Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST

Báo xấu

118
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngành công nghiệp sản xuất vaccine cho người không chỉ giúp đảm bảo sức khỏe, an ninh y tế của cộng đồng, mà còn trực tiếp đem lại giá trị kinh tế, do hằng năm số lượng sản phẩm mà cộng đồng có nhu cầu tiêu thụ, sử dụng là rất lớn

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bước đầu nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin tại Việt Nam qui mô phòng thí nghiệm

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ - Bé Y tÕ Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¨cxin sabin ================================================= §Ò tµi ®éc lËp cÊp nhµ n−íc B−íc ®Çu nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¨cxin sëi t¹i viÖt nam qui m« phßng thÝ nghiÖm 5836 20/7/2006 Hµ néi – 2002
§Ò tµi ®éc lËp cÊp Nhµ N−íc B−íc ®Çu nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¨cxin sëi t¹i viÖt nam qui m« phßng thÝ nghiÖm Chñ nhiÖm ®Ò tµi: GS.TSKH. NguyÔn V¨n MÉn Phã chñ nhiÖm ®Ò tµi: GS.TS. Huúnh Ph−¬ng Liªn Cè vÊn khoa häc: GS.TSKH. Hoµng Thuû Nguyªn GS.TS KH. §Æng §øc Tr¹ch C¸n bé tham gia: TS. NguyÔn §¨ng HiÒn TS. NguyÔn ThÞ Quú ThS. Cao Xu©n ThÞnh BS. NguyÔn Anh Thu ThS. Hoµng Thanh H−¬ng CN. TrÇn v¨n Dô CN. §Æng Mai Dung CN. NguyÔn Thanh Thuû BS. §oµn V¨n L−u BS. NguyÔn ThÞ Th−êng BS. NguyÔn ThÞ Th¾ng C¸c c¬ quan tham gia: ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng 2
Ch÷ viÕt t¾t ADN Deoxyribonucleic Acid (Axit deoxyribonucleic) ARN Ribonucleic Acid (Axit ribonucleic) Bé KHCN&MT Bé Khoa häc C«ng nghÖ vµ M«i tr−êng BTP B¸n thµnh phÈm CCID50 Cell Culture Infective Dose 50% (LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo nu«i cÊy) CEC Chicken Embryonate Cell (TÕ bµo ph«i gµ) CGI Cell Growth Index (ChØ sè ph¸t triÓn tÕ bµo) CMF Hanks Ca and Mg Free Hanks (Hanks kh«ng cã ion Ca vµ Mg) CPE Cytopathic Effects (T¸c dông huû ho¹i tÕ bµo) FBS Fetal Bovine Serum HA Hemagglutinin HAM Human Amniotic Membrane (TÕ bµo mµng èi ng−êi) HK Human Kidney Cell (TÕ bµo thËn ng−êi) KB Human rhinopharyngeal cancer epithelial cells (TÕ bµo ung th− biÓu m« mòi hÇu ng−êi) KHT Kh¸ng huyÕt thanh KN Kh¸ng nguyªn MMR V¨cxin phèi hîp Sëi, Quai bÞ, Rubella MT M«i tr−êng 3
PCR Polymerase Chain Reaction (Ph¶n øng chuçi polymeraza) SCD Soybean Casein Digest SPF Specific Pathogen Free (Kh«ng cã t¸c nh©n g©y bÖnh ®Æc hiÖu) SSPE Héi chøng viªm n·o s¬ cøng b¸n cÊp TB TÕ bµo TCMR Tiªm chñng më réng TCYTTG Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi WHO World Health Organization (Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi) 4
môc lôc Trang Ch−¬ng 1: Më ®Çu 1.1. §Æt vÊn ®Ò ..............................................................................................1 1.2. Môc tiªu cña ®Ò tµi ................................................................................2 1.3. Néi dung nghiªn cøu .............................................................................2 1.3.1. S¶n xuÊt v¾cxin sëi qui m« phßng thÝ nghiÖm...............................2 1.3.2. §¸nh gi¸ chÊt l−îng v¾cxin...........................................................2 Ch−¬ng 2: Tæng quan tµi liÖu 2.1. Virót häc ................................................................................................3 2.2. L©m sµng bÖnh sëi..................................................................................5 2.2.1. §Æc ®iÓm cña ban