Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG "

Chia sẻ: Nguyen Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

106
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò sữa, việc áp dụng vi tiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng là cần thiết. Trứng bò thu nhận từ nhiều nguồn đ ược nuôi trưởng thành trong TCM 199 v ới 20% FBS (Fetal Bovine Serum). Tinh trùng bò s ữa đông lạnh được hoạt hoá bằng ph ương pháp swim-up trong môi trường BO. Sau khi vi ti êm, trứng được hoạt hoá

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG "

337 Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT TẠO PHÔI B Ò BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TR ỨNG Trần Thị Thanh Khương, Đặng Ho àng Lâm, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc ĐH Khoa học Tự nhi ên TPHCM MỞ ĐẦU Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò s ữa, việc áp dụng vi tiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng l à cần thiết. Trứng b ò thu nh ận từ nhiều nguồn đ ược nuôi trưở ng thành trong TCM 199 v ới 20% FBS (Fetal Bovine Serum). Tinh trùng bò s ữa đông lạnh được hoạt hoá bằng ph ương pháp swim-up trong môi trường BO. Sau khi vi ti êm, tr ứng được hoạt hoá. Sau 9 lần thực hiện với 44 trứng tạo, đ ược 20 phôi, với tỷ lệ th ành công là 47,17% và phôi đạt giai đoạn morula l à 10%. ICSI - Intracytoplasmic sperm injection là phương pháp vi tiêm m ột tinh tr ùng được lựa chọn từ trước đó vào bào tương trứng, với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao tác cùng với kính hiển vi đảo ngược. Kỹ thuật n ày ra đời vào năm 1992 do Palemo và cs đ ã ứng dụng thành công trên người. ICSI như là một cuộc cách mạng trong hỗ trợ sinh sản đặc biệt trong chữa trị vô sinh nam. Đối với gia súc, sau khi thực hiện ICSI, tế b ào trứng có chứa tinh tr ùng phải trải qua quá trình ho ạt hoá với các tác nhân nh ư xung điện, ethanol 7%, Calcium Ionophore (A23187)… T ạo phôi b ò b ằng phương pháp vi tiêm đ ã m ở ra hướng mới trong nhân giống bò đem lại hiệu quả cao, đặc biệt l à bò s ữa trong trường hợp nguồn giao tử có chất lượng kém hoặc ngu ồn trứng đông lạnh. B ên c ạnh đó, việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại c òn giúp hoàn thi ện các quy tr ình công ngh ệ khác trong các nghi ên c ứu xa như t ạo d òng, sinh thi ết, tạo động vật chuyển gen, bảo tồn động vật quý hiếm… VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG P HÁP Chu ẩn bị trứn g: Tr ứng b ò t ươi thu nhận tại l ò m ổ hay trứng đông lạnh đ ược l ựa chọn, phân loại A, B. Các trứng n ày được nuôi trưởng thành trong môi trư ờng TCM 199 (Sigma) v ới 20% FBS (In vitrogen). Sau 24 giờ nuôi, tiến h ành phá l ớp t ế b ào cumulus bao quanh tr ứng bằng e nzyme hyaluronidase (1mg/ml, Sigma).
338 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 (a) (b) Hình 1. Trứng bò chín. (a) Trước khi phá lớp cumulus, (b) Sau khi phá lớp cumulus Chuẩn bị tinh tr ùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được giải đông ở 37 oC trong 60 giây. Th ực hiện swim -up 15 phút trong môi t rường BO, thu nhận dịch nổi, chọn tinh trùng cho vi tiêm. Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương tr ứng Vi tiêm: Hút tinh trùng b ằng kim tiêm (injection pipette) trong gi ọt PVP (In vitrogen) chuy ển qua giọt TCM 199 chứa trứng. Kim giữ (holding pipette) trứng đ ược điều chỉnh thể cực ở vị trí 6 giờ hay 12 giờ, tiến h ành tiêm tinh trùng vào bào tương trứng một cách nhẹ nh àng, nhanh chóng v ới thể tích đưa vào bào tương trứng ít nhất.
