Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của đề tài là đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng lợn tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm vào môi trường nuôi phôi tới khả năng phát triển phôi in vitro của tế bào trứng lợn. Nghiên cứu này sẽ góp phần hoàn thiện hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÊ THANH QUANG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO HIỆU QUẢ HỆ THỐNG TẠO PHÔI IN VITRO Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 60 42 01 03 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VIỆT LINH HÀ NỘI, 12/2015 i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ Phôi đặc biệt là TS. Nguyễn Văn Hạnh, Ths. Nguyễn Thị Hiệp, Ths. Nguyễn Thị Nhung đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ và góp ý để tôi hoàn thành luận văn này. Luận văn được hoàn thành với sự tài trợ của Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ quốc gia trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của giọt noãn bào chất đơn tính lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi” mã số 106.12-2012.93 do TS. Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm. Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện về thủ tục hành chính để tôi bảo vệ luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn sát cánh, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2015 Học viên Lê Thanh Quang i – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC NỘI DUNG Số trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Cơ sở khoa học 3 2.1.1 Buồng trứng và quá trình hình thành nang trứng 3 2.1.1.1 Đặc điểm của buồng trứng 3 2.1.1.2 Quá trình hình thành và phát triển của nang trứng 3 2.1.1.3 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng 6 2.1.2 Sự thành thục của tế bào trứng 9 2.1.3 Sự thụ tinh của tế bào trứng động vật có vú 11 2.2Sự thành thục trứng lợn in vitro (In vitro maturation – IVM) 12 2.3 Thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi in vitro (In vitro 14 fertilization, In vitro Culutre – IVF, IVC) 2.3.1 Thụ tinh ống nghiệm ở lợn 14 ii – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.3.2 Quá trình nuôi phôi 15 2.4 Quá trình nuôi phôi với tế bào đệm (co culture) 15 PHẦN III. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 20 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 20 3.4. Phương pháp nghiên cứu 20 1. Phương pháp thu nhận chất lượng tế bào trứng 2. Phương pháp phân loại chất lượng trứng 3. Phương pháp nuôi thành thục tế bào trứng lợn in vitro (In vitro maturation - IVM) 4. Phương pháp đo nồng độ GSH nội bào 5. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi thành thục in vitro (IVM) 6. Phương pháp thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng lợn với tinh trùng đông lạnh, giải đông 7. Phương pháp nuôi phôi 8. Phương pháp đánh giá chất lượng phôi nang 9. Phương pháp xử lý số liệu iii – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 Phần I. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới khả 28 năng thành thục của tế bào trứng lợn Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục 28 của tế bào trứng lợn Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trong các nồng độ oxy khác nhau tới nồng độ Glutahinone 31 (GSH) tế bào trứng lợn Phần II. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới sự phát 34 triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1. Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 ẢNH MINH HỌA 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iv – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro 28 tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 5%. Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ cysteine lên sự thành thục in vitro 29 tế bào trứng lợn ở nồng độ oxy 20 %. Bảng 3. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine tới nồng độ Glutathione trong tế bào trứng lợn sau khi nuôi thành thục in vitro ở 32 nồng độ oxy 5% Bảng 4. Ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi 33 tới nồng độ Glutathione trong trứng ở nồng độ 20% oxy Bảng 5. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm tới khả năng phân 35 chia của trứng lợn thụ tinh ống nghiệm. Bảng 6. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới khả năng phát triển phôi vượt 36 v – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
