intTypePromotion=1

Báo Cáo Tổng Kết: Nghiên Cứu Thay Thế Chủng Nakayama Bằng Chủng Beijing-1 Trong Sản Xuất Vacxin Viêm Não Nhật Bản

Chia sẻ: Japet75 Japet75 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:141

0
109
lượt xem
32
download

Báo Cáo Tổng Kết: Nghiên Cứu Thay Thế Chủng Nakayama Bằng Chủng Beijing-1 Trong Sản Xuất Vacxin Viêm Não Nhật Bản

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giới thiệu kết quả xây dựng quy trình chế tạo chủng gốc và chủng sản xuất; quy trình công nghệ sản xuất văcxin viêm não Nhật Bản (VNNB) từ chủng Beijing-1. Giới thiệu kết quả kiểm tra thành phần hoá học của 6 loại văcxin VNNB sản xuất thử nghiệm từ chủng Beijing-1, kết quả kiểm tra hình thái trên kính hiển vi điện tử JEM 1010, kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu của 6 loạt văcxin thử nghiệm và kết quả đánh giá tính bền vững của văcxin VNNB. Thử nghiệm lâm sàng, đánh giá...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Báo Cáo Tổng Kết: Nghiên Cứu Thay Thế Chủng Nakayama Bằng Chủng Beijing-1 Trong Sản Xuất Vacxin Viêm Não Nhật Bản

  1. viÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng c«ng ty v¾c xin vµ sinh phÈm sè 1 b¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi KHCN cÊp Nhµ n−íc nghiªn cøu thay thÕ chñng nakayama b»ng chñng Beijing-1 trong s¶n xuÊt v¾c xin viªm n∙o NhËt b¶n M∙ sè ch−¬ng tr×nh : kc.10.22 chñ nhiÖm ®Ò tµi: GS.TS Huúnh ph−¬ng liªn 5983 23/8/2006 Hµ néi – 2006
  2. CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản - Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu chứng viêm não ở ngựa và ở người. Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng tại Nhật Bản. Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [62]. - Năm 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115]. - Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183]. - Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào chủng viêm não ngựa miền Tây. - Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của bệnh là do muỗi truyền [183]. - Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut VNNB [16]. Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện. Văcxin bất hoạt tinh khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111]. - Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người. Từ đó bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [21]. 2. Phân loại virut VNNB Virut VNNB là một thành viên của virut Arbo (arthropod borne viruses). Là những virut do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất cả các virut arbo đều có hệ gen (genome) là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [20, 24]. Việc đặt tên cho các virut arbo đôi khi dựa vào bệnh như sốt Dengue, số vàng (yellow fever) hoặc theo vùng địa lý mà ở đó lần 1
  3. đầu tiên phân lập được virut như viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis), St. Louis encephalitis, West Nile fever... Có trên 350 loài trong nhóm virut arbo, trong đó arbo gây bệnh cho người có trên 75 thành viên, được sắp xếp theo mối quan hệ kháng nguyên. Một số tác giả nghiên cứu để xếp loại theo các đặc tính địa lý. Nhiều virut arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae... Họ Togaviridae được chia thành 2 chi (genus) là Alphavirus thuộc nhóm A trong đó điển hình là các loài Aura; Babanki; Barmah Forest; Eastern equine encephalitis; Everglades; Western equine encephalitis; Whataroa. Họ Flaviviridae thuộc nhóm B bao gồm: Japanese encephalitis (VNNB); Dengue; Yellow fever; West Nile fever; Brazilian encephalitis… DEN JE TBE YF DEN WN KUN MVE JE SLE POW LGT LI TBE 3 1 2 4 CEE RSSE 100 96 E-Protein Amino Acid Homology (%) 93 90 91-94 85-89 82 80 77 77-78 77-78 72-74 69 70 62 60 46-53 50 40-44 40 Hình 1: Mô hình so sánh các virut trong nhóm Flavivirus dựa vào trình tự axit amin của protein vùng vỏ (E-protein), sử dụng phần mềm Beckman Microgenie Software package, Version 4.0 [101]. (DEN: Dengue; WN: West Nile; KVN: Kunjin; MVE: Murray Valley encephalitis; JE: Japanese encephalitis; SLE: St. Louis encephalitis; YF: Yellow fever; POW: Powassan; LGT: Langat; LI: Louping ill; TBE: Tick borne encephalitis) Các tác giả phân tích trong 3 nhóm chính DEN, JE và TBE cho thấy: Phân tích huyết thanh hỗn hợp JE và DEN thì tỷ lệ giống nhau là 46-53%. DEN1 và DEN3 có quan hệ gần nhất (77% tương đồng); với DEN2 là 69% và DEN4 là 62%. JE và TBE có tỷ lệ nucleotit cùng loại 72-77%, còn axit amin của protein E cùng loại là 40-44% [101]. 2