339 Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Chuyển trứng sau khi vi tiêm vào môi trường nuôi phôi CR1aa. Sau 4 giờ nuôi, tiến hành ho ạt hoá trứ ng sau khi vi tiêm v ới TCM 199 với 7% ethanol trong 4 phút. Tiếp tục nuôi phôi trong môi trường CR1aa v à theo dõi các giai đoạn phát triển của phôi. KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN Sau 9 lần vi tiêm, được 44 trứng, số phôi thu đ ược là 20 phôi, chi ếm tỷ lệ tạo phôi là 47,17%. Trong 20 phôi có 2 phôi ở giai đoạn 2 tế bào (10%), 5 phôi giai đo ạn 4 tế bào (25%), 10 phôi giai đo ạn 8 tế bào (50%), 1 phôi giai đo ạn 16 tế b ào (5 %) và 2 phôi giai đoạn morula (10%). (a) (b) (c) (d) Hình 3. Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI. (a) Phôi 2 t ế bào, (b) Phôi 4 t ế bào, (c) Phôi 8 t ế bào, (d) Phôi morula Năm 1989, Younis và cs đ ã tạo được phôi b ò bằng kỹ thuật ICSI truyền thống v à trứng không hoạt hóa với tỷ lệ 2%. Li v à cs (1999) t ạo phôi bằng piezo -ICSI có ho ạt hóa bằng ethanol 7% phôi tạo ra với tỷ lệ 26,4%. Cùng năm đó Hamano đ ã thành công với tỷ lệ tương đối cao là 56,6 %. Năm 2004, Kato, H., Matsumoto và cs đ ã so sánh giữa hoạt hóa bằng ethanol 7% v à không ho ạt hóa, đạt tỷ lệ phôi l à 51% so v ới không hoạt hóa l à 13%. Takenaka và cs (2005) cùng dù ng phương pháp hoạt hóa bằng ethanol 7% với tỷ lệ tạo phôi l à 75,6%.
340 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Như vậy với tỷ lệ tạo phôi là 47,17 % là tương đối cao, cao hơn hẳn với lần thực hiện đầu tiền vào năm 1989. So với các nghi ên cứu gần đây th ì t ỷ lệ tạo phôi là tương đối thấp, tuy nhi ên các nhà khoa h ọc trên thế giới thực hiện ICSI có hỗ trợ Piezo trong khi chúng tôi th ực hiện với phương pháp cổ điển, d ùng lực cơ học của kim ti êm vào màng trứng. Kỹ thuật Piezo -ICSI, màng pellucida và màng noãn s ẽ chịu ít sự tác động của đầu pipette m à thay vào đó là có sự hỗ trợ của tia piezo. Một trong những thuận lợi của kỹ thuật piezo l à giảm đáng kể sự phá hủy trứng trong suốt quá tr ình thụ tinh. Trong khi với kỹ thuật cổ điển, lực của đầu kim gồm lực tiếp tuyến v à lực xoay đ ã phần nào tác động đến tế bào chất trứng. Như vậy, với kỹ thuật ICSI cổ điển chúng tôi đ ã tạo ra phôi với tỷ lệ 47,17% c ùng với sự hoạt hóa của ethanol 7%. Tuy ethano l7% không ph ải là tác nhân ho ạt hóa nhân tạo tối ưu nhưng tỷ lệ tạo phôi cũng tương đối cao. Hơn thế nữa, ethanol 7% là hóa chất dễ có và tiện lợi trong điề u kiện chúng tôi Có thể khẳng định rằng với nguồn mẫu ổn định, trứng chất l ượng tốt, hệ thống vi thao tác t ốt, ổn định c ùng với tay nghề của kỹ thuật vi ên thao tác cao thì t ỷ lệ phôi b ò bằng phương pháp ICSI không chỉ dừng ở tỷ lệ 47,17% m à còn cao h ơn nữa. Đối với trứng người, tỷ lệ ICSI cao hơn so với IVF, nhưng ở bò: theo Kim tea Chung và cs (1999) t ỷ lệ phôi IVF l à 75%, của Phan Kim Ngọc v à cs (2006) là 72,19% tỷ lệ tạo phôi bằng ICSI thấp h ơn do bản chất của t rứng bò khó ho ạt hóa hơn so với trứng người và để tạo th ành hợp tử, chúng phải nhận những kích thích nhân tạo. Tuy nhiên, Gyu-Jin Rho và cs (1998) đ ã tiến hành xác định giới tính tinh tr ùng bằng phương pháp Flow Cytometry v ới tỷ lệ 80% v à tiến hành vi tiêm tinh trùng đ ã xác định giới tính. T ỷ lệ phôi đạt được với phương pháp này là 46,6% và phôi ở giai đoạn blastocyst là 6,9%. So v ới kết quả tạo phôi của chúng tôi l à 47,17 % cao hơn. KẾT LUẬN Trong phương pháp chu ẩn bị giao tử, swim -up dùng cho ho ạt hoá ti nh trùng phù hợp với ICSI. Tác nhân ethanol 7% có vai tr ò hoạt hoá trứng sau khi vi ti êm, cho k ết quả tạo phôi tương đối cao v à phù hợp với điều kiện thực hiện. Bằng kỹ thuật ICSI cổ điển, với tác nhân hoạt hoá l à ethanol 7% t ỷ lệ tạo phôi 47,17% với phôi đạt giai đoạn morula là 10%. TÀI LI ỆU THAM KHẢO 1. Carlos A. Guerrero. (2006) Cryopreservation And Intracytoplasmic Sperm Injection With Bovine Epididymal Spermatozoa . .S. Louisiana State University. 2. Henry E. Malter & Jacques Cohen.(2002) Intracytoplasmic sperm injection: technical aspects. Gamete source, manipulation and disposition. 3. Heuwieser W, Yang X, Jiang S, Foote RH: Fertilization of 21. Yanagida K, Katayose H, Yazawa H, et al(1992): Successful fertilizabovine oocytes after microsurgical injection of sp ermatozoa Theriogenology
341 Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT 4. Jin-Tae Chung (1999). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Department of Animal Science Macdonald Campus McGill University, Montreal, Quebec, Canada. 5. Keith J. Betteridge (2004). New reproductive Technologies in Cattle: A Veterinary Perspective . Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada. 6. Kimura, Y & R. Yanagimachi (1995 ). Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol. Reproduction. 52: 709 -720. 7. Mapletoft RJ & J. F. Hasler (2005). Assisted reproductive technologies in cattle: a review. (1) Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 5B4, Canada (2) AB Technology, Bionich e Animal Health USA, Inc., Pullman, WA 99163, United States of America. 8. Ragaa Mansour (1998). Intracytoplasmic sperm injection: a state of the art technique Human Reproduction Update , Vol. 4, No. 1 pp. 43-56. 9. Toshitaka Horiuchi (2002) Application of Intracytoplasmic Sperm Injection to Animal Production . Faculty of Life and Environmental Sciences Department of Life Sciences. SUMMARY Bovine embryo production by intracytoplasmic sperm injection Tran Thi Thanh Khuong, Dang Hoang Lam, Pham Van Phuc, Phan Ki m Ngoc University of Sciences HCMCity Due to bovine oocyte source is rare. To increase fertilization effect, application of intracytoplasmic sperm injection method is nessesary. In our research, bovine oocytes are collected at slaughter-house and cultured with TCM 199 plus 20% FBS (fetal bovine serum) until maturation. Cryopreserved bovine semen is thawed and activated with BO medium. After injection, oocytes are treated with 7% ethanol in TCM 199 for 4 min for activation. In 9 repeats, 44 oocytes were in jected, with 20 embryo that are formed, with 47,17% cleavage rate, 10% morula embryo.