (hạt, củ) thì làm sáng bột như sau: Lấy một ít bột đun nhẹ trong dung dịch cloral hydrat 50% vài phút. Soi trong dung dịch cloral hydrat. Đối với bột không thân nước, có thể dùng hỗn hợp cloral hydrat với glycerin tỉ lệ 1:2 ngâm 15 phút rồi đun sôi. - Dược liệu có nhiều chất béo (quả và hạt) thì loại chất béo và làm sáng như sau: Lấy một ít bột đun sôi trong acid nitric loãng 1 phút. Lọc, rửa cắn với nước sôi. Đun sôi cắn 1 phút trong dung dịch kiềm. Lọc và rửa cắn với nước sôi. Soi 4
trong glycerin. 3. Phương pháp nhuộm Để phân biêt màng tế bào còn cellulose hav đã được tẩm lignin (hóa gỗ), bột được nhuộm kép bằng dung dịch carmin 1% và lục iod 0,1% (hoặc các thuốc nhuộm tương tự). Sau mỗi giai đoạn, ly tâm để lấy được tất cả các phần tử bột. Để nhuộm màu hạt tinh bột, đặt ở mép lamelle một giọt dung dịch iod 1% (TT) (dung dịch Lugol). Dung dịch iod sẽ thấm vào làm hạt tinh bột nhuộm màu xanh tím. Để phát hiện các giọt dầu béo, tinh dầu hay chất nhựa, nhỏ vài giọt Sudan III lên bột, đế yên vài phút. Đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi: tinh đầu, chất béo, chất nhựa sẽ cho màu đỏ cam tới đỏ. II. THỰC HÀNH 1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1. Hoá chất và thuốc thử - Nước cất, glycerin 30%, dung dịch NaOH 5% (hay dd KOH 5%), dung dịch lavel 50%, dung dịch cloral hydrat 50%, dung địch carmin 1 %, dung dịch lục iod 0,1%. 1.2. Dược liệu - Trúc đào (Folium Nerii) lá của cây Trúc đào (.Nerium oleander L., Apocynaceae). - Hòe (Flos Styphnolobii japonici) là nụ hoa cùa cây Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott = Sophora japonica L., Fabaceae). - Cam thảo (Radix Glycyrrhizae) là rễ của cây Cam thảo bắc (Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC., Fabaceae). - Ngũ gia bì chân chim (Cortex Schefflerae heptaphyllae) là vỏ thân của cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera. heptaphylla (L.) Frodin, Araliaceae). - Đại hoàng (Rhizoma Rhei) là thân rễ của cây Đại hoàng (Rheum officinalis Baill., Polygonaceae). - Muồng trâu (Folium Cassiạe alatae) là lá của cây Muồng trâu (Senna alata (L.) Roxb. = Cassia alata L-, Fabaceae). - Nhàu (Radix Morindae citrifoliae) là rễ của cây Nhàu (Morinda citrifolia L., Rubiaceae). . - Ba dót (Folium Eupatorii) là lá của cây Ba dót (Eupatorium Jriplinerve Vahl., Asteraceae). 5
- Ngũ bội tử (Galla Chinensis) là tổ sâu ký sinh trên cây Muối (Rhus chinensis Mill., Anacardiaceae). Các dược liệu được xay mịn, rây và để vào các lọ riêng biệt có dán nhãn. Mỗi bột dược liệu có một dụng cụ lấy bột riêng. 2. Phương pháp tiến hành Ghi nhận đặc điểm cảm quan (màu sắc, mùi, vị, thể chất) của bột. Lấy một lượng bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lame), nhỏ 1-2 giọt chất lỏng để soi (thường là nước), khuấy kỹ. Đậy lamelle bằng cách đặt nghiêng một cạnh lamelle lên lame rồi hạ dần đầu kia của lamelle cho đến khi lamelle nằm ngang trên mặt lame. Dùng ngón tay đi nhẹ trên lamelle cho bột phân tán đều. Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle. Soi trên kính hiển vi, đầu tiên với vật kính 10x, sau đó với vật kính 40x. Mỗi dược liệu có đặc điểm bột khác nhau (Nếu có thể, nên xem vi phẫu trước rồi đối chiếu các đặc điểm vi phẫu để tìm các đặc điểm của bột). Ghi nhận và vẽ các đặc điểm quan sát được của bột, chú ý các thành phần đặc trưng. Mỗi bột nên soi 2 - 3 mẫu. 6
