Báo cáo kết quả đề tài cấp Bộ năm 2008: Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính bạch đàn và quy trình nhân nhanh Invitro một số dòng bạch đàn ưu trội của vườn giống Fortip Vạn Xuân phục vụ sản xuất

Chia sẻ: Lê Thị Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống từ cây ghép của 20 dòng đã được chọn lọc và tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho 5 dòng ưu trội nhất từ 20 dòng đã chọn lọc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo kết quả đề tài cấp Bộ năm 2008: Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính bạch đàn và quy trình nhân nhanh Invitro một số dòng bạch đàn ưu trội của vườn giống Fortip Vạn Xuân phục vụ sản xuất

BỘ CÔNG THƯƠNG TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY ……………………*…………………… BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI CẤP BỘ NĂM 2008 TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VƯỜN GIỐNG VÔ TÍNH BẠCH ĐÀN VÀ QUY TRÌNH NHÂN NHANH INVITRO MỘT SỐ DÒNG BẠCH ĐÀN ƯU TRỘI CỦA VƯỜN GIỐNG FORTIP VẠN XUÂN PHỤC VỤ SẢN XUẤT CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. PHẠM ĐỨC HUY 7116 17/02/2009 PHÚ THỌ, THÁNG 12/2008
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HSNC: Hệ số nhân chồi TLCHH: Tỷ lệ chồi hữu hiệu BAP: 6-Benzylaminopurine NAA: 1-Naphtalene acetic acid IBA: 3-Indolbutiric acid Hvn (m): Chiều cao vút ngọn Dg (cm): Đường kính phía trên vị trí ghép Dt (m): Đường kính tán lá S (%): Tỷ lệ sống N: Số mẫu kiểm tra
MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TÓM TẮT 1 I. TỔNG QUAN 2 1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài 2 1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài 2 1.2.2. Mục tiêu của đề tài 3 1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu 4 1.3.1. Địa điểm nghiên cứu 4 1.3.2. Đối tượng nghiên cứu 4 1.3.3. Nội dung nghiên cứu 4 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu 5 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 5 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 7 II. THỰC NGHIỆM 9 2.1. Phương pháp nghiên cứu 9 2.1.1. Trồng vườn giống 9 2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu 10 2.1.3. Thử nghiệm nhân giống invitro 10 2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu 11 2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản 11
2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và 11 TLCHH 2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm 13 2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu 13 2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 15 2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận 16 2.3.1. Trồng vườn giống 16 Điều tra chọn địa điểm và thu thập điều kiện tự nhiên của địa 2.3.1.1. 16 điểm thiết lập vườn giống 2.3.1.2. Thiết kế và trồng vườn giống 16 2.3.1.3. Sinh trưởng của các dòng ở 6 tháng tuổi 16 2.3.2. Trồng vườn vật liệu 21 2.3.3. Thử nghiệm nhân giống invitro 21 2.3.3.1. Nghiên cứu môi trường cơ bản thích hợp cho nhân nhanh chồi. 21 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu 2.3.3.2. 23 hiệu Ảnh hưởng của BAP và NAA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ 2.3.3.3. 26 chồi hữu hiệu Ảnh hưởng của BAP và IBA đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi 2.3.3.4. 30 hữu hiệu
2.3.2.5. So sánh HSNC và TLCHH giữa 5 dòng 31 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 3.1. Kết luận 33 3.2. Kiến nghị 33 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHẦN PHỤ BIỂU
TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu xây dựng vườn giống vô tính Bạch đàn và quy trình nhân nhan in vitro một số dòng Bạch đàn ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất” được thực hiện trong 2 năm (2007 và 2008). Năm 2007, đề tài đã chọn lọc được 20 cây trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân, thử nghiệm các phương pháp ghép và tạo được 400 cây ghép với cành ghép được lấy từ 20 cây trội đã chọn lọc Năm 2008, đề tài đã thực hiện 2 mục tiêu chính là xây dựng vườn giống từ cây ghép của 20 dòng đã được chọn lọc và tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cho 5 dòng ưu trội nhất từ 20 dòng đã chọn lọc. Vườn giống được trồng tháng 6 năm 2008, diện tích 1,0 ha tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty lâm nghiệp Lập Thạch – Vĩnh Phúc. Các dòng cây ghép cho tỷ lệ sống cao, biến động từ 82-100%. Đến nay sinh trưởng của các dòng cây ghép tương đối tốt và không bị sâu bệnh. Đề tài thực hiện các thử nghiệm nhân giống in vitro giai đoạn nhân chồi bao gồm: thử nghiệm môi trường cơ bản, nồng độ BAP, ảnh hưởng phối hợp của BAP + NAA và BAP + IBA. Đề tài chọn được môi trường MS + 30g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0mg/l vitaminB2 + 1.5mg/l BAP + 1.5 mg/l NAA, pH =6 là thích hợp nhất trong các môi trường đã thử nghiệm và cũng là môi trường phù hợp cho cả 5 dòng tiến hành nghiên cứu. 1
I. TỔNG QUAN 1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài. - Căn cứ quyết định số 1999/QĐ-BCT, ngày 03/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Công nghiệp về việc giao kế hoạch khoa học và công nghệ năm 2008 cho Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy. - Căn cứ hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 45.08 RD/HĐ-KHCN, ngày 23/01/2008. - Căn cứ quyết định số 12/QĐ-KHTH, ngày 28/01/2007 của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ. - Căn cứ quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống và vườn giống (QPN 15 – 93) của Bộ Lâm nghiệp ngày 02/11/1993 (chi tiết xem phụ biểu 5). 1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài. 1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài. Ở nước ta hiện nay, cây Bạch đàn (Eucalyptus) là một trong những loài cây trồng rừng chủ lực trên hầu hết các vùng sinh thái nhằm đáp ứng các nhu cầu nguyên liệu giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ và củi. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, năng suất rừng trồng bạch đàn đã được cải thiện rõ rệt nhờ kết quả của các chương trình cải thiện giống. Giai đoạn từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Bạch đàn, Keo lá tràm và Keo tai tượng với nguồn hạt được lấy từ các giống, xuất xứ triển vọng trong và ngoài nước. Dự án cũng đã xây dựng được nhiều vườn giống, rừng giống thế hệ 1 và thế hệ 1.5 đáp ứng nhu cầu giống cho nghiên cứu và sản xuất [3]. Vườn giống Bạch đàn tại Vạn Xuân, Phú Thọ gồm 144 gia đình được thiết lập năm 1996 là một trong những vườn giống có nhiều gia đình và cá thể có năng suất rất cao trong dự án FORTIP nói trên. Đây là nguồn vật liệu quý cần để chọn lọc những dòng có năng suất cao từ đó nhân giống phục vụ trồng rừng và 2
xây dựng vườn giống cho phục phụ các chương trình nghiên cứu cải tạo giống tiếp theo. Đồng thời, để đạt được kết quả tốt thì một chương trình cải thiện giống không chỉ dừng lại ở chỗ có được những giống được cải thiện mà giống đó phải được nhân rộng phục vụ sản xuất và cung cấp vật liệu cho các chương trình cải thiện giống khác. Do đó, yêu cầu cần thiết là xây dựng vườn giống từ các dòng đã chọn lọc và tiến hành nhân giống vô tính phục vụ cho trồng rừng thử nghiệm từ đó từng bước đưa cây giống chất lượng cao vào trồng rừng sản xuất. Trong xây dựng rừng giống, vườn giống, để tăng phẩm chất di truyền của hạt giống, người ta thiết lập vườn giống bằng cây ghép với cành ghép lấy từ cây tuyển chọn và gốc ghép là cây có sức chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như khí hậu, đất đai, sâu bệnh...vv. Vườn giống trồng từ cây ghép có nhiều ưu điểm rõ rệt so với vườn giống trồng từ hạt như nhanh ra quả, duy trì các đặc tính di truyền của cây mẹ [12]. Về nhân giống vô tính, hiện nay ở nước ta thì nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp ưu thế nhất. Đặc biệt