sëi.........................................................................5 2.2.2. TiÕn triÓn ®iÓn h×nh cña bÖnh sëi ......................................................5 2.2.3. TriÖu chøng xuÊt tiÕt cña bÖnh sëi.....................................................6 2.3. Qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót sëi.......................................................... 6 2.4. §¸p øng miÔn dÞch................................................................................ 7 2.5. Sinh bÖnh häc......................................................................................... 8 2.6. DÞch tÔ häc bÖnh sëi............................................................................... 9 2.6.1. §Æc ®iÓm dÞch tÔ cña bÖnh sëi.......................................................... 9 2.6.2. T×nh h×nh m¾c bÖnh sëi ë ViÖt Nam................................................ 11 2.7. V¾cxin sëi............................................................................................. 12 2.7.1. LÞch sö cña v¾cxin sëi................................................................... 12 2.7.2. T×nh h×nh s¶n xuÊt v¾c xin sëi trªn thÕ giíi ..................................12 2.8. Sö dông v¾cxin sëi ..............................................................................14 Ch−¬ng 3: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 3.1. Qui tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin sëi .............................................................16 5
3.2. VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt .....................................................16 3.2.1. Chñng virót Hu-191 .......................................................................16 3.2.2. Trøng gµ SPF .................................................................................17 3.2.3. Trang thiÕt bÞ vµ dông cô cÇn thiÕt ................................................18 3.2.4. C¸c lo¹i m«i tr−êng cÇn thiÕt ........................................................18 3.2.5. Ph−¬ng ph¸p thùc nghiÖm .............................................................20 3.3. Ph−¬ng ph¸p kiÓm tra chÊt l−îng v¾cxin sëi ...................................24 3.3.1. KiÓm tra v« trïng ..........................................................................25 3.3.2. Thö nghiÖm nhËn d¹ng virót sëi ....................................................25 3.3.3. Thö nghiÖm chuÈn ®é hiÖu gi¸ ......................................................26 3.3.4. Thö nghiÖm an toµn chung cho v¾cxin thµnh phÈm trªn sóc vËt ...27 3.3.5. Thö nghiÖm an toµn trªn sóc vËt cho mÎ gÆt ®¬n sau läc ..............28 3.3.6. Thö nghiÖm quan s¸t tÕ bµo chøng ................................................28 3.3.7. Thö nghiÖm hÊp phô hång cÇu .......................................................29 3.3.8. Thö nghiÖm t×m virót ngo¹i lai cña mÎ gÆt trªn nu«i cÊy tÕ bµo ... 29 3.3.9. Thö nghiÖm t×m virót ngo¹i lai cña n−íc næi trªn nu«i cÊy tÕ bµo.30 3.3.10. Thö nghiÖm x¸c ®Þnh hµm l−îng Albumin bß tån d− ....................31 3.3.11. Thö nghiÖm ph¸t hiÖn Mycoplasma ...............................................31 Ch−¬ng 4: KÕt qu¶ vµ bµn luËn 4.1. KÕt qu¶ s¶n xuÊt ..................................................................................33 4.1.1. KÕt qu¶ qu¸ tr×nh Êp trøng gµ ........................................................33 4.1.2. KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh t¸ch vµ nu«i cÊy tÕ bµo ...............................34 