Báo cáo nghiên cứu phân lập vi khuẩn xử lý nitrogen

Chia sẻ: Lý Mân Hạo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết nghiên cứu đã phân lập được bốn chủng gồm hai chủng xử lý ammonia và hai chủng xử lý nitrite từ 9 nguồn mẫu được thu ở Viện Nuôi trồng Thủy sản 2, huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh và huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo nghiên cứu phân lập vi khuẩn xử lý nitrogen

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI KHUẨN XỬ LÝ NITROGEN Nguyễn Phương Thanh Trúc, Nguyễn Thị Bội Tuy n Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: ThS. Phạm Minh Nhựt TÓM TẮT Trong quá trình nghiên cứu đã phân lập được bốn chủng gồm hai chủng xử lý ammonia và hai chủng xử lý nitrite từ 9 nguồn mẫu được thu ở Viện Nuôi trồng Thủy sản 2, huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh và huyện Thạnh Hóa, tỉnh Long An. Cả bốn chủng đều thuộc nhóm vi khuẩn gram âm và có khả năng xử lý làm giảm được lượng ammonia và nitrite trong môi trường W1 và W2. Các chủng này cần được nghiên cứu sâu hơn và khảo sát về các yếu tố ảnh hưởng. Từ khóa: Ammonia, ao nuôi tôm, định tính, hạt nổi, nitrite. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm thẻ chân trắng là loài tôm được nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Tại Việt Nam nuôi tôm thẻ chân trắng phổ biến theo hình thức nuôi bán thâm canh và thâm canh với năng suất dao động phổ biến cho hình thức nuôi bán thâm canh 4 - 6 tấn/ha/vụ và cho hình thức nuôi thâm canh 8 - 15 tấn/ha/vụ. Quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng được quản lý theo quy trình nuôi bằng hóa chất cho diệt khuẩn, quản lý tảo ao nuôi, bằng chế phẩm sinh học cho cải thiện chất lượng đáy và nước ao nuôi, quản lý bệnh bằng sử dụng các loại kháng sinh và hóa chất. Vấn đề cố hữu của các hệ thống ao nuôi tôm là sự tích tụ các chất thải hữu cơ (phần lớn là từ thức ăn thừa và chất thải của tôm nuôi), cùng với các hợp chất nitơ vô cơ có độc tính cao đối với thủy sinh vật (đặc biệt là ammonium và nitrite). Nitrogen là một phần quan trọng cấu thành các phân tử như protein, nucleic acid, adenosine phosphate, pyridine nucleotide, và các sắc tố (Hagopian và Riley, 1998). Nitrogen trong ao tồn tại ở các dạng khác nhau bao gồm nitrate, nitrite, ammonia và các dạng nitrogen hữu cơ khác. Nitrogen được thải ra từ chất bài tiết của tôm, phân hủy từ tôm chết, tảo chết, và thức ăn dư thừa. Các dạng hợp chất nitrogen tích tụ trong bùn và trong nước giống nhau. Trong ao nuôi tôm, ammonia ở dạng NH3 (un-ionized ammonia) là hợp chất gây độc cho động vật thủy sản ở nồng độ nhất định. Ion ammonium (NH4+) là dạng khác của ammonia nitrogen không gây độc cho động vật thuỷ sản ở nồng độ thấp nhưng có thể gây hại khi ở nồng độ cực cao. N – NH3 là sản phẩm thải từ quá trình biến dưỡng của động vật thuỷ sản và sự phân hủy các chất hữu cơ bởi vi khuẩn. Tùy theo pH và nhiệt độ mà tỷ lệ ammonia tổng số và NH3 khác nhau (Kungvankij et al.,1986). Sự hiện diện của NH3 trong ao nuôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó đáng kể nhất là độ mặn, nhiệt độ và pH, ôxy hòa tan, nitrate, và lượng thức ăn dư thừa trong ao, tảo. Khi pH cao thì ammonium chuyển hóa thành ammonia gây độc cho tôm và ngược lại. 332
