CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƯỜNG DÙNG – PHẦN 5

Chia sẻ: Nguyễn Thắng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

92
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Định typ HLA Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) là tên dành cho các kháng nguyên hòa hợp mô (ghép) chủ yếu ở người. Có nhiều kháng nguyên hòa hợp mô trên bạch cầu, trong đó kháng nguyên của hệ HLA là quan trọng nhất. Những kháng nguyên này hiện diện trên tất cả các mô của cơ thể, nhưng chúng ta chỉ dễ dàng định týp HLA trên các tế bào lympho máu ngoại biên vì chúng chỉ có mật độ đủ lớn trên những tế bào này. Khác với hệ thống ABO của hồng cầu, không có...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƯỜNG DÙNG – PHẦN 5

CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƯỜNG DÙNG – PHẦN 5 12.9. Định typ HLA Kháng nguyên bạch cầu người (HLA) là tên dành cho các kháng nguyên hòa hợp mô (ghép) chủ yếu ở người. Có nhiều kháng nguyên hòa hợp mô trên bạch cầu, trong đó kháng nguyên của hệ HLA là quan trọng nhất. Những kháng nguyên này hiện diện trên tất cả các mô của cơ thể, nhưng chúng ta chỉ dễ dàng định týp HLA trên các tế bào lympho máu ngoại biên vì chúng chỉ có mật độ đủ lớn trên những tế bào này. Khác với hệ thống ABO của hồng cầu, không có kháng thể anti- HLA tự nhiên trong cơ thể người. Các sinh phẩm dùng để định týp là kháng thể được sản xuất do quá trình miễn dịch xảy ra trong truyền máu hoặc thai kỳ. Thử nghiệm thường dùng nhất là thử nghiệm gây độc lympho bào (lymphocytotoxic test). Tế bào lymphô sống được tách từ máu ngoại vi bằng ly tâm gradient tỉ trọng như đã đề cập ở trên. Dung dịch tế bào sau đó được trộn với các huyết thanh định týp khác nhau, sau đó bổ thể (người ta thường dùng huyết thanh thỏ bình thường để làm nguồn cung cấp bổ thể) được thêm vào. Sau khi ủ một thời gian ở 37oC, những tế bào được kháng thể nhận diện sẽ bị giết bằng phản ứng ly giải qua trung
gian bổ thể. Tế bào chết được phát hiện hiện qua khả năng chúng không thể ngăn cản thuốc nhuộm xâm nhập. Nếu đa số (>90%) các tế bào bị giết bởi một kháng huyết thanh nào đó, thì điều đó có nghĩa rằng chúng ta đã mang HLA tương ứng nên đã bị kháng thể nhận diện. Thử nghiệm này chỉ được tiến hành thường quy ở những trung tâm chuyên khoa chuyên định týp HLA cho các trường hợp ghép cơ quan. Kỹ thuật đòi hỏi khá nhiều thời gian, đắt tiền và trình độ kỹ năng phải cao cũng như phải có nhiều kinh nghiệm trong việc đọc kết quả. Do đó trước khi đề nghị làm kết quả xét nghiệm này, cần phải xin ý kiến tham vấn trước, và khi đã được nhất trí thì phải lấy máu chống đông và gởi ngay đến cho la-bô. Hiện nay, việc định týp HLA đ ược thực hiện bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đ ể phát hiện gen HLA. Kỹ thuật n ày t ốn kém hơn nhưng có đ ộ chính xác và đ ộ nhạy cao hơn nhiều so với các kỹ thuậ t khác. Khá nhiều bệnh cho thấy có sự phối hợp với những kháng nguyên HLA nhất định. Ví dụ, trong bệnh viêm đốt sống dính khớp, có hơn 90% bệnh nhân dương tính với HLA-B27, ngược với tỉ lệ thấp (8%) của HLA này trong nhân dân. Đây là bệnh duy nhất mà việc định týp HLA được xem là có ích cho chẩn đoán. Trong những bệnh khác, sự phối hợp với HLA tỏ ra yếu hơn nhiều. Hơn nữa, tần xuất gen (tính được qua “mức độ phổ biến” của kháng nguyên trong quần thể) người
bình thường quá cao cho đến nỗi sự hiện diện của chúng không nói lên được gen đó có phối hợp với một bệnh nào đó sẽ xảy ra hay không. 12.10. Sản xuất kháng huyết thanh dùng cho các phòng thí nghiệm miễn dịch lâm sàng Kháng huyết thanh được sử dụng trong những thử nghiệm nói trên thường được sản xuất trên động vật bằng cách cho tiêm kháng nguyên cần thiết. Trước đây kháng huyết thanh sản xuất trên động cơ thể chủ yếu là sản phẩm của đáp ứng miễn dịch đa clôn, có nghĩa là trong kháng huyết thanh có nhiều kháng thể được sản xuất từ nhiều clôn tế bào B khác nhau. Mặc dù các kháng thể này khác nhau về cấu trúc chi tiết của vùng biến đổi nhưng tất cả đều cho phản ứng với kháng nguyên tương ứng (người ta gọi đó là tính phản ứng đơn đặc hiệu).
Hình 12.14. Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn clôn Trong những năm vừa qua người ta đã tạo ra được một bước tiến quan trọng trong sản xuất kháng thể huyết thanh đó là sản xuất kháng thể đơn clôn, tức là kháng thể được sản xuất bởi chỉ một dòng tế bào, và do đó các phân tử kháng thể được sản xuất ra hoàn toàn giống nhau ở cả vùng thay đổi và vùng hằng định của chúng. Những kháng thể đơn clôn này chỉ phản ứng với một quyết định kháng nguyên nào đó trên kháng nguyên được dùng. Chúng ta biết rằng hỗn dịch tế bào lách của con vật được gây mẫn cảm, có chứa nhiều tế bào B chịu trách nhiệm sản
xuất nhiều kháng thể chống nhiều epitope khác nhau trên kháng nguyên đưa vào. Những tế bào B này được cho liên hợp với một dòng tế bào u tủy không sản xuất kháng thể để tạo nên một tế bào lai mang khả năng bất tử của tương bào ác tính. Các tế bào lai sau đó được tách ra và chọn dòng (Hình 12.14). Việc nuôi cấy trên quy mô lớn có thể giúp cung cấp số lượng đáng kể các kháng thể tinh khiết và cho phản ứng với độ chính xác cao. Nhờ vào tiềm năng sử dụng cho chẩn đoán và điều trị mạnh, càng ngày người ta càng có nhu cầu sản xuất kháng thể đơn clôn người vì chỉ có những kháng thể này mới không tạo nguy cơ xảy ra phản ứng quá mẫn. Tuy vậy, việc sản xuất kháng thể đơn clôn người hiện nay vẫn còn gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật. 12.11. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp và miễn dịch lâm sàng Những tiến bộ về sinh học phân tử trong những năm qua đã mở ra nhiều ứng dụng quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh miễn dịch. Do vậy, những nhà miễn dịch học lâm sang cần phải hiểu những thuật ngữ và phương pháp mà những nhà sinh học phân tử đang sử dụng. 12.11.1. Kỹ thuật và thuật ngữ Các enzym endonuclease hạn chế (restriction endonuclease) là những enzym lấy từ vi khuẩn có khả năng cắt chuỗi DNA tại một vị trí đặc biệt li ên quan đến
một trình tự nucleotid nhất định. Dùng những enzym này với những tính đặc hiệu khác nhau cho phép cắt chuỗi DNA thành từng đoạn, mà mỗi đoạn có chứa một gen đặc biệt cần tách ra khỏi phần còn lại của phân tử DNA (Hình 12.15). Hình 12.15. Lập bản đồ gen bằng kỹ thuật Southern Blot Trong kỹ thuật Southern blot, các đoạn DNA, sau khi được cắt bởi bằng endonuclease hạn chế, được cho điện di trên gel agarose, những đoạn nhỏ thì di chuyển xa hơn những đoạn lớn. Trong số những đoạn này sẽ có đoạn có chứa gen mà ta quan tâm. Bằng cách dùng chất kiềm ta có thể làm tách đôi các đoạn dsDNA ra thành các ssDNA. Sau khi blot các ssDNA sang giấy nitrocellulose, ta cho đoạn DNA chuỗi đơn mới được tách lai với một đoạn ssDNA bổ sung tương ứng đã
đánh dấu. Sau khi rửa và quan sát dưới đèn đọc phát xạ (autoradiography) thấy có phát xạ ở vị trí nào thì đó là vị trí có chứa đoạn gen mà ta quan tâm. Có nhiều bệnh di truyền, sự khuyết tật của gen không thể biết và việc tìm gen khuyết tật này cũng không thực hiện được. Trong trường hợp này, gen gây bệnh có thể liên kết chặt chẽ với vị trí nhận diện của một endo-nuclease hạn chế nào đó. Dùng các endonuclease đã biết để dò toàn bộ genome người có thể giúp tìm ra các vị trí endonuclease mới hoặc loại bỏ những vị trí đang tồn tại. Như vậy, những đoạn DNA tạo được do một enzym hạn chế nhất định sẽ có những chiều dài khác nhau trên những người khác nhau. Người ta gọi điều này là tính đa dạng về chiều dài đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP), và tính chất này được di truyền đơn giản theo kiểu Mendel. RFLP cung cấp cho ta một lượng lớn các dấu ấn liên kết (linkage marker) để tìm ra các gen gây bệnh trong gia đình, mà không cần phải biết gì về bản thân gen đó cả. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology) dựa vào việc sử dụng plasmid như các phương tiện để truyền các đoạn DNA lạ, ví dụ gen người. Plasmid là những mảnh DNA hình tròn, nhỏ, xuất hiện tự nhiên trong bào tương của vi khuẩn. Dùng một endonuclease đặc hiệu có thể mở vòng plasmid này và gắn vào đó một đoạn gen người, và như vậy là ta đã tạo ra một phân tử DNA lai (hybrid DNA) có ch ức năng sinh học riêng. Nếu sau đó plasmid đ ưa được vào một loại vi khuẩn nào đó (ví dụ E. coli) thì ta có thể cho nuôi cấy vi khuẩn để sản xuất ra một loại các bản sao đoạn DNA đã gắn vào plasmid đó. K ỹ thuật DNA tái tổ
hợp thường được dùng để sản xuất các chế phẩm sinh học tính khiết sử dụng trong chẩn đoán hoặc điều trị hoặc một số mục đích sinh học khác. 12.11.2. Ứng dụng chẩn đoán Kỹ thuật khuyếch đại DNA đã cung cấp cho chúng ta một phương tiện chẩn đoán trước sinh (prenatal diagnosis) chính xác đối với các bệnh di truyền. Vật phẩm dùng cho chẩn đoán là mẩu mô lấy được từ gai nhau, từ kỹ thuật soi thai (fetoscopy) hoặc chọc túi ối (amniocentesis). Kỹ thuật này cũng giúp chẩn đoán ở giai đoạn tiền lâm sàng những bệnh nhiễm sắc thể có thời kỹ khởi bệnh muộn, bệnh phụ nữ liên quan giới tính, kể cả những thiếu hụt miễn dịch di truyền. Người ta ghi nhận rằng các thử nghiệm gen đang đ ược sử dụng ngày càng nhiều cho việc chẩn đoán bệnh. Việc phát hiện ra hiện tượng tái sắp xếp (rearrangement) của các gen immunoglobulin và của gen thụ thể tế bào T (TCR gene) đã cung cấp cho chúng ta một công cụ mới để phân tích nguồn gốc của những tế bào lympho ác tính không mang các dấu ấn kinh điển của tế bào B và tế bào T, tìm nguồn gốc của tế bào ung thư trong bệnh bạch cầu tế bào dạng tóc (hairy cell leukemia) và những cơn tăng dữ dội các nguyên bào trong bệnh bạch cầu tủy mạn. Ngoài ra, thử nghiệm gen cũng giúp ta phân biệt các bệnh tăng sinh lympho đa clôn và đơn clôn. 12.11.3. Ứng dụng điều trị
Kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã mang lại nhiều tiến bộ trong điều trị thông qua việc tổng hợp các hợp chất sinh học hoặc liệu pháp gen. Sinh tổng hợp có được tiến hành bằng cách gắn một gen người vào một plasmid làm vật truyền và sau đó cho nhân lên thành clôn. Có nhiều loại hormone (ví dụ insulin) và thuốc điều hòa miễn dịch (ví dụ interferon) đã được tổng hợp theo cách này. Một ứng dụng quan trọng của phương pháp này sẽ là ứng dụng trong sản xuất vắc xin. Một khi chúng ta đã xác định được những kháng nguyên vi khuẩn có khả năng gây miễn dịch bảo vệ thì chúng ta có thể tạo clôn được với những gen tương ứng. Một vắc-xin tái tổ hợp đã được sản xuất và dùng phổ biến là vắc xin viêm gan B. Hiện nay các nhà nghiên cứu đang cố gắng để tìm ra những vắc xin có hiệu quả khác nhằm chống lại các bệnh nhiễm tr ùng phổ biến trên thế giới như vắc-xin sốt rét và HIV. Một mục đích của công nghệ gen là thay thế được những gen bị khiếm khuyết trong cơ thể con người. Liệu pháp gen hiện đang còn nhiều tranh cãi nhưng những rối loạn miễn dịch như thiếu hụt adenosine deaminase hoặc purine nucleoside phosphorylase đang là nh ững ứng cử viên quan trọng đầu tiên cho việc sử dụng liệu pháp này để điều trị.