qua giai đoạn 2-16 tế bào. Bảng 7. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ 38 tinh ống nghiệm đến giai đoạn phôi nang Bảng 8. Ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển của phôi lợn thụ 40 tinh ống nghiệm đến chất lượng phôi nang DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên Biểu đồ Trang Biểu đồ 1. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng 31 độ oxy khác nhau tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn. Biểu đồ 2. So sánh ảnh hưởng việc bổ sung cysteine ở mức nồng 34 độ oxy khác nhau tới nồng độ GSH tế bào trứng lợn. Biểu đồ 3. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và 37 sự phát triển phôi tới giai đoạn 2-16 tế bào của trứng lợn TTON Biểu đồ 4. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phân chia và 39 hình thành phôi nang của trứng lợn TTON Biểu đồ 5. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự phát triển phôi đến giai đoạn 2-16 tế bào và hình thành phôi nang của trứng lợn 40 TTON Biểu đồ 6. So sánh ảnh hưởng của tế bào đệm tới sự hình thành 41 vi – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
phôi nang và chất lượng phôi nang của trứng lợn TTON DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bê FM Fertilization medium Môi trường thụ tinh FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GSH Glutathione IVC In vitro Culture Nuôi phôi IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In vitro muaturation Thành thục ống nghiệm LH Luteinsing hormone Hormone thể vàng vii – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào sợi thai chuột North Carolina State NCSU 23 Môi trường nuôi trứng, phôi University 23 North California State NCSU 37 Môi trường nuôi trứng, phôi University 37 NST Nhiễm sắc thể Ống dẫn trứng ODT pFF Porcine follicle fluid Dịch nang trứng lợn Porcine oviductal epithelial Tế bào biểu mô ống dẫn trứng POEC cell lợn Porcine endometrial epithelial PEEC Tế bào nội mạc tử cung lợn cell Pregnant mare’s serum PMSG Huyết thanh ngựa chửa gonadotropin TCM Tissue Culture Medium Môi trường nuôi cấy TN Thí nghiệm viii – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
tt/ml Tinh trùng/ml TTON Thụ tinh ống nghiệm vcs Và cộng sự ZP Zona pellucide Màng trong suốt ix – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN I. MỞ ĐẦU Sự phát triển của công nghệ sinh học sinh sản góp phần nâng cao hiệu suất vật nuôi, bảo tồn đa dạng sinh học. Lợn là một trong các đối tượng ngày càng được quan tâm nghiên cứu đặc biệt trong lĩnh vực y sinh bởi sự tương đồng về cấu tạo, sinh lý, di truyền với con người. Do vậy, việc tạo ra các sản phẩm phôi ống nghiệm ở lợn kết hợp với chuyển gene sẽ tạo ra nhiều cơ hội cho việc sử dụng động vật biến đổi gene như là thiết bị kiểm tra các phản ứng sinh học của sản phẩm dược, con cho trong ghép mô khác loài, tạo các dòng tế bào gốc phôi hay là sử dụng làm mô hình trong nghiên cứu các bệnh ở người (Katska, 2006, Nguyễn Thị Ước vcs, 2008). Thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) là một trong những kỹ thuật chủ yếu tạo phôi ống nghiệm. Lợn con đầu tiên sinh ra từ kỹ thuật này được công bố bởi Cheng vcs, 1986. Sau đó kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm ở lợn tiếp tục được nghiên cứu và cải thiện, tuy nhiên hiệu suất tạo phôi in vitro (với các khâu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi) ở lợn còn thấp so với phôi phát triển trong cơ thể (in vivo) hay so với các loài động vật khác như bò, cừu ... Một trong những nguyên nhân của hiệu suất tạo phôi thấp có thể là sự không thành thục về tế bào chất của trứng lợn; hiện tượng đa thụ tinh; điều kiện môi trường nuôi in vitro … Việc cải thiện môi trường nuôi thành thục trứng hoặc nuôi phôi dựa trên những hiểu biết về sự trao đổi chất hoặc bắt chước các điều kiện trong cơ thể là một trong những ý tưởng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng lợn và bổ sung tế bào đệm vào môi trường nuôi phôi nằm trong hướng đi của ý tưởng bắt chước điều kiện trong cơ thể sống. Cysteine là một amino acid then chốt cấu thành glutathione (GSH) mà GSH được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc tạo cho tế bào một vi môi trường giúp bảo vệ tế bào, chống lại tác động của tổn thương oxy 1 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