trong nhân giống cây bạch đàn nói riêng và cây lâm nghiệp nói chung thì đây là phương pháp cho hiệu quả rõ rệt nhất. Từ những đặc điểm trên, xây dựng vườn giống bằng cây ghép với cành ghép từ những cây ưu trội của vườn giống FORTIP Vạn Xuân và thử nghiệm nhân giống in vitro là cần thiết. Xây dựng vườn giống cung cấp nguồn hạt giống cho khảo nghiệm chọn lọc giống mới và phục vụ lai tạo giống. Thử nghiệm nhân giống in vitro nhằm tạo cây con phục vụ khảo nghiệm dòng vô tính, công nhận giống mới và phát triển vào sản xuất. 1.2.2. Mục tiêu của đề tài. 1) Xây dựng vườn giống từ cây ghép của các dòng bạch đàn năng suất cao tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân. 2) Xác định điều kiện nuôi cấy in vitro (môi trường hóa học) thích hợp để nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc tại vườn giống FORTIP Vạn Xuân phục vụ sản xuất. 3
1.3. Địa điểm, đối tượng và nội dung nghiên cứu. 1.3.1. Địa điểm: Vườn giống được thiết lập tại Đội Ngọc Mỹ - Công ty Lâm nghiệp Lập Thạch với diện tích 1,0 ha. Vườn vật liệu và thử nghiệm nhân giống in vitro tại Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy. 1.3.2. Đối tượng nghiên cứu • Cây trồng vườn giống: Vườn giống được trồng từ cây ghép với cành ghép lấy từ 20 cây trội được chọn lọc của vườn giống Vạn Xuân (20 cây trội đã được chọn năm 2007 của đề tài này chi tiết xem phụ biểu 1). Cây ghép đem trồng là cây có vết ghép đã ổn định. Sinh trưởng phát triển tốt, không sâu bệnh, tán lá phát triển cân đối, chiều cao > 50cm. • Cây thử nghiệm nuôi cấy in vitro: Từ 20 cây trội đã chọn lọc, đề tài lựa chọn 5 cây có thể tích thân cây cao nhất làm đối tượng để tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro, cụ thể là các cây trội sau: Cây trội số 154, 141, 122, 136 và 126 (đặc điểm cụ thể của 5 cây trội thử nghiệm nhân giống in vitro xem phụ biểu 1). 1.3.3. Nội dung nghiên cứu. Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: 1. Điều tra chọn địa điểm thiết lập vườn giống. 2. Thu thập điều kiện tự nhiên, đất đai của địa điểm thiết lập vườn giống. 3. Thiết kế và trồng vườn giống. 4. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu phục vụ cho nuôi cấy in vitro. 5. Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 6. Thu thập các chỉ tiêu nghiên cứu, xử lý số liệu và viết báo cáo khoa học. 4
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu. 1.4.1. Trong nước. Ở Việt Nam, từ năm 1996-1999, dự án FORTIP (Regional Project on Forest Tree Improvement) về cải thiện giống cây rừng đã xây dựng 46 ha rừng giống và vườn giống cho các loài cây Keo lá tràm, Keo tai tượng và Bạch đàn với nguồn hạt được lấy từ các xuất xứ tốt trong và ngoài nước. Các gia đình trồng trong vườn giống theo khối, lặp lại 8 lần. Sau đó đánh giá sinh trưởng và giữ lại những gia đình tốt nhất có triển vọng [3]. Ngoài diện tích rừng giống trên, hiện nay nước ta chiếm đa số là các rừng giống được chuyển hoá từ rừng tự nhiên hoặc rừng trồng, nên phẩm chất di truyền của hạt giống còn thấp. Chúng ta có khoảng 2.000 ha rừng giống và vườn giống các loại như Thông 3 lá ở Lâm Đồng, Thông Nhựa ở Quảng Bình, Tếch ở Định Quán, Keo và Bạch đàn ở Vùng Trung tâm Bắc bộ. Vấn đề xây dựng rừng giống đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy quan tâm từ lâu, năm 1996 Viện đã chuyển hoá được 10,3 ha rừng giống từ rừng trồng với nguồn hạt nhập nội. Hiện nay, rừng giống chuyển hoá này đã cho hiệu quả kinh tế rõ rệt, rừng trồng từ nguồn hạt này cho năng suất và chất lượng rừng tăng lên rõ rệt. Trong những năm gần đây, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã xây dựng vườn giống Bạch đàn ghép tại Ba Vì phục vụ cho công tác lai tạo. Đây cũng là một trong số rất ít vườn giống cây lâm nghiệp được trồng bằng cây nghép ở nước ta [3]. Đối với lĩnh vực nhân giống in vitro, mặc dù còn nhiều khó khăn cần giải quyết, song trong những năm gần đây, việc áp dụng các biện pháp nhân giống in vitro vào nghiên cứu và thực tiễn sản xuất trong lâm nghiệp đã thu được kết qủa đáng khích lệ. Một số cơ sở đã tiến hành nhân giống in vitro ở quy mô công nghiệp như Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy – Phù Ninh – Phú Thọ, Lâm trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh, Công ty Giống cây Lâm nghiệp Trung ương, …vv. Đồng thời, một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy in vitro để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã có những thành công bước đầu. 5