  4. Hội nghị 1992 tại Geneve, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã xếp loại viêm não do muỗi truyền và gây tổn thương thần kinh trung ương được ký hiệu như sau: A83.0 Viêm não Nhật Bản A83.1 Viêm não ngựa miền Tây A83.2 Viêm não ngựa miền Đông A83.3 Viêm não St. Louis A83.4 Viêm não châu Úc A83.5 Viêm não California A83.6 Viêm não virut Nga A83.7 Viêm não virut do muỗi truyền khác A83.8 Viêm não virut do muỗi truyền không xác định Viêm não Nhật Bản được xếp hàng đầu trong các loại viêm não do muỗi truyền, bệnh để lại hậu quả nặng nề nên đã có văcxin phòng bệnh từ 1954, và sớm có các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để xác định căn nguyên [31, 47, 95, 115, 120, 139, 148, 187]. 3. Đặc điểm và cấu trúc của virut VNNB Virut có hình cầu, đường kính trung bình 40-50nm, có màng lipid kép, gắn vào lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi ARN đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsid. Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [152, 180]. Cấu trúc phân tử của sợi ARN bao gồm 11000 nucleotid, tương ứng với 3400 axit amin. Đây chính là yếu tố gây nhiễm của virut. Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa. Kết quả dịch mã để hình thành một polyprotein đơn được giải phóng sau sự hoạt hóa của tế bào chủ và enzym chuyển hóa tạo ra sự phân cắt của các protein [31]. 3
  5. Vỏ (Envelope) M (Membrane) Lớp Lipit kép Nucleocapsid 118 nt ORF ®¬n (10233 nt) 51 nt 5’ 7-m G 3’ Sù phiªn m· vµ ph©n c¾t protein Capsid preM E NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 Phiªn m· trªn m¹ng l−íi néi chÊt h¹t NS2A NS2B NS4A NS4B Hình 2: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruses) Trên hình 2, cho ta thấy sắp xếp thứ tự các protein trong sợi ARN: Cap 5’-C- preM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’. Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo. Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein vỏ capsid của ARN (C); protein tiền màng (preM); hoặc protein màng (M) của virut trưởng thành và protein vỏ (E) là protein cấu trúc chiếm 1/4 chiều dài của hệ gen. Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen [149, 181]. 4
  6. 3.1 Protein C Protein C rất nhỏ, chỉ 9-12 KDa gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm một số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [106, 148]. 3.2 Protein M Protein M có 2 dạng: protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và quan sát thấy có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Từ đó một số tác giả nghiên cứu sử dụng protein E trong sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp để tổng hợp preM của virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác ở tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó (như yellow fever). Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease (furin-like) để tạo thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động chức năng duy trì nòi giống của virut trưởng thành [148, 170, 189]. Protein M có trong virut trưởng thành ngoài tế bào. Hạt virut trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt virut chưa trưởng thành khoảng 400 lần khi nghiên cứu so sánh trên hạt virut chưa hoàn chỉnh, vì vậy khả năng tiếp cận với tế bào đích dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [58, 104]. 3.3 Protein E Có trọng lượng phân tử 55-60KDa, là một glycoprotein bao gồm khoảng 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [56, 59, 115, 139, 147, 149]. 3.4 Các protein không cấu trúc (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) - NS1: có trọng lượng phân tử 42-50KDa, là một glycoprotein gồm 353-354 axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm, có thể NS1 như là đích của đáp ứng miễn dịch chăng? [86, 88, 148]. 5