hóa. Việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục có thể giúp cải thiện sự thành thục tế bào chất và quá trình thụ tinh in vitro ở trứng lợn. Đối với hiệu suất tạo phôi lợn in vitro, mặc dù một số tác giả đã công bố sự thành công của hiện tượng mang thai và tạo con non ở lợn sau khi chuyển phôi lợn ở giai đoạn 2-4 tế bào tạo ra từ hệ thống IVM-IVF. Tuy nhiên, tiềm năng phát triển phôi tạo ra từ hệ thống in vitro vẫn thấp hơn so với phôi phát triển trong cơ thể (in vivo) (Thompson, 2000; Kikuchi vcs, 1995; Rath vcs, 1998). Hơn nữa, một số phôi tạo ra từ hệ thống IVM-IVF có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang nhưng không phát triển đến giai đoạn phôi thai sau khi được cấy chuyển vào con nhận (Rath vcs, 1995; Koo vcs, 1997). Nguyên nhân của hiện tượng này có thể do điều kiện nuôi phôi chưa tối ưu cho sự phát triển phôi (Quian và cs, 2005). Cải thiện hiệu suất tạo phôi trong ống nghiệm có thể dựa trên những hiểu biết về sự trao đổi chất hoặc bắt chước các điều kiện trong cơ thể (Dobrinsky vcs, 1996). Ống dẫn trứng động vật có vú cung cấp các điều kiện sinh lý cho sự phát triển phôi ở giai đoạn sớm trong cơ thể và góp phần quan trọng trong sự thành công của việc mang thai (Pushpakumara, 2002). Mặc dù đã có những cải tiến, kết quả tạo phôi lợn in vitro vẫn còn thấp hơn so với hiệu suất tạo phôi của các loài khác như bò, cừu… cũng như khả năng tạo phôi trong cơ thể. Vì những lý do trên, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn” với mục đích đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung cysteine vào môi trường nuôi thành thục trứng lợn tới khả năng thành thục của tế bào trứng lợn và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào đệm vào môi trường nuôi phôi tới khả năng phát triển phôi in vitro của tế bào trứng lợn. Nghiên cứu này sẽ góp phần hoàn thiện hệ thống tạo phôi in vitro ở lợn ở Việt Nam. 2 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Buồng trứng và quá trình hình thành nang trứng 2.2.1.1 Đặc điểm của buồng trứng Ở động vật có vú, buồng trứng thuộc tuyến sinh dục cái có hai chức năng chính là sản xuất, nuôi dưỡng trứng thành thục phục vụ cho quá trình thụ tinh nhằm duy trì nòi giống và tiết ra các loại hormone sinh dục kích thích các bộ phận sinh dục thứ cấp phát triển, tác động đến chức năng của tử cung và thay đổi tính biệt giữa con đực và con cái. Hoạt động sinh dục ở gia súc được điều hòa bởi sự phối hợp thần kinh - nội tiết trong trục dưới đồi - tuyến yên - buồng trứng. GnRH sinh ra LH và FSH, thông qua vòng tuần hoàn vào buồng trứng kích thích buồng trứng tiết ra estrogen, progesteron và inhibin. Cấu tạo của buồng trứng: Bên ngoài là lớp màng liên kết chắc chắn, bên trong chia làm hai miền: Miền vỏ và miền tủy, hai miền này được cấu tạo bằng mô liên kết sợi xốp có tác dụng như một chất đệm ... ở miền tủy có mạch máu nhiều hơn và tổ chức mô xốp cũng dầy hơn. Miền vỏ có tác dụng sinh lý vì ở đó quá trình phát triển nang trứng, quá trình phát triển trứng chín và sự rụng trứng được diễn ra. 2.2.1.2 Quá trình hình thành và phát triển của nang trứng Các giai đoạn phát triển của nang trứng bao gồm: Từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp, nang thứ cấp và cuối cùng là nang trứng chín (De Graff):  Nang nguyên thủy sinh ra từ biểu mô mầm chỉ có ở cơ thể con vật trong giai đoạn bào thai. Sau khi con vật được sinh ra thì các nang nguyên thủy sẽ phát triển thành nang thứ cấp. Nang nguyên thủy bao gồm một hoặc hai tế bào 3 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
trưng (ovocyt I) và được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt. Nang nguyên thủy của lợn rất lớn khoảng 12000 - 86000 nang.  Nang sơ cấp: bao gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30 - 60 m, nhân to, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng. Hạt Balliani là thể noãn đặc biệt chứa: có tính ưa axit, dạng hạt nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành noãn hoàng. Nang nguyên thủy và nang sơ cấp là những nang trứng không có hốc nang.  Nang thứ cấp được hình thành từ sự phát triển của nang sơ cấp, gồm một ovocyt I đã phát triển lớn hơn, chứa nhiều noãn hoàng hơn. Vỏ của ovocyt I dầy lên tạo thành mang trong suốt. Xung quanh có nhiều lớp tế bào bao quanh.  