1. Trúc đào 1. Lông che chở đơn bào 2. Mảnh buồng ẩn khỗng 3. Mảnh mô mềm 4. Mạch vạch, vòng 5. Sợi có kèm tinh thể Calci oxalate hình khối 6. Tinh thể calci oxalate hình cầu gai 2. Cam thảo 1. Mảnh bần 2. Mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột 3. Sợi kèm tinh thể Calci oxalate hình khối 4. Tinh bột 5. Mạch mạng 6. Mạch chấm đồng tiền 7. Tinh thể calci oxalate hình khối rời 3. Hoa hòe 1. Lông che chở đơn bào 2. Lông che chở đa bào 3. hạt phấn có 3 lỗ nảy mầm 4. Mảnh đài mang lông che chở 5. Mảnh cánh hoa mang lông che chở và lỗ khí 6. Mạch vạch, mạch xoắn 7
4. Ngũ gia bì chân chim 1. Sợi có vách dày có khoang trao đổi 2. Các loại tế bào mô cứng 3. Mảnh bần 4. Mảnh mô mềm 5. Hạt tinh bột 6. Tinh thể calci oxalate hình khối 5. Rễ nhàu 1. Mảnh bần 2. Mảnh mô mềm 3. Bó sợi 4. Tinh bột 5. Tinh thể calci oxalate hình kim 6. Mạch điểm III. CÂU HỎI THẢO LUẬN - Khi soi bột dược liệu, nếu không tìm thấy cấu tử quan trọng của dược liệu đó bạn có suy nghĩ gì? (lấy ví dụ từ các dược liệu trên) - Để một tiêu bản bột dược liệu có đầy đủ các phần tử như tài liệu đã mô tả thì cần phải chuẩn bị mẫu bột soi như thế nào? 8
BÀI 2: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA CARBOHYDRAT Mục tiêu Sau khi thực hành bài “Dược liệu chứa carbohydrat”, sinh viên phải: - Phân biệt được một số loại tinh bột thường gặp bằng kính hiển vi. - Định tính được tinh bột và các sản phẩm thủy phân từng phần của tinh bột. - Xác định được chỉ số nở của dược liệu có chứa gôm, pectin hay chất nhầy. I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT Các polysaccharid trong tự nhiên được chia thành 2 nhóm lớn: - Homopolysaccharid: là các polysaccharid tương đối thuần nhất cấu tạo chỉ gồm 1 loại monosaccharid. Homopolysaccharid quan trọng trong ngành dược là tinh bột. - Heteropolysaccharid: là những polysaccharid có cấu tạo phức tạp của không dưới 2 loại monosaccharid. Theo truyền thống, các heteropolysaccharid thường được xếp vào các nhóm: gôm, chất nhày, pectin, thạch, alginat.v.v…. Trong tự nhiên, tinh bột tồn tại dưới dạng kết tinh tạo thành các hạt tinh bột trong tế bào thực vật. Tinh bột của các loài thực vật khác nhau có thể được phân biệt bằng hình dạng và kích thước của chúng dưới kính hiển vi. Quan sát tinh bột bằng kính hiển vi có thể kiểm tra được độ thuần nhất của tinh bột và phát hiện sự giả mạo. Tinh bột và các sản phẩm thoái giáng từng phần của tinh bột có thể định tính bằng dung dịch Iod 1% (TT) (dung dịch Lugol). Các dược liệu chứa gôm, pectin, chất nhầy có thể đánh giá bằng chỉ số nở dựa vào tính chất có thể hút nước và trương nở của các hợp chất này. 9