  7. - NS3: có trọng lượng phân tử 67-70 KDa gồm 618-623 axit amin và có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotid của nhóm flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym proteaza và helicaza [31, 101, 148]. - NS5: có trọng lượng phân tử 104-106 KDa gồm 900-905 axit amin và cũng có tính bảo tồn cao trong chuỗi nuleotid. Một số nghiên cứu khác cho thấy NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsid của ARN. Các nghiên cứu invitro polymeraza đã thẩm định và cho thấy NS3 và NS5 được sử dụng khi ARN của virut nhân lên [148, 149, 176, 179, 181]. - NS2A-NS2B-NS4A và NS4B: đều rất nhỏ bé, có tính chất bảo tồn kém trong chuỗi nucleotid, có thể nghĩ đến sự mã hóa của chúng có liên quan đến protein M. Những năm gần đây, các nghiên cứu về sinh học phân tử của virut VNNB đã có những bước tiến đáng kể. Định loại cấu trúc 3 protein của virut VNNB là M, C và E. Protein E phân lập được từ bề mặt của hạt virut. Thử nghiệm trên động vật có vú cho thấy protein E tạo ra kháng thể trung hòa sau khi tiêm và các động vật này (chuột nhắt trắng) đã sống sót sau khi thử thách bằng chủng độc lực. Khả năng bảo vệ của protein E được thử nghiệm và phân tích bằng thử nghiệm kháng thể đơn dòng (MAb) để định loại nhiều epitop có phản ứng chéo với các flavivirus và cũng giống nhau về đặc tính sinh học [23, 24, 31]. 3.5 Tính chất hóa lý và bền vững của virut VNNB [31, 82] - Virut VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/m3 trong cesium chlorid. - Hệ số lắng 200S. - Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton. - Độ bền vững: với độ pH giao động từ 7-9. Thích hợp nhất là pH 8. - Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút ; 37oC trong vài giờ. Nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu. - Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt... 3.6 Thành phần và quyết định kháng nguyên Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên của flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm kháng nguyên quan hệ mật thiết và rất khăng khít với nhau đó là sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) [29, 140]. Bằng các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt. Riêng phản ứng trung hòa (NT) là nhạy nhất tiếp đến là phản ứng 6
  8. kết hợp bổ thể (CF), rồi miễn dịch huỳnh quang (IF). Vậy đánh giá đáp ứng miến dịch sau khi tiêm văcxin bằng ký thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT) trên tế bào [126, 127]. Hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại flavivirus và phân biệt với virut VNNB [59, 68, 74, 102, 104, 123, 126, 127, 128, 139, 151]. Những năm cuối thập kỷ 90, công nghệ sinh học phân tử phát triển không ngừng và chỉ cần sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), với cặp mồi (primer) đặc hiệu thì rất nhanh chóng định loại được typ virut trong các flavivirus [118, 133]. Hoặc xa hơn còn phân tích được đặc tính di truyền của các virut VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau bằng phương pháp phân tích trình tự gen (sequencing), so sánh trình tự các nucleotid của các chủng virut VNNB khác nhau [134, 185]... Ngày nay, nhờ công nghệ này mà nhiều nhà khoa học đã cố gắng chế tạo các văcxin tái tổ hợp ADN nhằm cải thiện một bước công nghệ gen trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng [65]. 3.7 Khả năng bảo vệ của kháng nguyên Kháng nguyên tạo ra kháng thể tương ứng, nhưng không phải tất cả các kháng nguyên đều liên quan đến việc gây bệnh và sinh miễn dịch. Thường có 1-2 kháng nguyên quyết định tính sinh miễn dịch và cũng là kháng nguyên bị kháng thể trung hòa nếu xâm nhập vào cơ thể đã được miễn dịch. Kháng nguyên này nằm ngay trên bề mặt của hạt virut. Đó là kháng nguyên chịu trách nhiệm tiếp xúc đầu tiên trên tế bào chủ. Với hạt virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của virut), cũng chính 2 thành phần glycoprotein này sinh kháng thể ƯCNKHC (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) [31, 96, 111, 151]. Để chứng minh đều này khi Kitano và Suzuki đã tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Kết quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn và bằng kháng nguyên HA đều có hiệu giá như nhau. Từ đó hai tác giả kết luận yếu tố ngưng kết hồng cầu (HA) là kháng nguyên kích thích tạo ra kháng thể trung hòa [82]. 4. Sự nhân lên của virut trên tế bào 4.1 Chu kỳ nhân lên của virut ARN Khi virut gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [35, 115, 148]. Sau đó sợi ARN được bộc lộ là ARN đơn-polymeraza để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng 7