4.1.3. KÕt qu¶ quan s¸t tÕ bµo..................................................................35 4.1.4. KÕt qu¶ ®Õm tÕ bµo .......................................................................36 4.1.5. KÕt qu¶ sö dông tÕ bµo ..................................................................37 4.1.6. KÕt qu¶ t×m hiÓu yÕu tè ¶nh h−ëng tíi g©y nhiÔm virót ...............37 4.1.7. V¾cxin b¸n thµnh phÈm ................................................................39 4.1.8. KÕt qu¶ s¶n xuÊt v¾cxin thµnh phÈm ............................................41 4.2. KÕt qu¶ kiÓm tra chÊt l−îng ...............................................................42 4.2.1. KÕt qu¶ kiÓm tra nu«i cÊy tÕ bµo ..................................................42 4.2.2. KÕt qu¶ kiÓm tra mÎ gÆt ®¬n tr−íc läc .........................................44 6
4.2.3. KiÓm tra v¾cxin b¸n thµnh phÈm ..................................................46 4.2.4. KiÓm tra v¾cxin thµnh phÈm..........................................................49 Ch−¬ng 5: KÕt luËn 7
Ch−¬ng 1: Më ®Çu 1.1 §Æt vÊn ®Ò BÖnh sëi lµ mét bÖnh truyÒn nhiÔm cÊp tÝnh l©y qua ®−êng h« hÊp, tèc ®é lan truyÒn nhanh vµ dÔ g©y dÞch, th−êng 100% ng−êi bÞ nhiÔm virót sÏ ph¸t bÖnh nÕu nh− ch−a cã miÔn dÞch víi sëi. ThÓ nhÑ lµ sèt, ph¸t ban sau kho¶ng 1 tuÇn ban hÕt, trÎ cã thÓ håi phôc hoµn toµn. BÖnh cã thÓ trë thµnh ¸c tÝnh. BÖnh tiÕn triÓn nhanh vµ g©y tö vong do suy h« hÊp, viªm c¬ tim cÊp, gi¶m tiÓu cÇu g©y xuÊt huyÕt néi t¹ng.... Do ®iÒu kiÖn kinh tÕ x· héi cña n−íc ta cßn khã kh¨n, c¸c ph−¬ng tiÖn vµ thuèc men ®iÒu trÞ cßn h¹n chÕ ®Æc biÖt lµ c¸c vïng s©u vïng xa do ®ã tû lÖ tö vong do sëi cßn cao vµ tû lÖ biÕn chøng do sëi lín. Nh÷ng biÕn chøng do sëi nh− Øa ch¶y, viªm phæi, viªm tai gi÷a, cam tÈu m·, nÆng h¬n cã thÓ viªm n·o cÊp, viªm n·o x¬ cøng lan to¶ g©y tö vong vµ ®Ó l¹i c¸c di chøng vÒ thÇn kinh. Theo sè liÖu cña ch−¬ng tr×nh Tiªm chñng më réng n¨m 1999 tû lÖ m¾c bÖnh sëi trong c¶ n−íc ë møc 18,84/100.000 d©n. ë vïng nói phÝa b¾c, miÒn Trung, T©y Nguyªn tû lÖ nµy cßn cao h¬n, cã n¬i tõ 50-409/100.000 d©n. BÖnh sëi lµ mét trong 10 bÖnh truyÒn nhiÔm cã tû lÖ tö vong cao ë n−íc ta. BÖnh sëi phßng ngõa ®−îc b»ng v¨cxin. HiÖu lùc b¶o vÖ cña v¨cxin sëi ®¹t trªn 90%. NhiÒu n−íc trªn thÕ giíi ®· khèng chÕ ®−îc bÖnh sëi nhê sö dông v¨cxin. ë ViÖt Nam nhê thùc hiÖn tiªm phßng sëi cho trÎ d−íi mét tuæi mµ tû lÖ m¾c ®· gi¶m ®i râ rÖt tõ 30,9 tr−êng hîp/100.000 d©n n¨m 1987 xuèng cßn 18,84/100.000 d©n n¨m 1999. V¨cxin sëi bÊt ho¹t, kÓ tõ khi ra ®êi nh÷ng n¨m ®Çu thËp kû 60 ®· nhanh chãng bÞ lo¹i bá v× kh¶ n¨ng b¶o vÖ kÐm. HiÖn nay tÊt c¶ c¸c nhµ s¶n xuÊt trªn thÕ giíi ®Òu s¶n xuÊt v¨cxin sëi sèng gi¶m ®éc lùc. Cã nhiÒu chñng virut næi tiÕng ®−îc sö dông hiÖn nay nh− AIK-C, CAM, Schwarz, TD97 ®−îc sö dông ë Mü, NhËt, Ph¸p, BØ; chñng L-16 ®−îc sö dông ë Nga, §øc; chñng Hu191 ®−îc sö dông ë Trung Quèc... TÊt c¶ c¸c chñng nµy ®Òu cã ®é an toµn cao vµ kh¶ n¨ng b¶o vÖ tèt. 8
ViÖt Nam ®· s¶n xuÊt ®−îc nhiÒu lo¹i v¨cxin phôc vô cho c«ng t¸c phßng bÖnh. Trong 10 lo¹i v¾cxin thiÕt yÕu ®−îc dïng trong ch−¬ng tr×nh TCMR hiÖn nay chóng ta ®· tù s¶n xuÊt ®−îc 9 trõ v¾cxin sëi. Nhu cÇu vÒ v¨cxin sëi ë n−íc ta rÊt cao, ®Æc biÖt khi thùc hiÖn ch−¬ng tr×nh khèng chÕ bÖnh sëi. Theo khuyÕn c¸o cña TCYTTG, mçi trÎ cÇn ®−îc tiªm 2 mòi v¨cxin sëi thay cho 1 mòi tr−íc ®©y. Nh− vËy nhu cÇu vÒ v¾cxin sëi sÏ lªn tíi 6 - 7 triÖu liÒu mét n¨m. §Ó ®¸p øng ®−îc nhu cÇu nµy chóng ta sÏ ph¶i hoµn toµn nhËp