Nang trứng chín (Nang De Graff) do nang thứ cấp phát triển thành gồm một ovocyt I có đường kính 120 – 150 m, có nhiều noãn hoàng hơn, nhân to, tròn, rõ, vẫn còn hạt Balliani. Bao quanh tế bào trứng là mang trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là màng phóng xạ. Xung quanh hai bên của ovocyt I là phần tế bào hạt dày lên để giữ tế bào trứng gọi là đĩa trứng. Nang trứng chín có hai lớp vỏ: lớp vỏ bên ngoài mỏng, lớp vỏ bên trong dày hơn có chứa các mạch quản, lót trong màng trong là lớp tế bào hạt (lớp tế bào màng hạt). Giữa lớp màng hạt và màng phóng xạ của trứng là xoang nang chứa dịch nang có hormone estrogen và protein. Lợn là loài động vật đa thai sinh sản không theo mùa, một chu kỳ rụng trứng thì có nhiều trứng rụng vì vậy có nhiều nang trứng chín cùng phát triển trong một chu kỳ. Quá trình phát triển từ nang không có hốc thành nang có hốc thì trứng được di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, sau khi từ nang có hốc phát triển thành nang trứng chín thì trứng lại di chuyển ngược lại từ trung tâm nang trứng ra bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. 4 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản cho ta thấy nang sơ cấp (nang bậc I – primary follicle). Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Một tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tế bào hạt được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle). Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành một xoang. Khi một xoang đã được hình thành tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi chín và rụng ra khỏi buồng trứng. Hình 2.1. Cấu tạo buồng trứng 5 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.2.1.3 Sự hình thành và phát triển của tế bào trứng Quá trình hình thành tế bào trứng xảy ra ở lớp vỏ của buồng trứng từ những noãn bào nguyên thủy được phân bố vùng ngoại biên. Noãn bào nguyên thủy được hình thành rất sớm khi cơ thể khi vẫn còn trong giai đoạn bào thai từ những biểu mô phôi thai. Đa số nang nguyên thủy sẽ không tiếp tục phát triển mà bị tiêu biến bên trong buồng trứng, chỉ có một phần nhỏ được phát triển tạo ra tế bào trứng. Hình 2.2. Cấu tạo tế bào trứng Trứng là loại tế bào lớn nhất trong cơ thể chỉ mang n nhiễm sắc thể, có dạng hình cầu, ở lợn trứng có đường kính từ 0,12 - 0,17 mm. Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: Nhân, nguyên sinh chất và màng bao  Nhân: bao gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt nhân  Phần nguyên sinh chất: Bao gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, muối khoáng và các vật chất khác.  Màng: Bao gồm ba lớp màng từ trong ra ngoài: Màng trong, mang giữa và màng ngoài. 6 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
o Lớp màng trong: Là lớp màng mỏng bao bọc nguyên sinh chất, còn được gọi là màng noãn hoàng hay là màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi dưỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Trong màng có chứa men Muraminidaza. o Lớp màng giữa (màng trong suốt): Bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng. Tác dụng chủ yếu của màng này là đảm bảo dinh dưỡng cho tế bào trứng trong buồng trứng và ngăn không cho tình trùng khác loài có thể đi vào nhân trong quá trình thụ tinh do trong màng chứa mem Zonalizin đặc hiệu cho từng loài. Giữa màng trong suốt và màng nguyên sinh chất một khoảng trống. Khoảng trống này có độ dày khoảng 14 - 24 m, có độ PH 3 - 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. o Lớp màng ngoài: Bao gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này được phân bố xung quanh tế bào trứng nên được gọi là màng phóng xạ, hay màng tia. Các tế bào này liên kết với nhau bởi axít Hyaluronilic. Khi tinh trùng gặp trứng ở phần acrosom (phần đầu tinh trùng) tiết ra men Hyaluronidaza để phân giải và thủy phân axít Hyaluronilic làm cho màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện cho quá trình thụ tinh xảy ra. Ngoài cùng là lớp tế bào hạt cùng với lớp màng phóng xạ, lớp tế bào hạt tạo nên cho tế bào trứng lớp tế bào cumulus có vai trò rất quan trọng tới sự phát triển và chất lượng của trứng thành thục Lớp tế bào Cumulus: Có ảnh hưởng rất lớn tới sự thành thục của tế bào trứng về cả tế bào chất và nhân. Những tế bào này đóng vai trò như lớp trung gian liên hệ giữa tế bào trứng với môi trường dịch nang hay là môi trường nuôi trứng trong ống nghiệm (in vitro) (Kidson vcs, 2004). Các tế bào cumulus liên kết với tế bào trứng thông qua các đoạn nối trống, tạo điều kiện thuận lợi cho 7 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