  9. hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [172]. ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của virut liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới [52, 53, 54]. 4.2 Sự nhân lên của virut trong tế bào 4. Cởi áo (bộc 1. Gắn kết lộ sợi ARN) thụ thể 3. Dung hợp màng 5. Dịch mã thành chuỗi tế bào ở pH thấp polyprotein 2. Thụ thể của tế bào 6. Sao chép ARN 7. Sự hình thành virion trong NSC 8. Lắp ráp và hoàn thiện 9. Phóng thích các hạt virut Hình 3 : Sơ đồ nhân lên của flaviviruses [148] Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực, chúng có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [23, 24, 45]. Tế bào thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà... các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột đất vàng), C6/36 (tế bào muỗi Albobitus). Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số 8
  10. loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [119]. Hiệu giá virut đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và thích hợp virut nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (Tế bào C6/36, Vero và BHK21) [117]. Hình ảnh tế bào tổn thương quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó. Tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào. Hoạt tính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm [132]. 5. Sinh bệnh học Virut VNNB có cấu trúc kháng nguyên giống như các flavivirus khác, bao gồm virut viêm não St. Louis, virut West Nile... vì vậy, chúng có phản ứng chéo với các epitop trung hòa với virut VNNB trên kháng nguyên bề mặt E. Một số phân typ của kháng nguyên đã được nghiên cứu, mặc dù vậy cho đến nay nghiên cứu sự khác nhau giữa các phân typ về độc tính thần kinh, vật chủ vẫn còn nghèo nàn. Vẫn các giả thiết, muỗi đốt qua da rồi virut nhân lên tại chỗ sau đó tiến đến các hạch lympho vùng. Virut tấn công đến hệ thần kinh trung ương và chắc chắn sẽ đến hệ tuần hoàn... tổn thương tế bào thần kinh trung ương rồi hủy hoại hệ thần kinh trung ương [92]. Virut nhân lên và khu trú ở não, vùng chất xám, vùng đồi thị, tiểu não và có mặt trong nước não tủy [40, 74, 75, 76]. Chẩn đoán căn nguyên VNNB chủ yếu dựa vào huyết thanh học [61, 80]. Sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA để phát hiện sớm IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong nước não tủy hoặc trong máu bệnh nhân trong vòng 4-7 ngày sau khởi bệnh [8, 22, 25, 26, 48, 71, 194]. Những phương pháp chẩn đoán khác như dot-blot hoặc kỹ thuật tủa miễn dịch (immuniprecipitation IgM assay) phát hiện IgM [167]. Có thể phân lập virut từ máu bệnh nhân trong giai đoạn sớm, từ dịch não tủy hoặc từ não tử thi. Kỹ thuật PCR để phát hiện hệ gen đặc hiệu của virut, đặc biệt trong dịch não tủy cũng dễ dàng phát hiện được sự có mặt của hệ gen virut VNNB [68, 93, 107, 133]. Mô hình nghiên cứu thí nghiệm trên chuột nhắt trắng là rõ ràng nhất [40]. Những nghiên cứu sâu về các thể lâm sàng và nhiễm virut thể ẩn cho thấy mức độ thể hiện lâm sàng: từ từ, đột ngột, thể nhẹ, thể nặng, thể ẩn phụ thuộc vào các yếu tố: đường gây nhiễm (dưới da, phúc mạc, não); số lượng virut xâm nhập vào cơ thể; tính độc lực của chủng virut; tuổi cảm nhiễm của vật chủ... Vật chủ là yếu tố rất quan trọng về tạo miễn dịch, sinh interferon. Sức khỏe của vật chủ ảnh hưởng đến tính sinh bệnh [73]. Thử nghiệm tiêm vào não chuột liều cao thì bệnh thể hiện dồn dập, đột ngột. Nếu liều gây nhiễm qua da, lượng virut thấp nên diễn biến trước tiên virut nhân lên ở máu ngoại vi rồi 9
  11. hướng thần kinh trung ương và sau đó gây ra Hội chứng não cấp. Tính từ khi virut nhân lên đến thời điểm sốt, đó là giai đoạn ủ bệnh. Thời gian này có thể 6-16 ngày, tùy thuộc vào các yếu tố trên. Hệ miễn dịch hoạt động trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Do đó, khởi bệnh sau 3-4 ngày đã có thể phát hiện kháng thể IgM và chính giai Virut truyền qua da Tổ chức ngoài thần kinh - Cơ vân, cơ trơn Hạch Lympho vùng - Tuyến tụy, thượng thận - Các tổ chức liên quan Tuyến ức Huyết tương Kháng thể thể dịch Máu Tổ chức biểu mô Nội mô mao mạch Mô thần kinh Tế bào nội mạc võng mô KT của hệ thần kinh trung ương Thần kinh đệm Lymphocyt Macrophage - Rối loạn chức năng tế bào - Ly giải tế bào - Viêm tế bào đoạn sớm này có thể phân lập được virut một cách dễ dàng từ dịch não tủy [25] . Hình 4: Quá trình xâm nhập và phát triển trong cơ thể sau nhiễm virut VNNB [121] Theo sơ đồ trên cho thấy: muỗi đốt, virut truyền qua da, nhân lên tại chỗ và tiến tới hạch lympho vùng, tuyến ức (hệ miễn dịch) rồi vào máu. Trước tiên, gây nhiễm virut huyết và các tổ chức ngoài thần kinh như cơ vân, cơ trơn, cơ tim, nội mao mạch, các tổ chức lympho, tuyến nội tiết, ngoại tiết và vào hệ tuần hoàn. Nhiễm virut huyết dao động bởi tỷ lệ di chuyển của macrophage và cuối cùng kích thích sinh kháng thể dịch thể, qúa trình này diễn biến khoảng một tuần sau khi nhiễm virut. Khi virut tiến tới hệ thần kinh trung ương, ngay lập tức gây cảm ứng thần kinh: thử nghiệm rất rõ ở chuột nhắt và khỉ, biểu hiện thương tổn chủ yếu ở vùng chất xám, đồi thị và tiểu não. Huang và Wong đã 10
  12. nghiên cứu theo dõi và miêu tả các tổn thương thần kinh trung ương cho thấy, liệt ngoại biên, liệt 4 chi và liệt toàn thân [66]. Miyake mô tả lại bệnh lý thể hiện ở người trong giai đoạn cấp: xung huyết, phù nề, xuất huyết vi thể ở não, gây hủy hoại và thái hóa tế bào thần kinh, viêm tắc mạch vi thể chủ yếu xảy ra ở chất xám, não giữa và thân não [111]. Ngoài ra các thương tổn ngoài tổ chức thần kinh như tăng sinh các trung tâm bạch huyết, viêm cơ tim, xuất hiện các tế bào kuffler ở gan, viêm phổi, xuất huyết thận [160]. Lợn nhiễm virut viêm não dẫn đến sẩy thai và tìm thấy các thương tổn ở bào thai lợn bị sẩy. Virut viêm não còn gây vô tinh, viêm mào tinh hoàn, viêm bao tinh hoàn và dừng sinh tinh dịch. Sau khi tiêm virut viêm não vào chuột cái chửa cũng gây sẩy thai. Ở người cũng đã chứng minh nhiễm virut truyền qua nhau thai, gây sẩy thai và đã phân lập được virut ở bào thai [111]. Đáp ứng miễn dịch bảo vệ: miễn dịch bảo vệ được kết hợp với sự phát triển của kháng thể trung hòa [193]. Mặc dù chưa có tiêu chuẩn quốc tế quy định, hiệu giá kháng thể trung hòa 1:10 hoặc lớn hơn 1:10 là đủ bảo vệ. Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào cũng được chứng minh trong nghiên cứu trên mô hình chuột. Đáp ứng miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch để điều trị viêm não điều chế từ huyết tương người chưa có. Theo kinh nghiệm của một số tác giả, bệnh viêm não do ve truyền thì phải được sử dụng ngay trước khi khởi bệnh mới có hiệu quả, nếu chỉ muộn 4 ngày sau khởi bệnh cũng không có hiệu quả. Một số nghiên cứu để điều trị sớm bằng α-interferon, có thể kết hợp với plasma miễn dịch điều trị dự phòng tốt hơn [50, 51, 64 165]. Đáp ứng miễn dịch chủ động: Văcxin phòng bệnh VNNB được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, hiện tại chỉ có văcxin bất hoạt, tinh khiết từ não chuột là được sử dụng rộng rãi [1, 4, 5, 6, 63, 70, 72, 168, 171, 182]. Văcxin bất hoạt và văcxin sống giảm độc lực trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK) được sản xuất và phân phối tại Trung Quốc với hơn 75 triệu liều văcxin bất hoạt và 25 triệu liều văcxin sống giảm động lực được sử dụng hàng năm tại Trung Quốc để dự phòng cho trẻ em [60, 116]. Tại Nhật Bản, các nhà sản xuất hàng năm chỉ đạt 11 triệu liều, đủ cung cấp trong nước và xuất khẩu 2 triệu liều. Văcxin bất hoạt từ não chuột do BIKEN (Nhật Bản) và Green Cross (Hàn Quốc) sản xuất đều được sử dụng ở các nước châu Âu, bắc Mỹ và Úc. Sau khi một sinh viên Mỹ ở Bắc Kinh chết do VNNB. Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC, Hoa Kỳ) chỉ sử dụng văcxin của BIKEN để tiêm cho lính Mỹ và du khách Mỹ đến các vùng có dịch. 11
  13. Gây bệnh thực nghiệm: Mô hình thực nghiệm có hiệu quả nhất là chuột nhắt, chuột hamster. Đó là động vật dễ cảm nhiễm với virut VNNB nhưng các yết tố có quyết định đến tính sinh bệnh là : + Đường gây nhiễm. + Lượng virut thâm nhập vào cơ thể. + Tuổi cảm nhiễm. + Độc lực thần kinh của chủng gây nhiễm. Nhiều tác giả đã nghiên cứu, đều có chung một nhận xét là chuột non có tính cảm nhiễm mạnh hơn chuột già [54]. Họ còn chứng minh đường gây nhiễm trực tiếp vào não, thời gian ủ bệnh và phát bệnh nhanh hơn đường ngoại biên [52]. Năm 1991, Ogata đã chứng minh virut viêm não có ái tính với tế bào thần kinh [125]. Dù đường vào cơ thể bằng trực tiếp với tổ chức não hay bằng đường ngoại biên thì virut cũng theo các hạch bạch huyết, hướng tới các nơron thần kinh và nhân lên mạnh mẽ, nhanh chóng ở tổ chức tế bào thần kinh. Miura đã nghiên cứu, phân tích về tính độc lực thần kinh ở chủng độc lực có một gen trội, chính gen này quyết định tính độc lực của chủng virut VNNB. Huang và Wong đã nghiên cứu và công bố kết quả trùng lặp với một số tác giả trước đó là: Trong giai đoạn cấp tính virut VNNB nhân lên và gây tổn thương tổ chức não như hiện tượng xung huyết, phù nề và xuất huyết ở não chuột [66, 122]. Các tiêu bản cắt cực mỏng soi trên kính hiển vi cho thấy sự thoái hóa, hoại tử tế bào thần kinh, hạch thần kinh đệm, nơron thần kinh, hiện tượng viêm quanh mao mạch [54, 132]. Các hiện tượng này xảy ra ở não trung gian, não giữa và thân não chủ yếu ở vùng chất xám. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận được sự tăng sinh của các trung tâm bạch huyết, tăng các tiểu thể Malpighi ở lách, viêm cơ tim, viêm tế bào Kuffler ở tổ chức gan, viêm giãn phế nan ở phổi và các nốt xuất huyết cục bộ ở thận. Johnson đã phát hiện thấy các kháng nguyên virut VNNB tập trung ở nơron thần kinh vùng đồi thị và thân não của bệnh nhân tử vong do VNNB [75]. Nghiên cứu virut VNNB ở lợn cho thấy lợn không có triệu chứng viêm não mà thường virut viêm não gây thai chết lưu hoặc sẩy thai và đã chứng minh virut viêm não ở não của lợn con bị sẩy. Ở lợn đực thì virut gây thiểu năng tinh dịch hoặc không có tinh dịch, viêm mào tinh hoàn và vỏ tinh hoàn. Ở phụ nữ mang thai bị viêm não sẽ gây sẩy thai và phân lập được virut từ bào thai. Tiêm virut viêm não qua đường phúc mạc cho chuột chửa cũng gây sẩy thai. Chuột nhiễm virut thể ẩn trong thời kỳ mang thai có thể nhiễm virut thể ẩn ở lần mang thai sau. 6. Xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán nghiên cứu phòng thí nghiệm 12
  14. 6.1 Xét nghiệm lâm sàng [77, 109, 110] - Bạch cầu tăng: 10-34x109/l; số lượng trung tính giao động 51-90% - Áp lực nước não tủy tăng (NNT) - Tế bào trong NNT tăng 10-980 x 106/l; protein < 900mg/l; nồng độ glucose bình thường. - Điện não đồ không có gì đặc biệt, bao gồm cả sóng theta và delta. Điện não đồ thay đổi có thể giúp phân biệt với viêm não do Herpes. Phân tích hình ảnh qua computer có thấy một chút thay đổi ở vùng chất xám, nhưng phải là chuyên gia có nhiều kinh nghiệm mới phát hiện được. 6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm vẫn thường theo một quy trình nhất định. Chẩn đoán sớm, nhanh và các phương pháp dịch tễ học. Phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu kháng virut VNNB còn phục vụ nghiên cứu, xác định căn nguyên là phân lập virut. Chúng tôi trình bày tuần tự các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm theo qui trình của TCYTTG. 6.2.1 Phân lập virut [43, 80, 81, 94, 162, 112, 193] - Tiêm vào não chuột sơ sinh - Nuôi cấy trên tế bào phôi gà, phôi vịt tiên phát - Nuôi cấy trên các dòng tế bào thường trực: Vero, LLCMK2, C6/36 và AP/61. - Kỹ thuật tiêm vào muỗi 6.2.2 Phát hiện kháng nguyên [39, 143, 145, 193] - Ngưng kết hồng cầu thụ động ngược. - Miễn dịch huỳnh quang. - Miễn dịch gắn vàng, bạc (MIGSS). 6.2.3 Phát hiện kháng thể [26, 36, 45, 55, 167] - ELISA tóm bắt kháng thể IgM - Avidin biotin system - Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Biotin - Thử nghiệm miễn dịch DOT tóm bắt IgM phát hiện màng nitrocellulose - Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu - Kỹ thuật kết hợp bổ thể - Kỹ thuật tan huyết phóng xạ đơn - Kỹ thuật trung hòa 13
  15. Để có thể chẩn đoán phân biệt viêm não do herpes hay VNNB , vùng tổn thương chủ yếu là diencephalon và basal ganglia, nơi virut herpes gây viêm não thường gây biến đổi ở vùng sừng trước. 6.2.4 Chẩn đoán căn nguyên [8, 166, 167] Dựa vào phân lập virut, phát hiện kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu trong máu, trong dịch não tủy. Chẩn đoán phòng thí nghiệm xác định VNNB theo một trong ba yêu cầu sau: - Hiệu giá kháng thể lấy máu lần 2 tăng hơn máu lần 1 gấp 4 lần, hoặc cao hơn, nếu là kỹ thuật HI hoặc ELISA-IgG (hiệu giá kháng thể HT2 ≥ 4 lần so với HT1). - Phân lập và định loại virut hoặc xét nghiệm trình tự hệ gen trong dịch nuôi cấy virut, máu, dịch não tủy hoặc các dịch khác của cơ thể; - Phát hiện kháng thể IgM trong máu, dịch não tủy bằng thử nghiệm miễn dịch enzym (ELISA). Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh và rất đặc hiệu, với độ pha loãng của huyết thanh là 1/100 cho kết quả OD mẫu thử/OD HT (-) ≥ 2 là dương tính. Thời gian thực hiện chỉ sau 4 giờ là đã có kết quả. 6.2.4.1 Phân lập virut trên não chuột Cho đến nay việc phân lập virut VNNB cũng như các virut Arbo hiệu quả nhất là tiêm vào não chuột nhắt trắng 1-3 ngày tuổi 0,01-0,02ml/con và thường kết hợp với 1 liều tiêm dưới da hoặc tiêm phúc mạc 0,03-0,05ml/com. Chuột sơ sinh được coi là vật chủ nhạy cảm nhất. Chuột đất vàng sơ sinh cũng có thể sử dụng nhưng không cho kết quả tốt hơn. Điểm tiêm là vùng đồi thị của não, giữa tai và mắt. Sau khi tiêm chuột vẫn bú mẹ, vì vậy chú ý mỗi ổ chuột không quá 6-8 con để chuột mẹ chăm sóc tốt hơn. Chuột bị chết trước 24 giờ đều loại bỏ do đó trong 24 giờ đầu phải thăm chuột 2 lần để loại bỏ chuột chết do tiêm hoặc do các nguyên nhân khác. Quan sát các biểu hiện lâm sàng ở chuột ốm, bỏ bú, dạ dày không có sữa, chuột mất màu hồng, tím tái, chậm chạp, nằm liệt nhưng khó quan sát thấy liệt. Thu thập chuột ốm, xử lý chuột bằng dung dịch khử trùng và mổ lấy não vô trùng. Sau đó nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8 có chứa BSA (albumin bò). Ly tâm lạnh 2000v/p trong 20 phút. Lấy nước nổi bảo quản ở -80oC hoặc Nitơ lỏng. Một phần thử nghiệm ngưng kết hồng cầu ngỗng. Cũng có thể phải tiêm truyền 3 lần, chuột không ốm mới loại bỏ. 6.2.4.2 Phân lập virut trên tế bào [44, 69] 14
  16. Sau khi tiêm não chuột ổ (+). Não chuột nhiễm được nghiền đồng nhất 10-20% trong PBS pH8. Ly tâm loại tủa, lọc vô trùng (millipore Millex). Huyền dịch virut sau lọc được cấy vào tế bào C6/36 (nhạy nhất) hoặc Vero... Theo dõi sử hủy hoại của tế bào, trong 14 ngày nếu có CPE sớm hơn thì gặt và cấy truyền tiếp để nâng hiệu giá. Bệnh nhân Tử thi - Máu, huyết thanh, plasma - Não: Sinh thiết vùng chất xám. Mẫu bệnh phẩm để (khởi bệnh 1-4 ngày) - Lách, phổi, gan và các cơ quan tiêm truyền - Dịch não tủy khác - Tách chắt huyết thanh, bỏ - Nghiền đồng nhất 10-20% máu đông. trong PBS pH8, có chất bền Xử lý - Pha loãng 1/10 hoặc không vững và kháng sinh. Ly tâm pha loãng 1000v/p, trong 20 phút. - Lấy nước nổi pha 10-1-10-2 - Chuột nhắt 1-3 ngày tuổi: tiêm não 0,01-0,02ml - Chuột hamster sơ sinh: tiêm não 0,01-0,02ml Tiêm truyền - Nuôi cấy tế bào C6/36, BHK21, Vero... CPE hoặc plaques - Tiêm vào ngực của muỗi Culex Chuột ốm hoặc Tế bào: CPE, Phôi gà Muỗi, FA, CF Quan sát chết PFU, FA (không đặc hiệu) - Huyền dịch não - Dich nổi tế bào, Tiếp tục tiêm 10% (±) tiếp tục cấy truyền trên chuột, truyền: CPE. trên tế bào hoặc - Tiêm truyền Tiêm truyền tiếp trên muỗi não chuột (+) - Chuẩn độ PFU bằng phương pháp phủ thạch Xác định động Tế bào muỗi Phương pháp khó vật hoặc tế bào Chuột ổ C6/36, BHK21, thực hiện (cần thích hợp Vero phải điêu luyện) (+) (-) (+) (-) Hủy Hủy Hình 5: Sơ đồ phân lập virut viêm não Nhật Bản [150] 6.2.5 Định loại virut VNNB [43] 15
  17. Sau khi tiêm truyền nhiều lần (theo sơ đồ phân lập) cho đến khi đạt hiệu giá ≥ 10-5 (LD50) và hình ảnh thương tổn tế bào CPE điển hình. Sau đó kiểm tra vô khuẩn và bảo quản ở dạng pha loãng 20% có chất bền vững và chất bảo quản virut. Định loại Nếu nghi ngờ mẫu phân lập có ít virut, Nếu việc định loại không nghi ngờ chuẩn bị kháng huyết thanh hoặc kháng thể đơn dòng, để thử nghiệm tiếp Pha dung dịch borate pH9 cho phản ứng CF và HI Lọc, tinh khiết, soi HVĐT - Thử nghiệm HA - Thử nghiệm CF và HI với kháng huyết thanh chuẩn Định loại bằng kỹ thuật trung hòa Tách chiết thành phần HA bằng (NT) hoặc CF, HI, ELISA sucrose aceton và siêu âm. Nếu virut có phản ứng chéo phải Lấy kháng nguyên HA thử nghiệm chuẩn bị kháng thể đơn dòng để với KHT mẫu chuẩn loại trừ. Thử