ngo¹i. Nh− vËy lµ sÏ tèn kÐm vµ thô ®éng. ChÝnh v× vËy mµ Bé KH CN&MT vµ Bé Y tÕ ®· giao cho chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi nµy víi néi dung "B−íc ®Çu nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin sëi t¹i ViÖt Nam qui m« phßng thÝ nghiÖm" ®Ó dÇn tõng b−íc chóng ta sÏ s¶n xuÊt ®−îc v¾cxin vµ cung cÊp ®ñ cho nhu cÇu trong n−íc. 1.2. Môc tiªu cña ®Ò tµi 1.2.1. X©y dùng qui tr×nh vµ s¶n xuÊt ra v¾cxin sëi qui m« phßng thÝ nghiÖm 1.2.2. Thö nghiÖm, ®¸nh gi¸ chÊt l−îng v¾cxin sëi ë møc ®é phßng thÝ nghiÖm. 1.3. Néi dung nghiªn cøu 1.3.1. S¶n xuÊt v¾cxin sëi qui m« phßng thÝ nghiÖm - Nu«i cÊy tÕ bµo ph«i gµ mét líp - TiÕn hµnh g©y nhiÔm virót : X¸c ®Þnh nång ®é g©y nhiÔm, qui tr×nh g©y nhiÔm, thêi ®iÓm thÝch hîp ®Ó thu ho¹ch v¾cxin cho cã hiÖu qu¶ cao - §«ng kh« v¾cxin 1.3.2. §¸nh gi¸ chÊt l−îng v¾cxin - KiÓm tra t¸c nh©n ngo¹i lai cã trong tÕ bµo - KiÓm ®Þnh mÎ gÆt ®¬n - KiÓm ®Þnh v¾cxin b¸n thµnh phÈm tr−íc läc - KiÓm ®Þnh v¾cxin b¸n thµnh phÈm cuèi cïng - KiÓm ®Þnh v¾cxin thµnh phÈm. 9
Ch−¬ng 2: Tæng quan tµi liÖu 2.1. Virót häc Virót sëi thuéc gièng Morbillivirus hä Paramyxoviridae ph©n hä Pneumovirinae. VËt liÖu di truyÒn lµ ARN mét sîi ©m. Virót cã h×nh cÇu kh«ng ®ång nhÊt víi kÝch th−íc tõ 150-200nm. Vá virót bao gåm 2 líp Lipit. Trªn bÒ mÆt cã 2 glycoprotein H vµ F chóng t¹o nªn nh÷ng gai nh« lªn trªn bÒ mÆt virót. Protein H (hemagglutinin) cã chøc n¨ng hÊp phô hång cÇu vµ b¸m dÝnh lªn bÒ mÆt tÕ bµo trong khi ®ã protein F (fusion) t¹o ra c¸c cÇu nèi liªn kÕt c¸c tÕ bµo víi nhau. Protein M (matrix) t¹o nªn mét líp nÒn ë bªn trong vá. Protein NP t¹o nªn c¸c nucleocapsit bao quanh ARN h×nh xo¾n èc. Protein P (photphorynate) vµ L (large) còng ®−îc chøa trong nucleocapsit vµ liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh sao chÐp cña ARN. NP H &F M ARN L P Líp Lipit kÐp H×nh 2-1: S¬ ®å cÊu t¹o cña h¹t virót sëi H: Hemagglutinin protein ; F: Fusion protein; M: Matrix protein; L: Large protein: NP: Nucleoprotein, P: Photphorynate protein 10
3' N P M F H L 5' 1688 1657 1473 2377 1949 6639 2 4 6 8 10 12 14 Kilobaz¬ H×nh 2-2: S¬ ®å gen cña virót sëi (theo D.W.Kingsbury, "Field Virology", 2nd Ed.,p.948. Raven, New York, 1990) B¶ng 2-1: S¶n phÈm vµ chøc n¨ng cña gen Gen Sè l−îng §Æc tÝnh cña protein (tÝnh nucleotit Träng l−îng pt tõ cña Axit Kh«ng VÞ trÝ trong C¸c tÝnh chÊt ®Çu ARNtt trõ amin ho¹t SDS- h¹t virót Chøc n¨ng kh¸c 3') poly A ®éng PAGE N 1688 523 58111 60000 Nucleo- Protein cÊu photpho c¸psit tróc cña protein, n»m nucleo-capsit s©u trong ARN, chiÕm 25% tæng sè Pr cña h¹t virót P 1657 507 53900 68000 Nucleo- Thµnh phÇn Photpho c¸psit cÊu tróc cña protein, cã tÝnh phøc hîp men axit, chiÕm polymeraza 10% tæng sè Pr cña h¹t virót M 1473 335 37714 39000 Trong vá Liªn kÕt gi÷a cã tÝnh baz¬, vá vµ kh«ng −a n−íc, nucleocapsit chiÕm 25% tæng sè protein 11
cña h¹t virót F 2377 550 59510 62000 trªn bÒ mÆt liªn kÕt gi÷a chiÕm 15% cña vá vá virót víi tæng protein mµng tÕ bµo cña virót H 1949 617 69250 78000 trªn bÒ mÆt vïi trong thô chiÕm 25% cña vá thÓ cña tÕ bµo protein virót virót chñ L 6639 2183 247611 >200000 nucleocaps men 2% tæng it polymeraza protein virót 2.2. L©m sµng bÖnh sëi 2.2.1. §Æc ®iÓm cña ban sëi - Ban xuÊt hiÖn tuÇn tù tõ sau tai lan ra ®Çu mÆt cæ sau ®ã lan xuèng th©n m×nh vµ tø chi. - Ban mµu ®á, mét sè cã thÓ kÕt hîp l¹i xen kÏ víi nh÷ng nèt ban lµ c¸c kho¶ng da khoÎ m¹nh. - Ban mÊt ®i còng tuÇn tù theo nh− lóc xuÊt hiÖn. - Sau khi ban lÆn xuÊt hiÖn c¸c nèt th©m thÉm mÇu trªn da t¹o nªn h×nh v»n da hæ. 2.2.2. TiÕn triÓn ®iÓn h×nh cña bÖnh sëi Ngµy cña bÖnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 40 NhiÖt ®é c¬ thÓ 39 38 (oC) 37 36 Giai ®o¹n tiÒn Giai ®o¹n ngo¹i ban Giai ®o¹n lui bÖnh triÖu (xuÊt tiÕt) H¹t Koplik Ph¸t ban §Ó l¹i vÕt th©m Viªm kÕt m¹c Ch¶y n−íc mòi Ho H×nh 2-3: TiÕn triÓn cña bÖnh sëi 12