Một số loài cây trồng rừng quan trọng, một số loài cây quý hiếm đã được nghiên cứu và sản xuất. Cây Bạch đàn (Eucalyptus), cây Tếch (Techtona grandis), cây Hông (Paulownia fortunei) đã được Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh sản xuất ở quy mô công nghiệp; cây Keo lai (A. mangium x A. auriculiformis) cây Trầm gió (Aquilaria crassna Pierri), cây tre Tàu (sinocalamus latiflus), tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) và nhiều loài cây khác đã nghiên cứu thành công. Các kết quả này cho thấy bước đầu có nhiều triển vọng cho sản xuất cây con giống chất lượng cao. Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy in vitro cây bạch đàn urô dòng U6 như sau: môi trường nhân chồi là MS + 3% đường + 4.5 g/l agar + 0.5 mg/l BAP + 0.25 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh là MS 1/4 nồng độ + 1.5 % đường + 5 g/l agar + 1 mg/l IBA [2]. Nhóm tác giả của Viện Sinh học nhiệt đới, Sở NN&PTNT Kiên Giang và Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM đã nghiên cứu và đưa ra môi trường nuôi cấy cây Trầm hương (Aquilaria crassna) là WPM + 0.1 mg/l BA + CW (10%) cho phát sinh chồi. Môi trường thuận lợi cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là WPM + BA (0.1 mg/l) + NAA (0.1 mg/l) [7]. Cũng với cây trầm, Đoàn Thị Mai và cộng sự đã đưa ra môi trường nhân chồi thích hợp là MS cải tiến bổ sung 1.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l kinetin. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là 1/2 MS cải tiến bổ sung 2.0 mg/l IBA [5]. Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và tre Mạnh tông (Dendrocalamus asper) với mẫu vật được lấy từ hạt và được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 15 phút, HgCr2 trong 5 phút. Qua nhiều công thức thí nghiệm, nghiên cứu thu được kết quả sau: Tạo chồi từ hạt tốt trên môi trường MS có BA 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l; nhân chồi tốt trên môi trường MS có BA 2mg/l và kinetin 1 mg/l; chồi, cây con ra rễ và sinh trưởng thành cây hoàn chỉnh tốt trên môi trường có nồng độ khoáng MS giảm 1/2 và IBA 10 mg/l [10]. Nhân giống vô tính cây Hông (Paulownia fortunei) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Mẫu nuôi cấy tạo vật liệu ban đầu từ chồi đỉnh và chồi bên. Mẫu vật được khử trùng bằng hypoclorit canxi trong 20 phút sau đó cấy vào các loại môi trường khác nhau. Kết quả thu được như sau: môi trường thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi là MS cải tiến có bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 5 6
mg/l BA và 0.1 mg/l NAA. Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2 dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường + 0.1 mg/l NAA + 1.0 g/l than hoạt tính [13]. 1.4.2. Ngoài nước. Ở các nước có nền lâm nghiệp phát triển, mạng lưới cung ứng giống được xây dựng khá hoàn chỉnh. Mỗi địa phương đều có rừng giống và vườn giống cung cấp nguồn hạt giống, vật liệu nhân giống cho địa phương đó. Do vậy chủ động nguồn giống cho các chương trình trồng rừng của khu vực. Ngoài vườn giống lấy hạt, một số nước còn thiết lập vườn giống nghiên cứu hay còn gọi là ngân hàng dòng (clone banks) với mục đích là lưu giữ và bảo tồn các giống đã tuyển chọn phục vụ cho các chương trình cải thiện giống dài hạn nhằm sản xuất một lượng lớn hạt giống từ những dòng