CYTOKINE – Phần 2

Chia sẻ: Nguyen UYEN | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phải một số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiều cytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chức năng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khăn khác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thể lympho bào không thuần nhất và sự đáp ứng của chúng với các cytokine được...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CYTOKINE – Phần 2

CYTOKINE – Phần 2 Tinh chế bằng phương pháp hoá sinh Việc phân lập và tinh chế bằng phương pháp hoá sinh của các cytokine gặp phải một số trở ngại. Ðầu tiên là dịch nổi nuôi tế bào thường chứa hỗn hợp nhiều cytokine hơn là chứa một cytokine, điều này làm cho khó có thể qui một chức năng nào đó cho một chất riêng biệt. Cùng với khó khăn này còn có một khó khăn khác là các hệ thống ban đầu dùng để thử nghiệm cytokine gồm có các quần thể lympho bào không thuần nhất và sự đáp ứng của chúng với các cytokine đ ược thử thường đưa đến các kết quả không rõ ràng. Một khó khăn tiếp theo nữa là dịch nổi nuôi tế bào có một nồng độ cytokine rất thấp. Có hai phát minh đã cho phép các nhà nghiên cứu vượt qua được những khó khăn này và có thể xác định được các đặc trưng hoá sinh của các cytokine. Phát minh thứ nhất là sự phát hiện ra các dòng tế bào ung thư có khả năng tiết cytokine. Những dòng tế bào ung thư này đã cung cấp các quần thể tế bào thuần nhất có khả năng tiết ra một cytokine nhất định với nồng độ cao hơn khi nuôi các tế bào dạng lympho này. Phát minh thứ hai là sự phát hiện ra các dòng tế bào mà sự sinh
trưởng của chúng phụ thuộc vào sự có mặt của một cytokine nhất định. Những dòng tế bào này đã cung cấp một hệ thống thực nghiệm đơn giản, đó là một quần thể tế bào thuần nhất có khả năng tăng sinh khi đáp ứng với một yếu tố sinh trưởng nhất định. Khi sử dụng hệ thống thử nghiệm này để đánh giá hoạt tính sinh học của các cytokine đã phát hiện từ trước có các chức năng khác nhau, người ta đã phát hiện thấy rằng trước đây tưởng như có rất nhiều cytokine và mỗi một cytokine được đặt tên theo hoạt tính sinh học của nó, nhưng thực ra đó lại chỉ là một cytokine có các hoạt tính sinh học khác nhau. Vì vậy người ta đã đưa ra một bảng thuật ngữ chuẩn trong đó phần lớn các cytokine được gọi là interleukin dựa theo vai trò của nó trong việc truyền thông tin giữa các tế bào bạch cầu. Những interleukin đầu tiên được phát hiện được gọi là interleukin-1 (IL-1) và interleukin-2 (IL-2). IL-1 có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau mà trước đây đã được mô tả ít nhất là có 8 yếu tố, IL-2 trước đây được phát hiện những hoạt tính và đặt tên cho 4 yếu tố khác nhau. Trong thập kỷ 80 người ta đã phát hiện được 10 interleukin và một số cytokine khác còn vẫn được đặt tên theo hoạt tính sinh học của chúng. Sự tương ứng giữa các lymphokine đã được tinh chế và các yếu tố được đặt tên trước đây đã được sắp xếp lại một cách rõ ràng (xem bảng 11.1). Kỹ thuật tinh chế các interleukin bằng phương pháp hoá sinh gồm có một số kỹ thuật tinh chế protein và thường sử dụng nước nổi chứa cytokine khi nuôi các tế bào có khả năng sản xuất một cytokine nhất định với số lượng lớn. Ví dụ các dòng tế bào mono bị ung thư
hoá được chọn lọc để sản xuất IL-1 và các dòng tế bào lymphoma thuộc loại tế bào T được chọn để sản xuất IL-2. Người ta nuôi các tế bào này trong các bình nuôi cấy lớn và dùng các chất kích thích phân bào, phorbon este hoặc các chất kích thích thích hợp khác kích thích chúng để chúng sinh ra các cytokine. Sau đó tiến hành tinh chế cytokine từ dịch nổi nuôi cấy. Trong phần lớn các trường hợp người ta cô đặc cytokine bằng lọc màng và tiếp theo bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, lọc gel, kỹ thuật tập trung đẳng điện và sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Sau mỗi bước tinh chế người ta phải xác định lại mức độ hoạt tính sinh học của cytokine. Việc tinh chế IL-2 là một ví dụ điển hình. Thử nghiệm sinh học quyết định trong quá trình tinh chế này dựa vào khả năng kích thích tăng sinh của IL-2 đối với một số tế bào nhất định. Thông thường dòng tế bào được dùng là dòng tế bào CTLL-2, đó là một dòng tế bào Tc của chuột nhắt có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2; tế bào HT-1, đó là tế bào Th mà có sinh trưởng phụ thuộc vào IL-2. Sau mỗi bước tách phần tinh chế người ta cho phần tinh chế được vào các dòng tế bào và đánh giá sự tăng sinh của tế bào thông qua khả năng thâu nhận thymidine [3H]. Hiệu xuất tinh chế bằng phương pháp hoá sinh còn rất kém mặc dù các tế bào có thể sinh ra một lượng lớn interleukin. Ví dụ từ 10 lít nước nổi thu được từ nuôi cấy dòng tế bào ung thư chuột nhắt sản sinh ra IL-2 khi được kích thích bằng PHA thì người ta chỉ thu được khoảng 50(g IL-2 mà thôi. Thường thì hiệu xuất của việc tinh chế bằng phương pháp hoá sinh là không cao và độ tinh khiết cũng không lớn trong hầu hết các trường hợp.