Để giải quyết vấn đề về nitrogen trong nguồn nước ao nuôi thì việc sử dụng các chế phẩm sinh học được coi là một giải pháp hỗ trợ mang tính tất yếu để ngành nuôi tôm công nghiệp tại nhiều nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ổn định và phát triển bền vững. Việc lạm dụng hóa chất, kháng sinh trong nuôi tôm thâm canh hiện nay đã phá vỡ cân bằng sinh thái và tác động xấu đến môi trường, chất lượng sản phẩm kém và tồn lưu các hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng đang tạo nên rào cản trong việc xuất khẩu tôm Việt Nam ra thị trường thế giới. Chính vì thế, việc tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hoạt tính xử lý nitrogen đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản nhằm góp phần ổn định chất lượng nước ao nuôi giúp cho động vật nuôi phát triển mạnh và bền vững. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguồn mẫu 9 mẫu được sử dụng để phân lập nhóm vi khuẩn xử lý nitrogen bao gồm 2 mẫu nước ao nuôi tôm và 2 mẫu bùn thu tại Huyện Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh; 1 mẫu hạt nổi trong hệ thống tuần hoàn thu tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2; 4 mẫu nước ao nuôi cá trê bột thu tại huyện Thạnh Hoá, tỉnh Long An. 2.2 Phân lập vi khuẩn xử lý nitrogen Các mẫu sau khi thu về được tăng sinh chọn lọc trong môi trường W1 và W2 trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 – 7 ngày. Sau thời gian tăng sinh chọn lọc, tiến hành định tính lượng ammonia và nitrite trong môi trường W1 và W2. Những mẫu có hiện tượng giảm nồng độ của ammonia và nitrite được tiến hành pha loãng và cấy trang trên môi trường W1 và W2 agar ở các nồng độ pha loãng thích hợp. Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 – 7 ngày và tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trên môi trường dựa vào các đặc điểm về hình thái, màu sắc, rìa và hình chiếu. Các khuẩn lạc được chọn lọc được cấy làm thuần trên môi trường W1 và W2 agar và giữ giống trong glycerol 20% để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo. 2.3 Khảo sát hình thái Các chủng vi khuẩn sau phân lập được tiến hành nhuộm gram để xác định nhóm vi khuẩn vi khuẩn mong muốn. 2.4 Sàng lọc hoạt tính xử lý nitrogen của các chủng phân lập Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong môi trường BHIA có bổ sung NaCl 1,5%. Sau đó đo OD600nm và pha loãng về mật độ 108 cfu/ml rồi cấy vào môi trường khảo sát chứa N-NH3 (W1) và N-NO2 (W2) với nồng độ 5 mg/l và tiến hành khảo sát khả năng xử lý ammonia và nitrite theo thời gian khảo sát từ 0 giờ đến 120 giờ. Tại mỗi thời điểm khảo sát, tiến hành định tính lượng ammonia bằng thuốc thử Nessler và nitrite bằng hỗn hợp thuốc thử Griess A và Griess B. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 333
2.5 Phương pháp test sera Cách sử dụng Test NH3 Sera: 1. Làm sạch trong và ngoài lọ thủy tinh bằng nước máy trước và sau mỗi lần kiểm tra. Lắc đều các chai thuốc thử trước khi sử dụng. 2. Rửa lọ thủy tinh nhiều lần bằng mẫu nước cần kiểm tra, sau đó đổ đầy 5 ml mẫu nước vào lọ. Lau khô bên ngoài lọ. 3. Cho 6 giọt thuốc thử của chai thuốc thử 1 vào lọ thủy tinh chứa mẫu nước cần kiểm tra, đóng nắp và lắc đều. 4. Mở nắp, cho 6 giọt thuốc thử của chai thuốc thử 2 vào lọ, đóng nắp và lắc đều rồi mở nắp ra. 5. Cho tiếp 6 giọt thuốc thử của chai thuốc thử 3 vào lọ, đóng nắp lọ lắc đều. Chú ý: Nếu mẫu thử là nước ngọt thì chỉ dùng 3 giọt ở mỗi chai thuốc thử 1, 2 và 3. Sau 5 phút, đối chiếu màu của dung dịch với bảng màu. Đối chiếu giá trị NH4+ với giá trị pH để kiểm tra độc tố NH3 có trong nước ao. Cách sử dụng Test NO2 Sera: 1. Làm sạch trong và ngoài lọ thủy tinh bằng nước máy, trước và sau mỗi lần kiểm tra. Lắc đều chai thuốc thử trước khi sử dụng. 2. Rửa lọ thủy tinh nhiều lần bằng mẫu nước cần kiểm tra, sau đó đổ 5 ml mẫu nước vào lọ. Lau khô bên ngoài lọ. 3. Nhỏ 5 giọt thuốc thử số 1 và 5 giọt thuốc thử 2 vào lọ chứa mẫu nước cần kiểm tra. 4. Đóng nắp lọ và lắc nghẹ. Mở nắp ra. 5. Chờ 3 – 5 phút, sau đó đem đối chiếu với bảng so màu. Lưu ý, nên thực hiện việc so màu dưới ánh sáng tự nhiên. Ngh a là, tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào. 2.6 Trình bày kết quả Thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn quang dưỡng có khả năng xử lý nitrogen từ 9 mẫu được trình bày ở Bảng 1. Kết quả phân lập chỉ thu được hai chủng xử lý ammonia và hai chủng xử lý nitrite. 334
Bảng 1: Các chủng vi khuẩn tự dưỡng phân lập từ các nguồn mẫu Nguồn Hình dạng khuẩn Hình dạng tế Hình ảnh Chủng vi khuẩn mẫu lạc bào Tròn, lồi, rìa đều, Hình que, đầu Hạt nổi HnAOB1 màu vàng nhạt, tròn, gram âm đường kính < 1 mm Tròn, lồi, rìa đều, Hình que, đầu HnAOB2 màu trắng trong, tròn, gram âm đường kính < 1 mm Tròn, lồi, rìa đều, Mẫu bùn Hình que, ngắn, BC1NOB1 màu trắng trong, CG1 gram âm đường kính < 1 mm Tròn, lồi, rìa đều, Mẫu bùn Hình que, gram BC2NOB1 màu trắng đục, CG2 âm đường kính > 1 mm Kết quả phân lập cho thấy rằng, tuy số mẫu được sử dụng khá nhiều trong quá trình phân lập (9 mẫu) nhưng chỉ thu được bốn chủng vi khuẩn xử lý nitrogen (hai chủng xử lý ammonia và hai chủng xử lý nitrite). Hai chủng xử lý ammonia phân lập từ mẫu hạt nổi thu từ hệ thống bể nuôi tôm tuần hoàn của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản 2. Trong hệ thống nuôi tuần hoàn này, nước từ các bể nuôi được ơm qua bể lắng, sau đó qua bể chứa hạt nổi và sau đó đưa lại vào trong bể nuôi. Do đó, việc xuất hiện các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen trong hạt nổi là điều dễ hiểu. Hai chủng còn lại thuộc hai chủng xử lý nitrite được phân lập từ 2 mẫu bùn thu tại ao nuôi tôm ở Cần Giờ. Trong khi đó, hai mẫu nước ao nuôi tôm tại Cần Giờ và 4 mẫu nước ao nuôi cá trê tại Long An không phân lập được vi khuẩn xử lý nitrogen trong môi trường W1 và W2. Điều này có thể do các ao này việc quản lý nguồn nitrogen khá tốt nên việc hàm lượng nitrogen trong nguồn nước không cao dẫn đến khả năng xuất hiện các vi khuẩn xử lý nitrogen cũng rất hạn chế, từ đó dẫn đến kết quả không phân lập được các chủng vi khuẩn xử lý nitrogen từ các nguồn mẫu này. 3.2 Kết quả định tính khả năng loại bỏ ammonia và nitrite của các chủng vi khuẩn phân lập được Vi khuẩn xử lý ammonia được cấy vào môi trường W1 có sự hiện diện của (NH4)2SO4 với liều lượng 0,235 g/l, trong khi đó vi khuẩn xử lý nitrite được cấy vào môi trường W2 có sự hiện diện của NaNO2 với liều lượng 0,246 g/l, và tiến hành định tính sự hiện diện của hai thành phần này theo thời gian. Kết quả thu được được trình bày ở Bảng 2. 335
Bảng 2: Kết quả định tính loại bỏ ammonia và nitrite theo thời gian của các chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Thuốc thử Hiện tượng Thời gian HnAOB1 Nessler Vàng nhạt Sau 48 giờ HnAOB2 Nessler Vàng rất nhạt Sau 48 giờ BC1NOB1 Griess A và Griess B Trắng Sau 48 giờ BC2NOB1 Griess A và Griess B Hồng nhạt Sau 48 giờ Kết quả này cho thấy rằng, bốn chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng xử lý ammonia và nitrite. Trong môi trường có chứa ammonia, nếu nồng độ càng cao thì phản ứng với thuốc thử Nessler sẽ càng mạnh tạo ra màu vàng sậm đến nâu. Tuy nhiên khi khảo sát hai chủng HnAOB1 và HnAOB2 thì sau 48 giờ khảo sát thì màu vàng hình thành rất nhạt, điều này có ngh a là hàm lượng ammonia trong môi trường còn rất ít so với ban đầu. Kết quả này cho thấy, hai chủng HnAOB1 và HnAOB2 có khả hiệu quả xử lý ammonia. Tương tự như vậy đối với hai chủng BC1NOB1 và BC2NOB2 khi cấy vào môi trường W2. Khi sử dụng thuốc thử Griess A và Griess B để định tính sự hiện diện của nitrite trong môi trường thì hàm lượng nitrite càng cao thì màu càng hồng đậm. Sau thời gian 48 giờ nuôi cấy BC1NOB1 và BC2NOB2 trong môi trường W2 thì trong môi trường nuôi cấy BC1NOB1 sau khi nhỏ thuốc thử không hình thành màu hồng còn môi trường nuôi cấy BC2NOB2 chỉ tạo màu hồng rất nhạt. Điều này chứng tỏ hai chủng này có hiệu quả loại bỏ nitrite khá tốt. Vi khuẩn xử lý ammonia được cấy vào môi trường W1 có sự hiện diện của (NH4)2SO4 với liều lượng 0,235 g/l, trong khi đó vi khuẩn xử lý nitrite được cấy vào môi trường W2 có sự hiện diện của NaNO2 với liều lượng 0,246 g/l và tiến hành test bằng bộ test Sera theo thời gian. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3: Kết quả định lượng loại bỏ ammonia và nitrite theo thời gian của các chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Thuốc thử Kết quả Thời gian HnAOB1 Test NH3/NH4 Sera Xanh lá nhạt 48 giờ HnAOB2 Test NH3/NH4 Sera Xanh lá nhạt 48 giờ BC1NOB1 Test NO2 Sera Vàng nhạt 24 giờ BC2NOB1 Test NO2 Sera Vàng nhạt 24 giờ Kết quả dựa theo màu sắc của bộ Test Sera: Bảng 4: Bảng so màu mức độ ảnh hưởng của nồng độ NH3/NH4 Nồng độ NH3/NH4(mg/l) Mức độ ảnh hưởng Hiện tượng 0.0 An toàn Màu vàng nhạt 0.5 An toàn Màu vàng xanh 1.0 Nguy hiểm Màu xanh lá 1.5 Nguy hiểm Màu xanh lơ 5.0 Nguy hiểm Màu xanh dương 10.0 Rất nguy hiểm Màu xanh dương 336
Bảng 5: Bảng so màu mức độ ảnh hưởng của nồng độ NO2 Nồng độ NO2(mg/l) Mức độ ảnh hưởng Hiện tượng 0.0 Tốt Màu vàng nhạt 0.5 Chấp nhận được Màu vàng cam 1.0 Có hại Màu cam 1.5 Nguy hiểm Màu đỏ cam 5.0 Ngộ độc Màu đỏ Sau khi thực hiện test với bộ kit Sera thì kết quả thu được là hai chủng HnAOB1 và HnAOB2 cho ra màu vàng xanh nên mức độ ảnh hưởng là an toàn với nồng độ NH4/NH3 là 0.5 mg/l điều này có ngh a là, hai chủng AOB có khả năng làm giảm lượng ammonia trong môi trường. Sau khi thực hiện test với bộ kit Sera thì kết quả thu được là hai chủng BC1NOB1 và BC2NOB2 cho ra màu vàng nên mức độ ảnh hưởng là an toàn với nồng độ NH4/NH3 là 0.0 mg/l điều này có ngh a là, hai chủng NOB có khả năng làm giảm lượng nitrite trong môi trường. Tuy nhiên, do khiếm khuyết về mặt thời gian nên nghiên cứu này chưa thể đánh giá định lượng hiệu quả loại bỏ nitrite và ammonia của bốn chủng này. Các thí nghiệm này sẽ được thực hiện trong thời gian tới để hoàn thành nghiên cứu. 4 KẾT LUẬN Từ 9 nguồn mẫu bao gồm mẫu hạt nổi, mẫu bùn, mẫu nước ao nuôi tôm và nước ao nuôi cá trê đã phân lập được bốn chủng vi khuẩn trong đó có hai chủng xử lý ammonia và hai chủng xử lý nitrite. Kết quả định tính và sau khi sử dụng bộ test Sera thì kết quả cho thấy rằng cả bốn chủng đều loại bỏ tốt ammonia và nitrite sau thời gian 48 giờ nuôi cấy trong môi trường bổ sung cơ chất ammonia và nitrite. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boyd, C.E, 1998. Water quality in pond for aquaculture. Department of fisheries and applied aquaculture, Auburn University. [2] Chen, J.C. and S.F. Chen, 1992. Effects of nitrite on growth and molting of Penaeus monodon juveniles. Comparative boichemistry and physiology part C: Comparative pharmacology and toxicology. [3] Hagopian and Riley, 1998. A closer look at the bacteriology of nitrification. Aquacultural Engineering. [4] Kungvankij, P., T.E. Chua, J. Pudadera, G. Corre, L.B. Tiro, I.O. Potestas, G.A. Taleon and J.N. Paw, 1986. Shrimp culture: pond design, operation and management. NACA training manual series. 337