2.2.3. TriÖu chøng xuÊt tiÕt cña bÖnh sëi M¾t Viªm kÕt m¹c Ch¶y n−íc m¾t Mòi Ch¶y n−íc mòi NghÑt mòi Khoang miÖng H¹t Koplik Viªm hÇu häng HÇu häng Viªm thanh qu¶n Ho §−êng h« hÊp Viªm phÕ qu¶n Ho §−êng tiªu ho¸ XuÊt tiÕt ®−êng ruét Øa ch¶y 2.3 Qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót sëi Nh×n chung, qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót sëi ®−îc tãm t¾t nh− sau : Virót hÊp phô lªn Receptor cña tÕ bµo vËt chñ, x©m nhËp vµo bªn trong tÕ bµo, cëi vá → Tæng hîp c¸c thµnh phÇn cña virót (gen vµ protein) → L¾p gi¸p c¸c thµnh phÇn ®· tæng hîp ®−îc → Gi¶i phãng h¹t virót ra khái tÕ bµo. Sù lan truyÒn virót tõ tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c theo 2 c¸ch: 1) virót ®−îc gi¶i phãng ra tõ tÕ bµo bÞ nhiÔm ®−îc truyÒn trùc tiÕp ®Õn tÕ bµo lµnh vµ 2) virót ®−îc truyÒn tõ tÕ bµo nµy sang tÕ bµo kh¸c nhê vµo sù liªn kÕt cña tÕ bµo. Khi virót gi¶i phãng ra khái tÕ bµo theo c¸ch 1) th× protein mµng (M) sÏ cã ¸i lùc víi vá vµ nucleocapsit ®Ó h×nh thµnh nªn h¹t virót. Cßn theo c¸ch thø 2) khi c¸c tÕ bµo ®· liªn kÕt víi nhau th× virót kh«ng cÇn ph¶i gi¶i phãng ra ngoµi. C¸c lo¹i tÕ bµo nh¹y c¶m víi virót sëi nh− tÕ bµo thËn khØ, thËn ng−êi, thËn chuét lang, thËn cõu, tÕ bµo ph«i gµ tiªn ph¸t, c¸c lo¹i tÕ bµo th−êng trùc nh− : Vero, KB (tÕ bµo ung th− biÓu m« hÇu häng) vµ Hela. TÕ bµo B95a ®−îc chuyÓn thÓ bëi virót Epstein-Barr tõ nguyªn bµo lympho cña khØ ®u«i sãc gÇn ®©y ®−îc xem lµ nh¹y c¶m nhÊt víi virót sëi. Tû lÖ nh©n lªn cña virót sëi lµ thÊp. Chóng b¾t ®Çu nh©n lªn trong tÕ bµo c¶ Vero vµ KB 20 giê sau khi th©m nhiÔm vµ chóng ®¹t ®Ønh cao vµo ngµy thø 4-6. Sau ®ã tÕ bµo gi÷ ®−îc tèc ®é s¶n sinh virót. Sè l−îng virót t¹o ra trªn tÕ bµo KB vÉn gi÷ ë tû lÖ cao cho ®Õn ngµy thø 12. Trong thêi gian ®ã tÕ bµo chñ dÇn dÇn tho¸i ho¸. Sè l−îng virót gi¶i phãng ra 13
ngoµi chØ b»ng 1/10 ®Õn 1/100 sè l−îng virót tæng hîp ®−îc vµ chóng ®−îc xem lµ hÇu hÕt virót tæng hîp ®−îc ®Òu dÝnh chÆt vµo tÕ bµo chñ. HiÖu gi¸ HA b¾t ®Çu t¨ng 4 ngµy sau khi th©m nhiÔm. §iÒu ®ã chøng tá r»ng sè l−îng h¹t virót lµm t¨ng hiÖu gi¸ HA. §èi víi tÕ bµo Vero hiÖu gi¸ HA vµ sù th©m nhiÔm gi¶m kÓ tõ ngµy thø 12. TÕ bµo khæng lå ®−îc h×nh thµnh ®èi víi tÕ bµo Vero lín h¬n rÊt nhiÒu so víi tÕ bµo KB. Cuèi cïng tÕ bµo khæng lå bÞ dung gi¶i liªn quan ®Õn c¸c b−íc cña qu¸ tr×nh nh©n lªn cña virót. Mét lý do mµ virót sëi nh©n lªn trong tÕ bµo KB l©u h¬n cã thÓ lµ do chóng Ýt t¹o thµnh tÕ bµo khæng lå. MÆt kh¸c virót rÊt dÔ bÞ bÊt ho¹t bëi nhiÖt vµ tia cùc tÝm. HiÖu gi¸ th©m nhiÔm gi¶m 1/2 khi hçn dÞch virót ®−îc gi÷ ë 4oC trong 12 giê. Chóng chØ cßn 1/10 khi gi÷ ë 33oC trong 15 giê vµ 37oC trong 5 giê, vµ chØ cßn 1/100 khi ë 37oC trong 15 giê. Nh÷ng kÕt qu¶ trªn cho thÊy virót sëi kh«ng ®−îc t¹o ra víi sè l−îng lín trong cïng mét lóc vµ nh÷ng h¹t virót míi t¹o ra rÊt dÔ bÞ bÊt ho¹t. Do ®ã sè l−îng virót ®−îc bµi tiÕt ra ë ®−êng h« hÊp trªn vµ trong n−íc bät lµ nh÷ng virót ®· th¾ng ®−îc nh÷ng yÕu tè bÊt lîi trªn chóng cã kh¶ n¨ng th©m nhiÔm rÊt m¹nh. §iÒu nµy gióp cho chóng ta ph¶i x¸c ®Þnh ®−îc thêi gian thu ho¹ch v¨cxin tèi −u vµ t×m ra ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n tèt trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt. 2.4. §¸p øng miÔn dÞch Kh¸ng thÓ xuÊt hiÖn ngay khi ban xuÊt hiÖn. XuÊt hiÖn sím nhÊt lµ IgM, tiÕp theo lµ IgG vµ IgA trong huyÕt thanh vµ trong dÞch tiÕt. C¶ IgM vµ IgG ®−îc s¶n sinh ra tr−íc tiªn nh−ng IgM ®¹t ®Ønh cao vµo ngµy thø 7 ®Õn ngµy thø 10 sau khi xuÊt hiÖn ban, sau ®ã gi¶m nhanh vµ kh«ng tån t¹i sau 4 tuÇn. Sù cã mÆt cña IgM chøng tá bÖnh nh©n bÞ nhiÔm sëi tiªn ph¸t hoÆc tiªm v¾cxin. Cßn IgG ®−îc tån t¹i l©u. CÊu tróc vá bao ngoµi cña h¹t virut cã c¸c hemaglutinin. Cã vai trß gióp virót b¸m vµo receptor cña tÕ bµo c¶m thô. Sau ®ã protein hoµ mµng x©m nhËp phøc hîp t¸i tæ hîp, thùc hiÖn sù nh©n lªn cña virót trong tÕ bµo c¶m thô. Sau khi virót ®−îc nh©n lªn, giai ®o¹n gi¶i phãng cña virót thùc hiÖn theo ph−¬ng thøc nÈy chåi. Virót sëi lµ 14
virót ®ång nhÊt, kh«ng cã sù biÕn dÞ mäi cÊu tróc cña virót, do vËy sau khi nhiÔm virót sëi, kh¸ng thÓ sëi sÏ duy tr× suèt ®êi. Virót sëi chØ g©y bÖnh cho ng−êi. Tuy nhiªn viÖc trung hoµ virut sëi trong phßng thÝ nghiÖm cã thÓ bÞ ¶nh h−ëng bëi kh¸ng thÓ kh¸ng HA. Do ®ã ®Ó ng¨n ngõa sù lan truyÒn virut trong céng ®ång cÇn cã c¶ kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn F. Kh¸ng thÓ ®¬n dßng kh¸ng kh¸ng nguyªn F lµ ®Æc hiÖu cho tõng chñng. Vai trß quan träng cña kh¸ng thÓ nµy ®−îc pháng ®o¸n tõ khi ng−êi ta nhËn ra r»ng v¨cxin sëi bÊt ho¹t kh«ng mang l¹i miÔn dÞch ®Çy ®ñ. V¨cxin nµy kh«ng t¹o ra ®−îc kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn F. Thµnh phÇn M cña virut sëi còng ®· ®−îc nghiªn cøu, ®Æc biÖt trong nh÷ng bÖnh nh©n bÞ bÖnh viªm n·o s¬ cøng b¸n cÊp (SSPE). Ng−êi ta nhËn thÊy r»ng nh÷ng bÖnh nh©n SSPE cã kh¸ng thÓ kh¸ng thµnh phÇn M rÊt thÊp. So s¸nh 9 chñng virut kh¸c nhau b»ng kh¸ng thÓ ®¬n dßng ®· ph¸t hiÖn ra r»ng protein M thay ®æi trong c¸c quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn. §¸nh gi¸ hiÖu qu¶ sau khi tiªm chñng b»ng x¸c ®Þnh kh¸ng thÓ trong m¸u vµ so s¸nh tr−íc khi tiªm v¾c xin víi sau khi tiªm v¾cxin Ýt nhÊt 4 tuÇn. Th−êng sö dông ph¶n øng øc chÕ ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI) ®Ó x¸c ®Þnh hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao ë giai ®o¹n ®Çu, nã vÉn tån t¹i kÐo dµi tõ 1 → 1,5 n¨m sau tiªm. Sau ®ã gi¶m dÇn tõ 1/2 → 1/3 trong vßng 5 n¨m. 2.5.Sinh bÖnh häc Con ng−êi bÞ nhiÔm bÖnh qua ®−êng h« hÊp. Virót x©m nhËp vµo hÖ thèng b¹ch huyÕt, cã thÓ ë thÓ tù do hoÆc liªn kÕt víi c¸c ®¹i thùc bµo, vµ ®i tíi c¸c h¹ch b¹ch huyÕt. T¹i ®©y virót nh©n lªn m¹nh mÏ nh−ng kh«ng g©y huû ho¹i nhiÒu tÕ bµo, vµ cã mét sè lan truyÒn sang c¸c h¹ch b¹ch huyÕt kh¸c, tíi l¸ch. Nh÷ng tÕ bµo ®¬n nh©n bÞ nhiÔm sÏ t¹o thµnh tÕ bµo ®a nh©n khæng lå, tÕ bµo lympho T nh¹y c¶m víi virót sëi khi chóng ®ang ho¹t ®éng. Kho¶ng 6 ngµy sau khi bÞ nhiÔm xuÊt hiÖn virót trong m¸u vµ c¸c h¹t virót lan truyÒn kh¾p c¬ thÓ. V× biÓu m« liªn kÕt chØ cã 1 hoÆc 2 líp tÕ bµo nªn chóng bÞ huû ho¹i tr−íc tiªn, chØ 9-10 ngµy sau khi bÞ nhiÔm. Sau ®ã c¸c triÖu chøng bÖnh cÊp tÝnh x¶y ra nh− ho, ch¶y n−íc mòi, phï nÒ m« liªn kÕt, sèt cao, xuÊt 15
hiÖn h¹t Koplik. C¸c triÖu chøng nµy gi¶m ®i khi ban xuÊt hiÖn. Còng trong giai ®o¹n nµy, trong m¸u ngo¹i vi xuÊt hiÖn kh¸ng thÓ kh¸ng virót sëi. 2.6. DÞch tÔ häc bÖnh sëi 2.6.1. §Æc ®iÓm dÞch tÔ cña bÖnh sëi Virót sëi cã kh¶ n¨ng l©y nhiÔm rÊt m¹nh so víi c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ®−îc biÕt cho ®Õn nay. BÖnh cã triÖu chøng l©m sµng ®iÓn h×nh. Khi ng−êi kh«ng cã kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i virót sëi bÞ nhiÔm virót sëi th× sÏ bÞ bÖnh, chØ mét sè rÊt Ýt kh«ng cã triÖu chøng. Tuy nhiªn, cã mét sè tr−êng hîp mµ trÎ bÞ ph¬i nhiÔm víi virót trong khi kh¸ng thÓ do mÑ truyÒn sang ®· gi¶m nh−ng vÉn kh«ng cã biÓu hiÖn l©m sµng. Sëi ®−îc biÕt ®Õn nh− lµ mét bÖnh cña trÎ nhá, tÊt c¶ mäi ng−êi nh¹y c¶m víi virót ®Òu cã thÓ bÞ nhiÔm bÊt kÓ løa tuæi nµo. Bëi v× chóng cã kh¶ n¨ng l©y nhiÔm m¹nh, nh÷ng ®øa trÎ trë nªn nh¹y c¶m víi virót sëi vµo lóc 6 th¸ng tuæi cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh ngay sau khi chóng bÞ tiÕp xóc víi virót. Do ®ã tuæi m¾c bÖnh chñ yÕu lµ trÎ nhá. Sau khi khái bÖnh ng−êi ta cã ®−îc miÔn dÞch cao chóng cã thÓ tån t¹i suèt cuéc ®êi. Do ®ã sëi cßn ®−îc gäi lµ bÖnh kh«ng ai m¾c lÇn thø 2. V× c¸c ®Æc tÝnh ®ã nªn dÞch sëi th−êng cã tÝnh chu kú. Nh÷ng ng−êi nh¹y c¶m lu«n lu«n ®−îc bæ sung b»ng nh÷ng ®øa trÎ míi sinh vµ nh÷ng ®øa trÎ di c− ®Õn vµ c¬ héi cña chóng khi tiÕp xóc víi ng−êi bÖnh. Khi c¸c yÕu tè nµy v−ît qu¸ mét ng−ìng nhÊt ®Þnh th× mét vô dÞch sÏ x¶y ra. Sau khi khái bÖnh nh÷ng ng−êi nµy ®−îc lo¹i khái nhãm cã nguy c¬. Do ®ã chØ cßn nh÷ng ng−êi cã nguy c¬ míi lµ vÊn ®Ò cÇn quan t©m. Chu kú cña dÞch sëi trong céng ®ång réng lín th−êng lµ 2 n¨m. Bartlett (1960) ®· ph¸t hiÖn ra mèi liªn hÖ gi÷a dÞch sëi vµ ®é lín cña céng ®ång t¹i Mü vµ Anh. ¤ng cho r»ng tõ 4000 - 5000 ca x¶y ra trong mét n¨m trong mét céng ®ång cã tõ 250 - 300 ngµn d©n míi cã thÓ lµm cho dÞch x¶y ra th−êng xuyªn, bëi v× virót kh«ng thÓ tån t¹i l©u trong mét céng ®ång nhá vµ nã kh«ng thÓ tån t¹i nÕu kh«ng cã nh÷ng ng−êi mang mÇm bÖnh tõ nh÷ng n¬i dÞch x¶y ra. Black (1966) ®· ph©n tÝch c¸c b¸o c¸o hµng th¸ng cña bÖnh sëi ë mét sè thµnh phè vµ ë 19 hßn ®¶o trong 15 n¨m. KÕt qu¶ cho thÊy 1) dÞch sëi ®«i khi kh«ng tån t¹i 16
ë mét hßn ®¶o víi d©n sè d−íi 500 ngµn ng−êi vµ 2) ®é dµi cña dÞch tû lÖ nghÞch víi mËt ®é d©n sè. Do ®ã «ng ®· kh¼ng ®Þnh r»ng víi mét céng ®ång kho¶ng 350 ngµn d©n víi mËt ®é d©n sè cao nh− c¸c thµnh phè lín lµ cÇn thiÕt cho bÖnh sëi l−u hµnh trong céng ®ång d©n c−. Cliff vµ Haggett (1984) ®· ph©n tÝch c¸c yÕu tè ®Þa lý dùa vµo kÕt qu¶ cña Blak vÒ dÞch tÔ häc bÖnh sëi vµ ®· chia céng ®ång ng−êi thµnh 3 nhãm. Mçi nhãm cã mét ®Æc ®iÓm vÒ dÞch sëi liªn quan ®Õn ®é lín cña céng ®ång. Nh÷ng céng ®ång d©n c− lín cã ®Æc ®iÓm dÞch sëi theo kiÓu I, trong ®ã dÞch x¶y ra liªn tôc vµ gi÷a c¸c vô dÞch lu«n cã c¸c bÖnh nh©n bÞ bÖnh. Nh÷ng céng ®ång võa cã kiÓu thø II. KiÓu nµy cho thÊy dÞch x¶y ra theo chu kú nh−ng kh«ng liªn tôc bëi v× d©n sè qu¸ Ýt ®Ó cã thÓ l−u gi÷ ®−îc virót sëi sau mçi vô dÞch. Virót biÕn mÊt trong giai ®o¹n gi÷a 2 vô dÞch vµ nguån l©y chñ yÕu lµ do nh÷ng bÖnh nh©n tõ céng ®ång lín mang tíi trong thêi gian ë ®ã x¶y ra dÞch. Trong céng ®ång d©n c− nhá dÞch x¶y ra theo kiÓu thø III. DÞch x¶y ra kh«ng liªn tôc vµ kh«ng theo mét qui t¾c nµo c¶. KiÓu I KiÓu II KiÓu III 17
2.6.2. T×nh h×nh m¾c bÖnh sëi ë ViÖt Nam BÖnh sëi ®· gi¶m ®¸ng kÓ kÓ tõ khi ch−¬ng tr×nh TCMR ®−îc thùc hiÖn ë n−íc ta. Tuy nhiªn, trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y c¸c vô dÞch sëi vÉn x¶y ra r¶i r¸c t¹i nhiÒu ®Þa ph−¬ng trong c¶ n−íc. BÖnh sëi x¶y ra quanh n¨m, xuÊt hiÖn nhiÒu trong mïa xu©n, thÊp nhÊt vµo mïa hÌ - thu. Trong n¨m 1999, c¶ n−íc cã 13.475 tr−êng hîp m¾c sëi, sè ca d−íi 5 tuæi chiÕm 18,93%. Sè chÕt do bÖnh sëi trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y dao déng thÊp trong kho¶ng 8 - 9 tr−êng hîp/n¨m. Theo sè liÖu cña ch−¬ng tr×nh TCMR phÝa B¾c cho thÊy 30,4% trÎ m¾c sëi d−íi 5 tuæi lµ do kh«ng ®−îc tiªm chñng hoÆc tiªm kh«ng ®óng lÞch. §ã còng chÝnh lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n lµm cho bÖnh sëi gia t¨ng trong nh÷ng n¨m qua. Do t¨ng c−êng c«ng t¸c tiªm chñng, tû lÖ tiªm phßng sëi ®−îc t¨ng lªn tõ 42% n¨m 1987 lªn 89% n¨m 1992 vµ duy tr× ë møc trªn 90% cho ®Õn n¨m 1999. §ång thêi víi sù t¨ng tû lÖ tiªm chñng, tû lÖ m¾c gi¶m ®i râ rÖt tõ 30,9 tr−êng hîp trªn 100.000 d©n n¨m 1987 gi¶m xuèng 18,84% n¨m 1999. §èi víi mét sè vïng nói phÝa B¾c, miÒn Trung vµ T©y nguyªn tû lÖ m¾c vÉn cao (tõ 50 tíi 409/100.000 d©n). Trong 5 th¸ng ®Çu n¨m 2000, trªn 14 tØnh, 34 huyÖn ë miÒn B¾c ®· cã 7172 tr−êng hîp nghi m¾c sëi, tû lÖ trÎ d−íi 5 tuæi chiÕm 18%, tõ 5 - 9 tuæi lµ 36%, 10-15 tuæi chiÕm 39% vµ trªn 15 tuæi chiÕm 39%. Qua theo dâi thÊy r»ng tuæi m¾c bÖnh ®· chuyÓn dÞch lªn løa tuæi cao h¬n, chñ yÕu nh÷ng trÎ ch−a tiªm chñng vµ nh÷ng trÎ míi tiªm mét mòi v¾cxin sëi. 2.7. V¾cxin Sëi 2.7.1. LÞch sö cña v¾cxin sëi. V¾c xin sëi chÕt ®· ®−îc sö dông ë Mü tõ n¨m 1963 → 1967, nh−ng do hiÖu qu¶ b¶o vÖ ng¾n ®· khuyÕn c¸o tiªm v¾cxin sèng gi¶m ®éc lùc. V¾cxin sèng gi¶m ®éc lùc lÇn ®Çu tiªn ®−îc giíi thiÖu còng vµo n¨m 1963, 1967, 1969. §Õn n¨m 1971 18
v¾cxin sëi sèng gi¶m ®éc lùc kÕt hîp víi quai bÞ, Rubella ®−îc chÝnh thøc ®−a vµo sö dông. 2.7.2. T×nh h×nh s¶n xuÊt v¾c xin sëi trªn thÕ giíi 2.7.2.1. ë NhËt B¶n Tr−íc kia sö dông v¾cxin sëi chÕt, nh−ng sau ®ã huû bá v× cã ph¶n øng phô vµ xuÊt hiÖn thÓ sëi kh«ng ®iÓn h×nh. HiÖn nay ®ang s¶n xuÊt vµ sö dông v¾cxin sëi sèng gi¶m ®éc lùc, cã 4 chñng virót sëi : Schwarz, CAM, AIK - C, TD - 97 ®ang ®−îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt v¾c xin nµy. Mçi chñng ®Òu thÝch nghi ë nhiÖt ®é thÊp, nh−ng ®é nhËy c¶m nhiÖt ®é cña v¾cxin phô thuéc vµo chñng virót dïng ®Ó s¶n xuÊt. 1970 1975 1980 1985 1990 Schwarz Schwarz FF8 CAM - 70 AIK - C TD 97 Chñng AIK - C vµ Schwarz FF8 cã nguån gèc tõ chñng Edmonston. Chñng CAM - 70 vµ TD - 97 cã nguån gèc tõ chñng Tanabe lµ chñng ®−îc ph©n lËp ë NhËt. LÞch sö c¸c chñng gèc ®ang ®−îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt v¾cxin sëi sèng gi¶m ®éc lùc ë NhËt. 19
edmonston Tanabe strain HK/24 HA/28 HA/12 CE/6 MK/1 MK(320C)/1 SK (330C)/17 CEF(370C)/14 HK/3 GPK(320C)/37 CEF (330C)/12 MK/1 GPK(320C)/5 Edmonston A HK/5 CEF(320C)/7 MK/1 MK(320C)/1 CEF(320C)/85 CE/90 CEF(320C)/2 HK/2 MK(320C)/2 AIK-C Schwarz CE/4 Kitasato institute CAM/35 CEF(310C)/31 CEF (260C)/12 CEF(310C)/4 CAM-70 TD97 Schwarz FF8 osaka University Chiba Serum Institue Takeda Chemical Industry Co., Ltd CAM : Embryonated egg chorioallantoic cavity, CE : Embryonated egg amniotic cavity, CEC : Chick embryo cells, GPK : guiea-pig kidney cells, HA : Human amniotic cells, HK : Human kidney cells, MK : Monkey kidney cells, SK : Sheep kidney cells. Tõ th¸ng 4 n¨m 1998 bªn c¹nh viÖc tiªm chñng v¾cxin ®¬n gi¸, sö dông v¾cxin phèi hîp MMR : sëi, quai bÞ, Rubella. 2.7.2.2. ë Trung quèc ë Trung quèc sö dông chñng Hu191 (Th−îng H¶i 191) ®Ó s¶n xuÊt v¾cxin Sëi sèng gi¶m ®éc lùc, phôc vô cho nhu cÇu tiªm chñng trong n−íc. Chñng Hu191 ®−îc ph©n lËp tõ mét bÐ trai 2 tuæi m¾c thÓ sëi ®iÓn h×nh n¨m 1960 ë Th−îng H¶i. Virót sëi nµy ®−îc nh©n lªn trªn tÕ bµo thËn ng−êi tiªn ph¸t 33 lÇn, tiÕp tôc ®−îc nh©n lªn trªn tÕ bµo mµng èi ng−êi 39 lÇn, sau ®ã chuyÓn sang tÕ bµo ph«i gµ 16 lÇn vµ ®−îc chÝnh phñ Trung quèc cÊp giÊy phÐp sö dông lµm chñng 20