1.Hình dáng và kích thước hạt tinh bột Hình Đặc tính Loại tinh bột dạng Nhỏ (2-12μm) hạt đơn, hình đa giác nhiều cạnh, Tinh bột gạo Thường gặp hạt kép, có khi kết thành đám rất nhiều (Amylum Oryzae) Hình hạt tế bào là một chấm nhỏ, vân tăng trưởng không rõ Đa giác Hình dạng đa giác, hiếm khi hình tròn, kích thước 4 - Tinh bột Bắp 25 μm. (Amylum Maydis) Tễ hình chấm, hình sao, phân nhánh, không rõ. Tinh bột Sắn dây Hình chõm cầu, hay hình chuông nhỏ (2 - 10 μm) Hình (Amylum Puerariae) Tễ là 1 điểm chỏm Hình chõm cầu, hay hình chuông nhỏ, kích thước từ 5- Tinh bột khoai tây cầu 30μm (Amylum Manihot Tễ hình sao, rõ Hình dĩa, hình quả lê, đôi khi có rìa sứt mẻ, hạt to (30- Tinh bột Lúa mì 40 μm), hạt nhỏ (2-8μm), ít có hạt có kích thước trung Hình (Amylum Tritici) bình, tễ không rõ Đĩa Tinh bột Ý dĩ Tễ phân nhánh hình sao, hạt có kích thước trung bình. (Amylum Coicis) Kích thước trung bình 50μm, có hạt lên đến 80- Tinh bột Khoai tây 100μm. Thỉnh thoảng có hạt kép, 2 đến 3 (Amylum Solani Tễ là 1 điểm, có đầu hẹp, vân rõ Tinh bột Hoàng tinh. Tễ là một vạch ngắn nằm vuông gốc với với trục dài (Amylum của hạt tinh bột Hình Dioscoreae) Hạt tinh bột có khi lẹm trứng Tinh bột Đậu xanh Kích thước 50 μm (Amylum Phaseoli) Tễ dài, phân nhánh hình xương cá Tinh bột Hoài sơn Hạt tinh bột hình chuông, dài 20-80 μm, rộng 20 μm (Amylum Tễ hài, không phân nhánh, nhiều hạt không thấy tễ Dioscoreae) . 10
Tinh bột gạo Tinh bột bắp Tinh bột sắn dây Tinh bột đậu xanh Tinh bột ý dĩ Tinh bột hoài sơn Tinh bột khoai tây 11
2. Định tính tinh bột Tinh bột được cấu tao bởi 2 loại polysaccharid là amylose và amylopectin. Trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột và các sản phẩm thủy phân từng phần của nó là dextrin tồn tại dưới dạng các chuỗi xoắn, cứ 6 phân tử glucose lập thành một bước xoắn có thể hấp phụ 1 phân tử iod làm cho dung dịch có màu. Màu này thay đổi tùy thuộc vào cấu trúc của phân tử tinh bột ( tỷ lệ amylose / amylopectin) và chiều dài của phân tử. Amylose cho màu xanh dương đậm với Iod trong khi amylopectin lại cho màu tím đỏ với Iod. Khi đung nóng, các vòng xoắn này duỗi ra làm cho hồ tinh bột mất màu. Khi làm nguội, các phân tử có xu hướng trở về dạng chuỗi xoắn làm hồ tinh bột có màu trở lại. Khi thủy phân tinh bột (bằng enzym hay acid), phân tử tinh bột bị cắt ngắn dần làm cho màu của hồ tinh bột với iod chuyển từ xanh sang tím đỏ, đỏ nâu rồi tới không màu 3. Xác định chỉ số trương nở của dược liệu 3.1. Định nghĩa Chỉ số trương nở của một dược liệu là thể tích (ml) chiếm giữ của 1g dược liệu, sau khi để trương nở hoàn toàn trong nước (hoặc dung môi khác đã được quy định) thực hiện trong những điều kiện quy định. 3.2. Nguyên tắc Cho một lượng nước thừa (hay dung môi làm trương nở theo quy định của từng chuyên luận) vào một lượng cân biết trước của dược liệu (để nguyên hay được xay nhỏ). Đọc thể tích của dược liệu trương nở sau thời gian quy định và suy ra thể tích tương ứng với 1g dược liệu (chỉ số trương nở). DĐVN quy định tính hệ số trương nở từ kết quả trung bình của 3 lần thực hiện ( DĐVN III, 2002, trang PL-148). II. THỰC HÀNH 1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1. Hóa chất và thuốc thử Dung dịch HCl 2N; dung dịch Lugol (TT) 1.2. Dược liệu Các loại tinh bột: ▪ Tinh bột gạo ( Amylum Oryzae) lấy từ hạt của cây lúa ( Oryza sativa L., Poaceae). ▪ Bắp (Amylum Maydis) lấy từ hạt của cây Bắp ( Zea mays L., Poaceae). ▪ Lúa mì (Amylum Tritici) lấy từ hạt của cây lúa mì ( Triticum sp., poaceae). 12
▪ Khoai tây ( Amylum solani) lấy từ củ của cây Khoai tây (Solanum tuberosum L., solanaceae). ▪ Khoai mì ( Amylum Manihot) lấy từ củ của cây Khoai mì ( Manihot utilissima Pohl., Euphorbiaceae). ▪ Đậu xanh ( Amylum Phaseoli) lấy từ hạt của cây Đậu xanh (Phaseolus vulgaris L., Fabacceae). ▪ Sắn dây ( Amylum Puerariae) lấy từ củ của cậy Sắn dây ( Pueraria thomsoni Gagnep., Fabaceae). ▪ Ý dĩ ( Amylum Coicis) lấy từ hạt của cậy Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L., Poaceae) ▪ Hoài sơn ( Amylum Dioscoreae) lấy từ rể của cây Hoài sơn (Dioscorea persimilis Prain et Burkill., Dioscoreaceae). ▪ Hoàng tinh (Amylum Marantae) lấy từ rể củ của cây Hoàng tinh ( Maranta atundinacea L., Marantaceae). Dược liệu: ▪ Vỏ Bưởi ( Pericarpium Citri grandi) là vỏ quả giửa của cây Bưởi ( Citrus grandis(L) Osb., Rutaceae). ▪ Hạt É ( Semen Ocimi) là hạt của một số loài Ocimum spp., Lamiaceae) 2. Phương pháp tiến hành 2.1. Quan sát hạt tinh bột bằng kính hiển vi Nhỏ một giọt nước lên phiến kính (lame), dùng góc của phiến kính mỏng (lamelle) lấy một ít bột cho vào giọt nước đó và khuấy đều. Đậy nghiêng một cạnh lamelle lên lame rồi hạ dần đầu kia của lamelle cho đến khi lamelle nằm ngang trên mặt lame. Dùng ngón tay di nhẹ trên lamelle cho bột phân tán đều. Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle. Quan sát với vật kính 10x, sao đó là 40x và vẽ lại hạt tinh bột bằng bút chì đen. 2.2. Định tính tinh bôt. 2.2.1. Định tính tinh bột Hòa 1 gam tinh bột gạo với 30ml nước cất trong một becher 50ml, đun sôi 3 phút (khuấy đều). Dung dịch thu được là hồ tinh bột (A) có thể chất lỏng, trong mờ, hơi nhớt. Lấy 1 ml hồ tinh bột (A) cho vào 1 ống nghiệm, pha loãng với 5ml nước cất rồi thêm 1 giọt TT Lugol, sẽ xuất hiện màu xanh đậm. 13
Làm nóng nhanh dung dịch (nhúng ống nghiệm trong nước nóng) cho đến khi dung dịch còn màu tím nhạt, rồi làm nguội dung dịch (nhúng ống nghiệm trong nước lạnh) sẽ xuất hiện trở lại màu xanh (thường nhạt hơn khi chưa đung nóng). 2.2.2. Phản ứng thủy giải tinh bột Lấy 10 ml dung dịch hồ tinh bột nguội (A) của thử nghiêm 1 cho vào becher 100 ml, thêm 30ml nước cất và 20 ml dung dịch HCl 2N, khuấy đều. Lấy ngay dung dịch thu được cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Cho đồng loạt 6 ống vào nồi cách thủy đang sôi. Lần lượt lấy từng ống nghiệm ra ở các thời điểm sau 3, 5, 7, 9, 11 và 13 phút. Làm nguội nhanh ống nghiệm trong nước đá hoặc dưới vòi nước. Khi đã có đủ 6 ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 3 giọt dung dịch Lugol. Quan sát, nhận xét màu sắc và độ nhớt của các dung dịch so với ống chứng là hồ tinh bột trong nước cất có cùng nồng độ. Giải thích kết quả. 2.3. Xác định chỉ số nở của dược liệu Cân chính xác 1g bột dược liệu , làm ẩm với 1,0 ml ethanol 96%, cho vào 1 ống lường 50ml có nút mài. Thêm 25 ml nước và lắc đều theo chiều thẳng đứng của ống lường mỗi 10 phút trong vòng 1 giờ. Để yên trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng và đọc thể tích chiếm chỗ (tính bằng ml) của dược liệu bao gồm toàn bộ các chất nhầy bám dính. Tính chỉ số trương nở của mẫu thử từ kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm. III. GỢI Ý THẢO LUẬN 1. Những đặc điểm nào có thể giúp phân biệt các loại tinh bột? 2. Ý nghĩa của thử nghiệm định tính tinh bột với dung dịch Iod. Có thể dùng các phản ứng hóa học để phân biệt các loại tinh bột với nhau không? Tại sao? Vì sao chỉ số trương nở không được dùng như một chỉ tiêu định tính tinh bột 14
BÀI 3: DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN Mục tiêu Sau khi thực hành bài “Dược liệu chứa saponin ”, sinh viên phải:  Định tính được saponin trong mẫu dược liệu dựa trên các tính chất chung của saponin.  Xác định được chỉ số bọt và chỉ số phá huyết của mẫu dược liệu chứa saponin. I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT Saponin là một nhóm glycosid có cấu trúc triterpen hoặc steroid, thường gặp trong thực vật và đôi khi gặp trong động vật. Saponin có một số tính chất chung như tạo bọt bền khi lắc với nước, làm vỡ hồng cầu ở các nồng độ thấp, độc đối với cá, tạo phức với cholesterol hay với các dẫn chất β- hydroxy steroid. Các tính chất này được dùng để định tính và đánh giá saponin. Các saponosid thường dễ tan trong ethanol, methanol, butanol, nước và các hỗn hợp cồn nước; khó tan hoặc không tan trong các dung môi kém phân cực. Dạng aglycon (sapogenin) thì ngược lại, dễ tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan trong nước. Các tính chất này thường được dùng để chiết xuất và tinh chế saponin. Trong định tính, các saponin thường được chiết bằng cồn (EtOH, MeOH) với các độ cồn khác nhau, cô dịch chiết đến đậm đặc rồi kết tủa saponin bằng dung môi kém phân cực như ether, aceton v.v... Cũng có thể tinh chế saponin bằng cách phân bố giữa nước và n-BuOH bão hoà nước. Với thử nghiệm tính tạo bọt, tính phá huyết thì có thể sử dụng dịch chiết nước mà không cần tinh chế. Các thử nghiệm tạo bọt, phá huyết, độc đối với cá ... thường được dùng để nhận định saponin. Các phản ứng hóa học cũng được sử dụng nhưng mức độ đặc hiệu thấp so với các nhóm hợp chất khác. Sắc ký lớp mỏng Để định tính saponin, người ta còn dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Rf, màu sắc với các thuốc thử đặc hiệu của các vết trên sắc ký đồ là những yếu tố để nhận định sự có mặt của một saponin, một nhóm saponin trong hỗn hợp phân tích. Trong SKLM, Rf của chất A được định nghĩa là tỷ số giữa đoạn đường di chuyển của chất A (la) và đoạn đường di chuyển của dung môi (lo) tính từ mức xuất phát của mẫu thử: 15