các tế bào cumulus tiếp xúc trực tiếp với màng trong suốt (giới hạn bởi màng nguyên sinh chất) (Allworth vcs, 1993). Vì thế nên tế bào trứng luôn luôn có quan hệ mật thiết với môi trường ngoài. Những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của trứng được chuyển trực tiếp vào bên trong nội bào thông qua mối liên kết trên (Tanghe S vcs, 2002). Các tế bào cumulus đóng vai trò bảo vệ và trao đổi chất trong sự thành thục của tế bào chất, cần thiết cho sự hình thành tiền nhân đực (Male Pronuclear - MPN) và khả năng phát triển của trứng, chống lại stress oxi hóa bằng cách biến đổi cystine thành cysteine và hấp thụ cysteine có trong trứng (Tatemoto H vcs, 2000). Trong quá trình nuôi thành thục in vitro mức độ giãn nở (bông tơi) của lớp tế bào cumulus cũng là một chỉ tiêu có thể đánh giá sự thành thục của trứng về nhân và tế bào chất. Hầu hết động vật có vú, tế bào trứng đều được bao quanh bởi tế bào cumulus khi rụng trứng. Sự có mặt của lớp tế bào cumulus trong giai đoạn nuôi thành thục có ý nghĩa rất lớn trong sự thành thục của nhân (Metaphase II - MII), lượng glutathione (GSH) trong tế bào, tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng, sự hình thành tiền nhân (MPN). Quá trình phát triển từ noãn bào nguyên thủy đến hình thành trứng trải qua ba giai đoạn.  Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên bào: Nhờ quá trình nguyên phân liên tiếp nhiều lần mà số lượng noãn nguyên bào được tăng lên. Do cơ chế của quá trình nguyên phân nên các noãn bào được hình thành đều mang bộ nhiễm sắc thể là 2n và được bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô. Giai đoạn này diễn ra khi cơ thể con cái chưa thành thục về tính. Đến khi cơ thể thành thục thì các noãn nguyên bào sẽ lần lượt được phát trình thành trứng chín.  Giai đoạn sinh trưởng: Noãn nguyên bào tích lũy chất dinh dưỡng, tăng kích thước và khối lượng hình thành nên các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I, tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. 8 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn
 Giai đoạn hình thành trứng: Nhờ cơ chế giảm phân noãn bào cấp I giảm phân thông qua hai lần phân bào liên tiếp. o Lần phân bào I: Noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (Noãn bào thứ cấp) có khối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàn của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thước bé (cực cầu thứ nhất) o Lần phân bào II: Noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng lớn và cực cầu bé thứ hai. Trong lúc đó cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia thành hai cực cầu bé. Kết quả sau quá trình giảm phân từ một noãn bào cấp I cho một trứng lớn và ba cực cầu bé. Trứng và cực cầu bé đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội n. Trứng có khối lượng và kích thước lớn vì đã nhận toàn bộ khối noãn hoàng từ noãn bào cấp I điều đó có ý nghĩa phát triển của trứng, kết thúc giai đoạn giảm phân thì trứng chín. 2.2.2 Sự thành thục của tế bào trứng Sau khi trải qua quá trình hình thành và đạt được kích thước cực đại, trứng sẽ chuyển sang giai đoạn thành thục. Các noãn bào trong nang trước khi có thể thụ tinh phải trải qua hai lần phân bào giảm nhiễm. Khi sinh ra noãn bào I bị kìm hãm ở kỳ đầu của lần phân chia giảm nhiễm I. Sự phát triển sau này là quá trình phức tạp gọi là sự thành thục của noãn bào. Quá trình này bao gồm toàn bộ những biến đổi tế bào học và chuyển hóa làm cho noãn bào I có khả năng thụ tinh, đảm bảo các hình thành các tiền nhân cái và tiền nhân đực và cho phép bắt đầu phát triển phôi nhờ các chất dự trữ ( mRNA, riboxom, các loại protein được tạo ra ở giai đoạn tăng trưởng). Thành thục trứng bao gồm sự thành thục về nhân, tế bào chất và sự thay đổi của màng noãn bào I.  Quá trình thành thục nhân: Là tiếp tục quá trình giảm phân và đạt tới giai đoạn Metaphase II. Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục , nhân có kích 9 – ĐHTN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn