Báo cáo nghiên cứu khoa học: "Nhân nhanh In vitro lan kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) – một loài Lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng."

Chia sẻ: Nguyễn Phương Hà Linh Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

143
lượt xem 47
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kim điệp hay kim điệp thân phình, hoàng thảo kim điệp, thạch hộc dùi trống, cổ chùy thạch hộc (danh pháp hai phần: Dendrobium chrysotoxum) là một loài lan trong chi Lan hoàng thảo.Kim điệp quăn hay long nhãn, mã tiên thạch hộc (danh pháp hai phần: Dendrobium fimbriatum) là một loài lan trong chi Lan hoàng thảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo nghiên cứu khoa học: "Nhân nhanh In vitro lan kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) – một loài Lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng."

T P CHÍ KHOA H C, ð i h c Hu , S 64, 2011 NHÂN NHANH IN VITRO LAN KIM ðI P (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM) – M T LOÀI LAN R NG CÓ NGUY CƠ TUY T CH NG TUY Nguy n Văn Song Vi n Tài nguyên, Môi trư ng và Công ngh sinh h c, ð i h c Hu Phan Hùng Vĩnh, S Nông nghi p và Phát tri n nông thôn Qu ng Nam Trương Th Bích Phư ng, Trư ng ð i h c Khoa h c, ð i h c Hu TÓM T T Chúng tôi ñã ti n hành nghiên c u nhân gi ng in vitro lan Kim ñi p. Nguyên li u s d ng là h t c a qu lan 3 tháng tu i. Môi trư ng thích h p cho n y m m và phát sinh protocorm c a h t là MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nư c d a và 2,0 mg/l BAP. Môi trư ng nhân nhanh protocorm t t nh t là MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nư c d a và 2,0 mg/l BAP. Môi trư ng MS cơ b n có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than ho t tính, 15% nư c d a, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích h p nh t cho tái sinh ch i t protocorm và sinh trư ng c a ch i in vitro. Môi trư ng MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nư c d a và 1,0 mg/l NAA là thích h p cho t o r c a ch i in vitro. T khóa: Dendrobium chrysotoxum, h t lan, lan quý hi m, nhân nhanh, protocorm. 1. M ñ u Lan Kim ñi p (Dendrobium chrysotoxum) là loài lan r ng Vi t Nam phân b ch y u vùng Tây Nguyên, có hoa l n màu vàng tươi. Cánh môi có ñ m vàng cam ñ m gi a, mép có lông m n. Hoa n vào d p t t t tháng 1 ñ n tháng 2 [2]. Loài lan này ñang ñ ng trư c nguy cơ s b tuy t ch ng ngoài thiên nhiên trong m t tương lai g n [1]. ð i v i nhi u loài lan hi m, b ñe d a hay nguy c p trong t nhiên thư ng ñư c b o t n nh phương th c n y m m b ng h t [13]. Các loài lan s ng bi u sinh thư ng ñư c nhân gi ng t h t, s d ng vi c nuôi c y không c ng sinh [5]. H t lan phát tri n r t kém ngay c khi ñã chín, chúng ph thu c vào s nhi m n m ñ n y m m và phát tri n trong t nhiên. Phương pháp nuôi c y không c ng sinh ñư c phát tri n sau nghiên c u c a Knudson (1922) [8], h t lan có th n y m m trên môi trư ng mu i khoáng ñơn gi n có ch a ñư ng. Phương pháp này ñã tr thành k thu t chu n cho n y m m h t lan [9]. Ecuador, phương th c n y m m h t lan in vitro cũng là m t ph n quan tr ng c a chương trình b o t n và nhân gi ng các loài lan hi m, cung c p cây con cho chương trình ph c h i r ng tái sinh [15]. V i công ngh nhân gi ng in vitro hi n nay h s nhân gi ng t m t qu lan là r t l n, t vài ngàn ñ n m t tri u cây con [4]. 127