Rfa = la / lo Trị số Rf luôn luôn < 1,00 và chỉ lấy đúng hai số lẻ (ví dụ 0,08; 0,60; 0,72...) Trong những điều kiện sắc ký nhất định, giá trị Rf của 1 chất là 1 trong những đặc trưng của chất đó trong hệ dung môi đã sử dụng. Tuy nhiên, giá trị Rf phụ thuộc vào khá nhiều yếu tố (bản chất, bề dày và độ hoạt hóa của pha tĩnh, pha động, mức độ bão hoà dung môi, độ ẩm và nhiệt độ của môi trường...). Để đánh giá saponin trong được liệu, chỉ số bọt (CSB), chỉ số phá huyết (CSPH) hay được dùng. Chỉ số bọt: là độ pha loãng cần thiết của 1 g dược liệu để tạo được một lớp bọt cao 1 cm sau khi ngưng lắc 15 phút, tiến hành trong điều kiện quy định. Chỉ số phá huyết: là số ml dung dịch đệm cần thiết để hòa tan các saponin có trong 1 g dược liệu gây ra sự phá huyết đầu tiên và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn, tiến hành trong điều kiện quy định. II. THỰC HÀNH 1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1. Dung môi, hóa chất, thuốc thử. - cồn 70% - Dung dịch NaCl 0,9% - methanol - Dịch treo máu 2% đã loại fibrin - ether ethylic - Dung dịch đệm đẳng trương - anhydrid acetic - Thạch (Agar-agar) - H2SO4 đậm đặc - Thuốc thử vanillin sulfuric (VS) mới pha Cách chuẩn bị dịch treo máu 2% đã loại fibrin Lấy máu từ động mạch của động vật có sừng (cừu, bò...) cho vào erlen hay bình cầu 250 ml, cho tiếp vào vài viên bi thủy tinh và lắc tròn nhẹ nhàng trong 10 phút. Lọc qua gạc để loại fibrin. Dịch thu được nếu bảo quản trong tủ lạnh (4 °C) có thể dùng được trong vài ngày. Khi dùng thì lấy dung dịch đệm đẳng trương hay dung dịch NaCl 0,9% pha dịch máu đã loại fibrin này thành dịch treo 2%. Cách pha dung dịch đệm đẳng trương Thành phần gồm: Dung dịch kali hydrophosphat 9,07% : 28 ml Dung dịch dinatri phosphat 11,87% : 162 ml NaCl tinh khiết : l.,8 g 16
Chuẩn bị đĩa thạch -máu Đun 1 g thạch với 100 ml dung dịch NaCl 0,9% trong một bình nón 250 ml cho đến khi thạch tan hết. Để hỗn hợp nguội tự nhiên đến khoảng 40 °c, thêm vào hỗn hợp này 10 ml máu đã loại fibrin. Khuấy đều hỗn hợp bằng đũa thủy tinh rồi đổ ra một đĩa petri. Để nguội tự nhiên, hỗn hợp sẽ đông lại tạo thành một đĩa thạch-máu. 1.2. Dược liệu  Bồ kết (Fructus Gleditschiae) là quả già của cây Bồ kết (Gleditschia fera (Lour.) Mot., Fabaceae).  Cam thảo (Rhizoma et Radix Glycyrrhizae) là thân rễ và rễ của cây Cam thảo (Glycyrrhiza glabra L. hay G. uralensis Fisch., Fabaceae).  Ngũ gia bì (Cortex Schefflerae heptaphyllae) là vỏ thân của cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Araliaceae).  Ngưu tất nam (Radix Achyranthis asperae) là rễ của cây cỏ xước (Ngưu tất nam - Achyranthes aspera L., Amaranthaceae).  Nhân sâm (Radix Ginseng) là rễ củ của Nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer, Araliaceae).  Tam thất (Radix Notoginseng) là rễ củ của cây Tam thất Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen, Araliaceae). 2. Nội dung thực hành 2.1. Thử nghiệm tính tạo bọt 2.1.1. Định tính tạo bọt Cho 0,5 g dược liệu vào ống nghiệm, thêm vào 10 ml cồn 70%, đun nhẹ trên cách thủy trong 5 phút rồi lọc qua bông. Bốc hơi dung môi trên cách thủy cho đến còn khoảng 2 ml. Lấy 10 giọt dịch chiết đậm đặc này cho vào một ống nghiệm 1,6 x 16 cm đã có sẵn 10 ml nước cất. Dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều đứng của ống nghiệm trong 1 phút (= 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả. Đánh giá kết quả: bọt bền trong 15 phút: (+); 30 phút: (++); 60 phút: (+++). 2.1.2. Xác định chỉ số bọt Cân chính xác 1 g bột dược liệu (đã qua rây 0,5 mm) cho vào một bình nón 250 ml, thêm 100 ml nước cất sôi. Đun trên cách thủy trong 30 phút, lọc nóng qua giấy lọc 17
(hay bông) vào một becher, khi dịch lọc nguội thì nhẹ nhàng chuyển dịch lọc vào 1 bình định mức 100 ml, dùng nước cất tráng becher rồi thêm vào bình định mức cho đủ 100 ml. Dung địch thu được gọi là dung dịch A (có độ pha loãng ban đầu là 100 lần). Lấy 10 ống nghiệm 1,6 x 16 cm, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt 1 ml, 2 ml, 9 ml, 10 ml dung dịch A. Thêm nước cất cho mỗi ống nghiệm đủ 10 ml. Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 15 giây (= 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm 15 phút và đo độ cao của cột bọt trong các ống nghiệm. Xác định kết quả  Trường hợp 1: Nếu tất cả các ống nghiệm đều có cột bọt < 1 cm thì chỉ số bọt của mẫu dược liệu sẽ nhỏ hơn 100 đơn vị (CSB < 100).  Trường hợp 2: Nếu tất cả các ống nghiệm đều có cột bọt > 1 cm thì CSB > 1000. Trong trường hợp này ta phải pha loãng dung dịch A (đang có độ pha loãng là 100) thêm k lần nữa (10, 50, 100 lần hoặc nhiều hơn nữa) cho đến khi có được một ống nghiệm có cột bọt bền vững cao 1 cm nằm ở khoảng giữa giai mẫu. k được gọi là độ pha loãng trung gian. Nêu không cần pha loãng thêm dung dịch A, khi ấy k = 1.  Trường hợp 3: Nếu 1 trong số 10 ống nghiệm có cột bọt cao đúng 1 cm thì chỉ số bọt chính là độ pha loãng của dung dịch trong ống nghiệm này.  Trường hợp 4: Nếu ở 2 ống nghiệm liên tiếp có cột bọt gần với trị số 1 cm (ống thứ [m] có cột bọt hơi thấp hơn 1 cm; ống [m+1] có cột bọt hơi cao hơn 1 cm thì CSB có thể được tính bằng phép nội suy từ 2 ống nghiệm ấy. Tính kết quả: 10 CSB   A k n Trong đó, n: số thứ tự của ống có cột bọt cao 1 cm A: độ pha loãng của dung dịch ban đầu k: độ pha loãng trung gian Ví dụ: Trong trường hợp thứ 3 - ống số 4 có cột bọt cao 1 cm (n = 4); - độ pha loãng của dung dịch A là 100 (A = 100), - dung dịch không cần pha loãng thêm (k = 1) 10 CSB   100  1  250 4 18
(Để ý rằng 10 / 4 chính là độ pha loãng của ống thứ 4 so với dịch chiết ban đầu). Ghi chú: Nếu ống có cột bọt cao 1 cm rơi vào ống gần đầu hoặc gần cuối của giai mẫu (tức là nồng độ quá đậm đặc hoặc quá loãng) thì phải pha loãng lại dung dịch A sao cho ống có cột bọt cao 1 cm nằm giữa giai mẫu để kết quả thu được chính xác hơn. 2.2. Thử nghiệm tính phá huyết 2.2.1. Định tính trong ống nghiệm. Cho khoảng 0,1 g bột dược liệu vào một ống nghiệm lớn (16 x 16). Thêm vào 5 ml dung dịch đẳng trương (dung dịch NaCl 0,9% hay dung dịch đệm phosphat đẳng trương). Đun hỗn hợp trong bếp cách thủy 95-98 °c trong 10 phút, lọc nóng qua giấy hay bông lấy dịch trong, để nguội. Lấy dịch lọc nguội này (# 4 ml) cho vào 1 ống nghiệm, thêm vào đó 1 ml dịch treo máu 2% (đã loại fibrin), lắc nhẹ cho 2 dung dịch trộn đều. Quan sát dung dịch trong ống nghiệm sau 30 phút, 60 phút. Nếu có hiện tượng tiêu huyết thì dung dịch trở nên trong suốt, có màu hồng đỏ. Xem lại kết