nghiệm khuếch đại gen bằng Nếu nghi ngờ virut Arbo mới cần kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc mở rộng định loại, phối hợp với hiệu. các phòng Thí nghiệm chuẩn thức quốc tế để thực hiện định loại bằng kỹ thuật PCR và phân tích trình tự gen (sequencing). Nếu không tìm thấy virut nhưng nghi ngờ thì phải phân lập lại từ đầu Hình 6: Sơ đồ định loại virut [150] 6.2.5.1 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học - Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI): Đặc hiệu là ngưng kết hồng cầu Ngỗng, kỹ thuật này đã ứng dụng cách đây 50 năm và ngày nay vẫn được sử dụng ở nhiều phòng thí 16
  18. nghiệm vì kỹ thuật đơn giản và không cần thiết bị [38]. Do đó, giá thành để xét nghiệm rẻ hơn so với các kỹ thuật khác. - Kết hợp bổ thể (CF): Hầu như ít phòng thí nghiệm còn sử dụng vì phức tạp và độ tin cậy thấp. - Hấp phụ liên kết enzym (ELISA): gồm có GAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgG và MAC-ELISA để phát hiện IgM. Là các kỹ thuật đang sử dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới [22, 43]. - Miễn dịch huỳnh quang (IF)[143]: với kháng nguyên chuẩn: Yêu cầu trước tiên kính hiển vi huỳnh quang, đây là một loại thiết bị đắt tiền và các sinh phẩm chuẩn thức quốc tế, do đó các tuyến dưới khó có thể áp dụng nếu không có kinh phí và không được đào tạo. - Miễn dịch phóng xạ (RIA): để phục vụ nghiên cứu ở các Viện. Ở Bệnh viện lớn kỹ thuật này ít có giá trị trong chẩn đoán nên áp dụng hạn chế 6.2.5.2 Các phương pháp phát hiện virut: Để phục vụ nghiên cứu là chủ yếu - Nhuộm âm bản soi hiển vi điện tử (cần phải có mẫu virut tinh khiết). - Miễn dịch HVĐT (miễn dịch gắn vàng): là kỹ thuật rất đặc hiệu và chỉ những nước phát triển và các phòng thí nghiệm chuẩn thức mới thực hiện vì rất tốn kém. Phòng thí nghiệm Hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã ứng dụng kỹ thuật này nhưng để nghiên cứu về virut VNNB thì các phương pháp trên đã đủ để xác định, chưa phải dùng kỹ thuật này trừ khi là một virut mới gây viêm não. - Miễn dịch điện di đối lưu, khuếch tán. - Miễn dịch huỳnh quang: dễ dàng phát hiện virut khi có kháng thể đơn dòng. - Sinh học phân tử: Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho kết quả chính xác, có thể phát hiện một lượng virut rất nhỏ (100 hạt virut/ml bệnh phẩm). Ngày nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nhanh virut, chỉ cần mồi đặc hiệu [37, 93, 107]. Tuy nhiên, các thiết bị cho kỹ thuật này thường tốn kém, sinh phẩm đắt tiền cho nên không thể phổ biến cho tuyến cơ sở. 7. Đặc điểm lâm sàng Các triệu chứng của hội chứng não cấp do virut về lâm sàng không thể nào nhận biết được. Thời gian ủ bệnh VNNB từ 4-14 ngày, khởi bệnh thường đột ngột sốt, đau người, mệt mỏi, đau đầu, đặc biệt viêm não ở người lớn. Ở trẻ em đau dạ dày, ruột và có thể rối 17
  19. loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật. Thể nặng dẫn đến hôn mê nhanh chóng và có thể không hồi phục. Một số trường hợp tiến triển viêm não, màng não rất nhanh chỉ trong phút chốc. Trong 50.000 ca được báo cáo mỗi năm thì 10.000 ca tử vong. Số còn sống sót đều để lại di chứng thần kinh và tinh thần cần tiếp tục điều trị và chăm sóc. Hầu hết di chứng để lại ở trẻ 38oC, co giật liên tiếp hoặc liệt vận động, ngủ gà hoặc hôn mê. - Xét nghiệm lâm sàng 18
  20. + Dịch não tủy: Tế bào 10-100 bạch cầu/ml, chủ yếu là lympho bào; protein 0,5- 1g/l ; glucoza và clo bình thương + Công thức máu: bạch cầu tăng cao, chủ yếu là bạch cầu trung tính. - Xét nghiệm huyết thanh + ELISA phát hiện kháng thể IgM (+), kháng nguyên đặc hiệu là Nakayama hoặc Beijing-1 + HI và ELISA phát hiện kháng thể IgG. Nếu lấy máu 2 lần cách nhau 1-2 tuần thì hiệu giá kháng thể máu 2 tăng gấp 4 lần so với máu 1. Nếu lấy máu đơn với HI phải đạt ≥ 1/640 và ELISA là ≥ 1/1600. - Xét nghiệm bệnh nhân đã tử vong + Phân lập và định loại virut VNNB: sinh thiết não vùng đồi thị và chất xám (phương pháp phân lập chuột ổ, trên tế bào C6/36). + Giải phẫu bệnh vi thể: hình ảnh tổn thương thường gặp nhất là viêm quanh mạch, các đám tế bào hoại tử rải rác chiếm ưu thế trong chất xám. 8. Dịch tễ học bệnh VNNB 19
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2