Trong th i gian qua, ñã có m t s tác gi trong và ngoài nư c nghiên c u nhân gi ng b ng h t các loài lan khác nhau. Luan và ñ ng tác gi (2006), ñã nuôi c y h t m t s loài Dendrobium sp. Dactylorhiza fuchsia. M t loài lan có trong sách ñ c a vùng Baltic cũng ñư c nuôi c y thành công t h t c a qu còn xanh [11], Geodorum densiflorum ñã ñư c nhân gi ng in vitro [7], Calanthe sieboldii cũng ñư c cho n y m m t qu 80 ngày tu i [17], Cypripedium macranthos ñư c nhân gi ng b ng h t [19], Epidendrum ibaguense ñư c cho n y m m không c ng sinh [10]. Kim ñi p là m t loài lan ñ p, thu c nhóm nguy c p, tuy nhiên ñ n nay theo tài li u chúng tôi có ñư c thì ch có Roy và cs (2007) nghiên c u s hình thành protocorm thông qua t o callus t ñ nh ch i. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày k t qu nghiên c u nhân nhanh lan Kim ñi p b ng nuôi c y h t nh m m c ñích b o t n loài lan có nguy cơ tuy t ch ng này ñ ng th i t o ngu n nguyên li u ban ñ u cho s n xu t hoa lan. 2. Nguyên li u và phương pháp nghiên c u 2.1. Nguyên li u Nguyên li u nghiên c u là qu lan Kim ñi p (Dendrobium chrysotoxum) 3 tháng tu i thu hái t cây ngoài t nhiên. 2 2. Phương pháp nghiên c u 2.2.1. Kh trùng m u Qu lan ñư c ngâm trong nư c xà phòng loãng và r a k dư i dòng nư c ch y, sau ñó kh trùng sơ b b ng c n 70% trong 2 phút, ti p ñ n kh trùng b m t v qu b ng HgCl2 0,1% trong 10 phút. Cu i cùng, qu ñư c r a l i 5 l n b ng nư c c t vô trùng. 2.2.2. N y m m và phát sinh protocorm H t lan thu t qu ñã kh trùng ñư c c y lên môi trư ng MS cơ b n (Murashige and Skoog, 1962) có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, b sung 15% nư c d a (CW), 0,5-2,5 mg/l benzylamino purine (BAP), và 0,2-1,5 mg/l napththaleneacetic acid (NAA) ñ thăm dò kh năng n y m m và phát sinh protocorm. 2.2.3. Nhân nhanh protocorm Các protocorm sau khi hình thành s ñư c c y chuy n lên môi trư ng MS cơ b n có 8 g/l agar, 20 g/l sucrose, b sung 15% CW, b sung BAP, kinetin, NAA riêng r ho c ph i h p các n ng ñ khác nhau ñ thăm dò kh năng n y m m và nhân protocorm. 2.2.4. Phát tri n ch i t protocorm Các protocorm sau khi nhân nhanh ñư c c y lên môi trư ng MS cơ b n có 8 g/l agar, 30 g/l sucrose, 1 g/l than ho t tính b sung 15% CW và các ch t kích thích sinh trư ng (BAP, NAA và kinetin) riêng r ho c ph i h p các n ng ñ khác nhau ñ thăm dò kh năng phát tri n ch i. 128
2.2.5. T o r t ch i in vitro Các ch i thu ñư c t các thí nghi m trên ñư c tách riêng r và c y lên môi trư ng cơ b n MS có 8 g/l agar; 30 g/l sacharose b sung NAA t 0,1 - 1,5 mg/l ho c 1,0 mg/l NAA ph i h p v i kinetin (0,3 - 1,5 mg/l) ñ thăm dò kh năng hình thành và phát tri n c a r t ch i in vitro sau 6 tu n nuôi c y. Các thí nghi m nuôi c y in vitro ñư c duy trì nhi t ñ 25 ± 2oC, cư ng ñ chi u sáng 2000-3000 lux, th i gian chi u sáng 10 gi /ngày. 2.2.6. Chuy n cây con tr ng ngoài ñi u ki n t nhiên Các cây con tái sinh hoàn ch nh (cao 3,0 - 4,5 cm, có 2 - 5 r ) ñư c hu n luy n thích nghi v i ñi u ki n bên ngoài. Sau ñó cây con ñư c tr ng trên giá th rêu nư c và dương x (t l 1:2) ch ñ che sáng 50 % và tư i phun sương. Xác ñ nh t l s ng sót c a cây con sau 4 tu n chăm sóc. 2.3. X lý th ng kê M i thí nghi m ñư c l p l i 3 l n (n ≥ 30) ñ tính trung bình m u và phân tích Duncan (p < 0,05) b ng chương trình SAS. 3. K t qu và th o lu n 3.1. S n y m m và phát sinh protocorm B ng 1. nh hư ng c a BAP và NAA ñ n kh năng n y m m và hình thành protocorm c a h t N ng ñ ch t kích thích sinh trư ng Kh năng n y m m và phát sinh (mg/l) protocorm - + 0,5 ++ 1,0 +++ BAP 1,5 +++ 2,0 ++++ 2,5 ++ 0,2 +++ 0,5 ++ NAA 1,0 ++ 1,5 ++ Chú thích: - : Không b sung ch t kích thích sinh trư ng; ++++ : t t ; +++ : khá ++ : trung bình; +: kém 129
Các h t lan ban ñ u có màu vàng chanh ñư c nuôi c y in vitro sau 2 tu n ñã chuy n sang màu nâu vàng, r i b t ñ u trương lên. Sau 3-4 tu n h t ti p t c trương to và có hình c u màu xanh nh t do l c hóa. K t qu sau 6 tu n nuôi c y ñư c trình bày b ng 1. S li u b ng 1 cho th y, BAP và NAA có tác d ng rõ r t ñ i v i s n y m m ñ ng th i phát sinh protocorm c a h t so v i ñ i ch ng (không b sung ch t kích thích sinh trư ng). Môi trư ng có BAP (1,0 - 1,5 mg/l) có tác d ng tương ñương v i môi trư ng có b sung 0,2 mg/l NAA. Môi trư ng có 2,0 mg/l BAP kích thích s n y m m và phát sinh protocorm t t nh t. K t qu nghiên c u trên lan Nghinh xuân (Rhynchostylis gigantea) cũng tương t , n ng ñ NAA thích h p là 0,1 mg/l [3]. Tuy nhiên, m t s loài Dendrobium sp. thì c n NAA n ng ñ cao hơn lên ñ n 0,5 mg/l NAA [14]. 3.2. Nhân nhanh protocorm H t lan n y m m có th s n xu t ra m t kh i t bào chưa phân hóa rõ ràng ñư c g i là protocorm. T t c nh ng protocorm này s ti p t c phát tri n trong nhi u tu n, nhi u tháng hay th m chí nhi u năm ph thu c t ng loài cho ñ n khi ñ l n ñ t o lá và r [15]. B ng 2. nh hư ng c a BAP, kinetin riêng r ho c k t h p v i NAA lên kh năng nhân nhanh protocorm sau 6 tu n nuôi c y Ch t kích thích sinh trư ng (mg/l) S Protocorm trung bình/m u Kinetin BAP NAA 1,80c - ðC - 2,50b - 0,5 - 2,75b - 1,0 - 4,25a - 1,5 - 4,33a - 2,0 - 3,67ab - 2,5 - LSD0,05 1,26 1,80d - - - 2,75c 0,5 - - 3,88a 1,0 - - 3,86a 1,5 - - 3,26b 2,0 - - 2,78c 2,5 - - 130
LSD0,05 0,08 1,80c - - - 2,40bc - 0,5 1,0 3,62a - 1,0 1,0 3,66a - 1,5 1,0 2,75b - 2,0 1,0 1,83c - 2,5 1,0 LSD0,05 0,74 - - - - 2,75b 0,5 - 0,5 3,60a 1,0 - 0,5 3,12ab 1,5 - 0,5 2,15c 2,0 - 0,5 1,88c 2,5 - 0,5 LSD0,05 0,57 Chú thích: Các ch cái khác nhau ch s sai khác có ý nghĩa th ng kê c a trung bình m u v i p
là 2,8 ch i/protocorm và s phát tri n chi u cao ch i l n nh t (4,03 cm) môi trư ng có 1,0 mg/l NAA. Kinetin có tác d ng tích c c ñ n s phát tri n ch i t m u c y, s ch i hình thành cao hơn so v i môi trư ng có NAA, tuy nhiên, s phát tri n chi u cao ch i l i kém hơn. Trên môi trư ng có 1,0 mg/l kinetin s ch i hình thành cao nh t là 3,16 ch i/protocorm, môi trư ng có 1,5 mg/l kinetin kích thích s phát tri n chi u cao ch i Kim ñi p tương ñ i t t (3,68 cm). S ph i h p gi a BAP và NAA có tác ñ ng khá t t ñ n s hình thành ch i t protocorm, s ch i thu ñư c cao nh t môi trư ng có 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, chi u cao ch i l n nh t môi trư ng có 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA. T k t qu này cũng cho th y, v i t l Cytokinin/Auxin (BAP/NAA) = 2 là thích h p nh t cho quá trình t o ch i t protocorm c a lan Kim ñi p. Các t l khác cho hi u qu th p, ñi u này cũng có th do hàm lư ng auxin n i sinh c a mô ñã nh hư ng ñ n kh năng t o ch i c a protocorm. 3.4. S hình thành r c a ch i in vitro Ch i c a loài Kim ñi p thu ñư c t các thí nghi m trên ñư c tách riêng r và c y lên môi trư ng t o r ñ kh o sát kh năng hình thành r . K t qu thí nghi m sau 6 tu n theo dõi ñư c trình bày b ng 4. K t qu b ng 4 cho th y, s hình thành r c a ch i in vitro t t nh t trên môi trư ng có 1,0 mg/l NAA (5,93 r /ch i). Chi u dài r tương ñương nhau trên các môi trư ng có 0,1; 0,3; 0,5 mg/l NAA. Ch i Kim ñi p hình thành r kém trên môi trư ng có s k t h p gi a kinetin và NAA. B ng 3. nh hư ng c a BAP, kinetin và NAA lên kh năng phát sinh ch i t protocorm S Ch t kích thích sinh trư ng (mg/l) Chi u cao ch i (cm) ch i/protocorm Kinetin BAP NAA 1,26c 2,23d - - - 1,43c 2,06d - - 0,1 1,50c 2,46d - - 0,3 2,30ab 3,00c - - 0,5 2,80a 3,70b - - 0,7 2,16b 4,03b - - 1,0 1,81bc 4,53a - - 1,5 LSD0,05 0,58 0,40 e 2,23e - - - 1,26 1,56e 2,57d - 2,0 0,1 2,09d 2,95c - 2,0 0,3 2,27cd 3,48a - 2,0 0,5 132