ưu tú đã chọn lọc. Trong lĩnh vực nhân giống in vitro, môi trường hóa học dùng cho các loài cây thân gỗ rất đa dạng, tuy nhiên người ta thường sử dụng 5 loại môi trường sau[14]: Môi trường khoáng MS (Murashige & Skoog, 1962) là môi trường cơ bản, giàu dinh dưỡng thích hợp cho các loài thực vật nói chung. Môi trường này không chỉ đơn thuần sử dụng trong nuôi cấy mô mà nó còn được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, nuôi cấy phôi vô tính, nuôi cấy hạt phấn, bao phấn…vv. Môi trường MS cải tiến (Murashige & Skoog medium including Nitsch vitamins, 1969). Đây là môi trường MS (1962) được bổ sung thêm một số loại vitamin. Thành phần môi trường được nghiên cứu và công bố bởi Nitsch năm 1969, môi trường này được sử dụng để nuôi cấy nhiều loài cây khác nhau trong đó có cây mận (Prunus spp), cây ôliu (Olea europaea)…vv. Môi trường WPM (Woody Plant Medium) được Mccown đưa ra vào năm 1980 là môi trường thường được dùng để nuôi cấy các loài cây gỗ. Đã có nhiều công trình nuôi cấy in vitro sử dụng môi trường này như nhân giống thông (Loblolly pine, Pinus taeda) ở Mỹ. 7
Môi trường Litvay là môi trường mà tên môi trường được lấy từ tên tác giả nghiên cứu ra (Litvay J.D, 1985). Đây cũng là môi trường được tác giả sử dụng để nuôi cấy cây thông nói chung (Pinus). Môi trường WV3 (Westvaco3 Medium, 1997) là môi trường đã được sử dụng để nuôi cấy cây thông, cây dương. lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Ôxtrâylia,…vv. Công trình của M.E.cortezzi Graca và S.Mendes thuộc Trung tâm nghiên cứu lâm nghiệp Curitiba, Brazil đã nuôi cấy in vitro cây Bạch đàn (Eucalyptus dunnii Maid) tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,01 mg/l IBA[16]. I. Joihs và cộng sự của Viện nghiên cứu lâm nghiệp Ấn Độ đã nuôi cấy thành công cây Bạch đàn lai (E.terecornis x E.gandis) trên môi trường MS + BAB 1,0mg/l và NAA 1,0 mg/l[15]. 8
II. THỰC NGHIỆM. 2.1. Phương pháp nghiên cứu. 2.1.1. Trồng vườn giống. Vườn giống được trồng theo quy phạm kỹ thuật xây dựng rừng giống, vườn giống hiện hành của Bộ NN&PTNT (Quy phạm ngành 15-93) và các tiêu chuẩn kỹ thuật trong trồng rừng Bạch đàn. a) Xử lý thực bì. Thực bì được phát trắng toàn diện theo lô, sau đó xếp thực bì theo băng rộng 2m và đốt hoàn toàn. Thực bì được xử lý trước khi cuốc hố 20 ngày. b) Làm đất. Hố trồng được cuốc với kích thước 60x60x60cm. Trước khi trồng 10 ngày bón lót 500g/hố phân NPK 10-5-5 và 10kg/hố phân chuồng hoai sau đó trộn phân và lấp đất đầy hố cao hơn mặt đất tự nhiên 5cm . c) Trồng và chăm sóc vườn giống Cự ly trồng là 6m x 6m (hàng cách hàng 6m và cây cách cây 6m), mật độ 277 cây/ha. Thời vụ trồng vào vụ xuân từ 15/02 đến 15/05. Hàng nằm trên đường từ chân lên đỉnh theo hướng Đông – Tây. Các dòng được trồng theo hàng có chuyển dịch sao (phụ lục 4) cho các cây cùng một dòng cách xa nhau nhằm hạn chế tối đa sự giao phấn trong cùng một dòng Thường xuyên kiểm tra, theo dõi và cắt tỉa các chồi phát sinh ở phần gốc ghép. Chăm sóc năm 1 (năm 2008) 3 lần, cụ thể như sau: Lần 1: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,5 – 0,6m. Tiếp tục trồng dặm cây chết, thời gian chăm sóc từ 1-1,5 tháng, thời gian chăm sóc vào tháng 5-6. Lần 2: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích, rẫy cỏ và xới vun đất màu xung quanh gốc với đường kính từ 0,6 – 0,8m. Thời gian chăm sóc vào tháng 8-10. Bón thúc 500gam phân NPK Lần 3: Phát thực bì cạnh tranh, cắt dây leo trên toàn diện tích. 9
Theo dõi, thu thập số liệu của vườn giống. Theo dõi thu thập các chỉ tiêu Hvn; Hg; Dt; sâu bệnh và phẩm chất cây: tốt, xấu, trung bình. - Cây tốt: là cây sinh trưởng tốt, tán lá xanh đẹp, phát triển cân đối, không sâu bệnh. - Cây trung bình: là cây sinh trưởng phát triển ở mức độ trung bình, không sâu bệnh. - Cây xấu: là cây sinh trưởng kém, còi cọc, sâu bệnh. 2.1.2. Trồng và chăm sóc vườn vật liệu Vườn vật liệu được trồng từ cây ghép của 5 cây trội chọn lọc. Cây được trồng ra đất theo luống, giữa các luống cách nhau 0,5m. Cây được trồng theo hàng trên luống với cự ly 25 x 25cm, mỗi giống trồng 20 cây. Trước khi trồng làm đất toàn diện và nhặt sạch cỏ, khi trồng bón lót 100g phân NPK cho mỗi hố. Vườn vật liệu được tưới chăm sóc và rẫy nhổ cỏ và cắt tỉa tạo chồi thường xuyên nhằm cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho nhân giống in vitro. 2.1.3. Thử nghiệm nhân giống in vitro. Sơ đồ chung của phương pháp nhân giống in vitro Cây trội (đối tượng cần nhân giống). Xử lý cho nảy chồi và cắt mẫu. Khử trùng mẫu nuôi cấy Cấy mẫu vào Môi trường tái sinh chồi (giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu). 5 loại môi trường khác nhau để tìm ra môi trường thích hợp nhất. Nuôi mẫu trong tủ lạnh. Tăng tỷ lệ sống của mẫu nuôi cấy. Môi trường nhân nhanh chồi. Môi trường được bổ sung auxin, cytokinin, các chất đa lượng, vi lượng và vitamin với tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi. 10
Nội dung cụ thể của phương pháp như sau: 2.1.3.1. Phương pháp cắt, rửa và khử trùng mẫu cấy • Cắt mẫu. Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở chồi từ 30-40 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá (cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 1.5-3.0 cm, đường kính mẫu cấy từ 1-2 mm, mang từ 2-3 nách lá trong đoạn từ lá thứ 3 đến lá thứ 6. • Khử trùng mẫu Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước. Sau đó rửa mẫu bằng nước 3 lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất. Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng. Khử trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng, khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 11 phút. 2.1.3.2. Thử nghiệm và chọn môi trường cơ bản. Đề tài tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 loại môi trường sau có bổ sung sucrose 30g/l; 4.5g/l agar, 2.0mg/l vitamin B2, pH=6 và không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (thành phần 5 loại môi trường xem phụ biểu 2)[14]. 1. Công thức 1: Môi trường Litvay. 2. Công thức 2: Môi trường MS. 3. Công thức 3: Môi trường MS cải tiến. 4. Công thức 4: Môi trường WPM. 5. Công thức 5: Môi trường WV3. 6. Công thức 6: Đối chứng (môi trường nuôi cấy dòng PN14 không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng)[8]. 2.1.3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến HSNC và TLCHH. Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nhân giống. Trong môi trường nhân giống in vitro người ta thường sử dụng 11
các chất kích thích sinh trưởng trong nhóm auxin như NAA và IBA. Các chất trongvà cytokinin . Auxin được sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh rễ. Cytokinin sử dụng để điều chỉnh sự phát sinh chồi. Tỷ lệ cân đối giữa auxin/cytokinin tạo cây hoàn chỉnh [1]. Trong nhân giống in vitro, người ta thường sử dụng auxin là IAA, NAA và IBA, cytokinin là BAP, BA và kinetin. • Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu. Từ môi trường cho HSNC tốt nhất ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của môi trường cơ bản đến HSNC (MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2, pH=6) chúng tôi tiến hành bổ sung BAP ở mức các nồng độ thay đổi như sau: Công thức 7: Nồng độ 0,5 mg BAP/l. Công thức 8: Nồng độ 1,0 mg BAP/l. Công thức 9: Nồng độ 1,5 mg BAP/l. Công thức 10: Nồng độ 2,0 mg BAP/l. Công thức 11: Nồng độ 2,5 mg BAP/l. Công thức 12: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14). • Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH. Để tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi trong sự tương tác với BAP và cũng là để tìm ra môi trường thích hợp cho nhân chồi 5 dòng nghiên cứu, đề tài tiến hành bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường MS + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP, pH=6 (môi trường cho HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên). Nồng độ NAA trong môi trường thay đổi như sau: Công thức 13: Nồng độ 0,5 mg/l NAA Công thức 14: Nồng độ 1,0 mg/l NAA Công thức 15: Nồng độ 1,5 mg/l NAA Công thức 16: Nồng độ 2,0 mg/l NAA Công thức 17: Nồng độ 2,5 mg/l NAA Công thức 18: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14). 12
• Ảnh hưởng phôi hợp của BAP và IBA đến HSNC và TLCHH. Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA, đến HSNC và TLCHH của 5 dòng nghiên cứu. Đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAB và IBA đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi. Môi trường WPM + 30 g/l sucrose + 4.5g/l agar + 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP, pH=6 được bổ sung IBA ở mức các nồng độ (mg/l) thay đổi như sau: Công thức 19: Nồng độ 0,05 mg/l IBA Công thức 20: Nồng độ 0,10mg/l IBA Công thức 21: Nồng độ 0,15 mg/l IBA Công thức 22: Nồng độ 0,20 mg/l IBA Công thức 23: Nồng độ 0,25 mg/l IBA Công thức 24: Đối chứng (môi trường sản xuất dòng PN14). 2.1.3.4. Điều kiện thí nghiệm Sau khi cấy mẫu được duy trì trong tủ lạnh (ngăn mát 120C±1) 48 giờ. Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau: - Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn nêon với cường độ ánh từ 1000 – 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. - Nhiệt độ: duy trì nhiệt độ trong phòng từ 23 – 270C. - Độ ẩm: thường xuyên xấp xỉ 60%. Các thí nghiệm chọn loại môi trường cơ bản, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu sống (ống nghiệm). Vì giai đoạn này tỷ lệ chồi hữu hiệu chưa thể hiện rõ nên đề tài chỉ đánh giá kết quả qua HSNC sau 4 tuần nuôi cấy. Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 6 chồi nuôi cấy. Môi trường chứa trong bình tam giác. Đánh giá kết quả qua HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy. Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại, mỗi lần 60 mẫu. 2.1.3.5. Thu thập và xử lý số liệu. Thu thập các chỉ tiêu - Số chồi mới tạo thành. 13
- Số chồi hữu hiệu: Những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Ghi tình trạng phát triển của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những chồi chết, chồi bị đen. ∑ Chồi tạo thành HSNC (lần) = ----------------------- ∑ Chồi ban đầu ∑ Chồi hữu hiệu TLCHH (%) = -------------------- x 100 ∑ Chồi tạo thành Xử lý số liệu. - Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel. - Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố bằng phần mềm SPSS 16.0. Sử dụng tiêu chuẩn Duncan để phân nhóm và tìm ra công thức thí nghiệm tốt nhất, cụ thể như sau: Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dòng có sinh trưởng và phát triển (HSNC và TLCHH) đồng gần như nhau ở cùng một môi trường cơ bản hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nên đề tài phân tích ảnh hưởng của môi trường hoặc nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến 5 dòng. Để tiến hành phân tích phương sai, trước hết cần kiểm tra các mẫu có nằm trong một tổng thể hay không nói cách khác phương sai tổng thể bằng nhau là điều kiện cần và đủ để tiến hành phân tích phương sai một nhân tố. Khi giá trị Sig trong bảng Test of Homogeneity of Variances >0,05 điều này có nghĩa phương sai tổng thể bằng nhau và ngược lại. Nếu phương sai tổng thể không bằng nhau, chúng tôi sẽ tiến hành kiểm tra sự sai khác về tỷ lệ sống của cành ghép qua tiêu chuẩn LSD. Các công thức có sự sai khác được đánh dấu (*), còn lại là không sai khác. 14
- Phân tích phương sai một nhân tố (Anova) Giả thuyết Ho: Không có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh đồng đều ở các nhân tố kiểm tra) Giả thuyết H1: Có sự sai khác giữa các chỉ tiêu so sánh (chỉ tiêu so sánh có sự khác nhau rõ rệt về mặt thống kê) + Trong bảng ANOVA, Nếu giá trị Sig của F thu được >0,05 thì chấp nhận H0 (Không có sự sai khác) + Trong bảng ANOVA, nếu giá trị Sig của F