quả sau 12 - 24 h. 2.2.2. Định tính trên lam kính Nhỏ 1 giọt máu (đã loại fibrin) lên một lam kính. Thêm 2-3 giọt dung dịch đệm, soi kính hiển vi (40 x) sẽ thấy các hồng cầu nguyên vẹn. Nhỏ tiếp lên lam kính 2-3 giọt dung dịch saponin 1% (trong dung dịch đệm). Quan sát hiện tượng vỡ hồng cầu qua kính hiển vi. 2.2.3. Định tính trên thạch máu Dùng dụng cụ đục lỗ, đục 5 lỗ trển đĩa thạch máu. Dùng pipet nạp một thể tích như nhau các dịch chiết saponin có nồng độ khác nhau (pha trong dung dịch NaCl 0,9%) vào gần đầy (khoảng 2/3) giếng thử (nhớ ghi chú ở mặt sau đáy đĩa). Để yên rồi quan sát và đo đường kính (d, milimet) của vòng phá huyết ở từng giếng thử sau 12-24 giờ. Trong cùng một điểu kiện thử nghiệm, đường kính vòng phá huvết (d) càng lớn thì saponin trong mẫu thử có tính phá huyết càng mạnh. 2.2.4. Xác định chỉ số phá huyết (CSPH) Cân chính xác 1 g bột dược liệu (đã qua rây 0,5 mm) vào một bình nón 250 ml. Thêm vào đó 100 ml dung địch đệm vừa đun sôi. Đun tiếp 30 phút trên bếp cách thủy 95- 98°c. Lọc nóng qua bông hay giấy lọc lấy dịch trong vào 1 becher. Để nguội dịch lọc rồi nhẹ nhàng cho vào 1 bình định mức 100 ml. 19
Dùng dung dịch đệm nguội tráng becher rồi thêm vào bình định mức cho đủ 100 ml. Đây là dung dịch A có độ pha loãng cơ bản A = 100. Lấy 10 ống nghiệm nhỏ (cỡ 5 ml), đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Cho lần lượt vào các ống nghiệm này 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml;..1,0 ml dung dịch A. Thêm dung dịch đệm vào từng ống nghiệm cho đủ 1,0 ml. Lắc nhẹ cho đều rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 1,0 ml dịch treo máu 2%. Lắc nhẹ hỗn hợp cho đều rồi để yên, sau 15 phút lại lắc nhẹ lần thứ hai rồi để yên, đậy nút bông. Đọc và nhận định kết quả sau 12 - 24 giờ. Nhận định kết quả Xác định ống nghiệm có hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn, đó là ống hội đủ 3 điều kiện: có nồng độ thấp nhất (ống có số thứ tự nhỏ nhất); dung dịch trong ống có màu hồng đỏ đều và không có hồng cầu lắng xuống đáy. Tính chỉ số phá huyết (CSPH) của dược liệu theo công thức : 1 CSPH   A k x Trong đó, A: độ pha loãng của dung dịch thử. x: số ml dung dịch thử trong ống nghiệm có hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn. k: độ pha loãng trung gian Ghi chú: - Cần dò thử độ pha loãng có thể gây nên hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn bằng cách pha các dịch thử để có n khoảng chừng 100, 250, 500... rồi dùng 1 ml các dịch thử này và tiến hành thử nghiệm như cách xác định chỉ so phá huyết. Dịch chiết đầu tiên gây hiện tượng phá huyết hoàn toàn của dãy này (n nhỏ nhất trong số các dịch gây phá huyết hoàn toàn) sẽ được dùng cho thử nghiệm chính thức xác định CSPH. - Điều kiện tiến hành phải đúng quy định :  Độ mịn của dược liệu phải đúng quy định.  Điều chế dịch thử đúng cách, chỉ lắc nhẹ ống nghiệm để tránh tạo bọt...  Phải dùng dung dịch đệm đẳng trương để chiết xuất và pha dịch thử. Nếu không có dung dịch đệm đẳng trương này thì có thể dùng dung dịch NaCl 0,9% nhưng phải ghi rõ khi biểu thị kết quả. 20