2,65bc 3,25b - 2,0 0,7 3,18a 3,28b - 2,0 1,0 2,77ab 2,85c - 2,0 1,5 LSD0,05 0,47 0,12 c 2,23c - - - 1,26 1,50bc 3,13b 0,5 - - 3,16a 3,20b 1,0 - - 2,03b 3,68a 1,5 - - 1,83bc 3,00b 2,0 - - 1,70bc 2,88b 2,5 - - LSD0,05 0,57 0,33 3.5. Chuy n cây con tr ng ngoài ñi u ki n t nhiên Các bình cây con Kim ñi p tái sinh hoàn ch nh (cao 3,0 - 4,5 cm, có 2 - 5 r ) ñư c chuy n t phòng nuôi c y ra ngoài ñi u ki n t nhiên, có ánh sáng ñ y ñ , nhi t ñ phòng trong kho ng 10 ngày ñ cây thích nghi d n. Sau ñó, chuy n cây con ra kh i bình nuôi c y, r a s ch môi trư ng, c t ng n r và nhúng vào dung d ch sát khu n (VIBEN-C 50BTN 0,25 - 0,3 %) trong th i gian 1 phút. Cây con ñư c tr ng trên giá th rêu nư c và dương x (t l 1:2) ch ñ che sáng 50 % và tư i nư c phun sương. Sau 2 tu n, cây con b t ñ u hình thành r m i và hình thành lá m i sau 3 tu n chuy n ra vư n ươm. K t qu sau 1 tháng theo dõi, t l s ng sót ñ t 90,9 %. B ng 4. nh hư ng c a ch t KTST lên kh năng t o r c a ch i lan Kim ñi p in vitro Ch t KTST (mg/l) S r /ch i Chi u dài r (cm) NAA Kinetin 2,94e 1,44c - - 4,54d 2,24a 0,1 - 5,06c 2,23a 0,3 - 5,32b 2,24a 0,5 - 5,93a 1,83b 1,0 - 2,06g 0,79e 1,0 0,3 2,17fg 0,80e 1,0 0,5 2,13fg 1,06d 1,0 1,0 2,18f 0,99d 1,0 1,5 LSD0,05 0,1 0,09 133
4. K t lu n Qua quá trình nghiên c u chúng tôi sơ b rút ra m t s k t lu n sau: - Môi trư ng t t nh t cho s n y m m ñ ng th i phát sinh protocorm c a h t là MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, b sung 15% nư c d a và 2,0 mg/l BAP. - Môi trư ng nhân nhanh protocorm t t nh t (4,33 protocorm/m u) là MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, b sung 15% nư c d a và 2,0 mg/l BAP. - Môi trư ng MS cơ b n có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than ho t tính, b sung 15% nư c d a và k t h p 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA ho c 1 mg/l Kinetin là thích h p nh t cho s phát sinh ch i t protocorm và s sinh trư ng c a ch i in vitro. - Môi trư ng thích h p cho t o r là MS cơ b n có 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, b sung 15% nư c d a và 1,0 mg/l NAA. A B C D E Hình 1. A: H t lan n y m m sau 6 tu n trên môi trư ng có 2,0 mg/l BAP. B: Protocorm sau 6 tu n nuôi c y trên môi trư ng có 2,0 mg/l BAP. C: Ch i phát sinh t protocorm trên môi trư ng có 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA sau 12 tu n nuôi c y. D: Ch i in vitro t o r sau 6 tu n trên môi trư ng có 1,0 mg/l NAA. E: Cây con tr ng trên giá th ngoài t nhiên. 134
TÀI LI U THAM KH O [1]. Nguy n Ti n Bân và các tác gi , Sách ñ Vi t Nam – Ph n II – Th c v t, Nxb Khoa h c T nhiên và Công ngh , Hà N i, 2007. [2]. Tr n H p, Phong lan Vi t Nam, Nxb Nông Nghi p, Tp HCM, 1998. [3]. Nguy n Hoàng L c, Mai Văn Phô, ði u tra sơ b thành ph n loài h lan Th a Thiên Hu và bư c ñ u b o t n in vitro m t s loài phân b ñây, T p chí Sinh h c 22(3b), (2000), 173-178. [4]. Tr n Văn Minh, Nguy n Văn Uy n, Cây Phong lan Dendrobium sp, Trư ng ð i h c Nông Lâm Tp HCM, 2001. [5]. Alvarez-Pardo VM, Ferreira AG, Nunes VF, Seed disinfestation methods for in vitro cultivation of epiphyte orchids from Southern Brazil, Horticultura Brasileira 24, (2006), 217-220. [6]. Anjum S, Zia M. and Chaudhary MF, Investigations of different strategies for high frequency regeneration of Dendrobium malones ‘Victory’, African Journal of Biotechnology, 5(19), (2006), 1738-1743. [7]. Bhadra SK, Hossain MM, In vitro germination and micropropagation of Geodorum densiflorum (Lam.) Schtr., an endangered orchid species, Plant Tissue Cult. 13(2), (2003), 165-171. [8]. George EF, Hall MA and Jan de Klerk G., Plant propagation by tissue culture, 3rd Edition, Vol 1. The background. Spinger, the Netherlands, 2008. [9]. Goh CJ, Ammirato PV, Evans DR, Sharp WR, Bajaj YPS, Orchids, Monopodials. In: Handbook of Plant Cell Culture, McGraw-Hill, New York. Vol. 5,(1990), 598-633. [10]. Hossain MM, Asymbiotic seed germination and in vitro seedling development of Epidendrum ibaguense Kunth. (Orchidaceae), African Journal of Biotechnology 7(20), (2008), 3614-3619. [11]. Jakobsone G., Morphogenesis of wild orchid Dactylorhiza fuchsii in tissue culture, Acta Universitatis Latviensis, Biology 745, (2008), 17–23. [12]. Kalimuthu K, Senthilkumar R and Vijayakumar S., In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp. (Dancing Dolls), African Journal of Biotechnology 6 (10), (2006), 1171-1174. [13]. Kauth P., In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila lanceolata var. lanceolata: Two Florida native terrestrial orchids, Master thesis, University of Florida, 2005. 135
[14]. Luan VQ, Thien NQ, Khiem DV and Nhut DT., In vitro germination capacity and plant recover of some native and rare orchids, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, (2006), 175-177. [15]. McKendrick S., In vitro germination of orchids: a manual, Ceiba Foundation for Tropical Conservation, (2000), 1-17. [16]. Murashige T, Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant 15, (1962), 473-497. [17]. Park SY, Murthy HN and Paek KY., In-vitro seed germination of calanthe sieboldii, an endangered orchid species, Joumal of Plant Biology 43(3), (2000), 158-161. [18]. Roy J, Naha S, Majumdar M, Banerjee N., Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl, Plant Cell Tiss Organ Cult, 90, (2007), 31-39. [19]. Taniguchi H, Katsumi M, Yamamoto Y, Tatsumi Y, Sano CM, Choi YE and Sano H., In vitro proliferation and genetic diversity of Cypripedium macranthos var. rebunense, Plant Biotechnology, 25, (2008), 341-346. IN VITRO PROPAGATION OF DENDROBIUM CHRYSOTOXUM - AN ENDANGERED ORCHID SPECIES Nguyen Van Song Institute of Resources, Environment and Biotechnology, Hue University Phan Hung Vinh Quang Nam Department of Agricultural and Rural Development Truong Thi Bich Phuong College of Sciences, Hue University SUMMARY We have carried out in vitro propagation of Dendrobium chrysotoxum. In this report, the 3-month old seeds were used for propagation. The suitable medium for seed germination accompanied with protocorm induction is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP and for protocorm propagation is basal MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 2,0 mg/l BAP. The basal MS medium + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l activated charcoal + 15% CW and 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA was the most suitable for multi-shoot micropropagation from protocorm and the growing of in vitro shoots. The suitable medium for rooting is MS with 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, suplemented with 15% CW and 1,0 mg/l NAA. Key words: Dendrobium chrysotoxum, immature seeds, endangered orchid, micropropagation, protocorm. 136