Clone hoá các gene cytokine Người ta có thể thu được khối lượng lớn cytokine tinh khiết khi sử dụng các kỹ thuật tái tổ hợp ADN từ các gene mã hoá cytokine. Ngày nay người ta đã lập được một kho ADN bổ cứu từ các dòng tế bào sản xuất cytokine thích hợp (xem hình 2.4). Sau đó sàng lọc kho này bằng cách làm xuất hiện các clone ADN bổ cứu trong tế bào COS. Khi thử nghiệm các hoạt tính cytokine trong nước nổi nuôi cấy tế bào COS người ta nhận ra những tế bào COS nào đã được nạp đoạn ADN bổ cứu mã hoá cytokine. Có một kỹ thuật khác được dùng để nhận dạng đoạn ADN bổ cứu mã hoá cytokine đó là kỹ thuật lai tạo đoạn gien. Do cytokine chỉ đ ược sản xuất sau khi tế bào được kích thích bằng kháng nguyên, chất kích thích phân bào hoặc tác nhân kích thích khác, nên ARN thông tin của một tế bào cảm ứng sẽ chứa các đoạn ARN thông tin mã hoá cytokine trong khi ARN thông tin của tế bào không cảm ứng sẽ không có các đoạn ARN thông tin mã hoá cytokine này. Vì vậy người ta có thể tách ARN thông tin từ những tế bào cảm ứng và sao mã ngược để có được đoạn ADN bổ cứu xoắn đơn tương ứng với các gene được xuất hiện trong các tế bào cảm ứng. Bằng phương pháp lai ADN bổ cứu với ARN thông tin của tế bào không cảm ứng người ta sẽ loại bỏ được những đoạn ADN bổ cứu có trong cả hai loại tế bào (cảm ứng và không cảm ứng) và chỉ còn lại những đoạn ADN bổ cứu không bị lai (chỉ có trong các tế bào cảm ứng - đó chính là ADN mã hoá cytokine), sau đó tiến hành làm giầu các ADN này. Các đoạn ADN này sẽ được chuyển nạp vào các vi khuẩn hoặc các tế bào của động vật có vú để chúng sản xuất
ra các cytokine. Vào giữa những năm 1980 người ta đã thành công trong việc clone hoá các gene của các cytokine đã biết và chuyển nạp chúng vào các tế bào vi khuẩn, nấm men, côn trùng hoặc tế bào động vật có vú và thu được một lượng lớn các cytokine do các tế bào này sản sinh ra. Cấu trúc và chức năng của các cytokine và các thụ thể của chúng Khi người ta đã clone hoá được các gene mã hoá các cytokine khác nhau và các thụ thể của chúng thì có thể tạo ra được một lượng đủ lớn các sản phẩm tinh khiết dùng cho các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của các protein quan trọng này. Bảng 11.3 và 11.4 tóm lược các hoạt tính sinh học chủ yếu của các cytokine có tầm quan trọng nhất. Interleukin 1 (IL-1) Hoạt tính sinh học của IL-1 lần đầu tiên được Gery I, Gershon R .K và Waksman B .H mô tả vào năm 1970. Họ đã chỉ ra rằng không thể sử dụng đơn thuần PHA, một chất kích thích phân bào đối với các tế bào T, để kích thích các thymo bào tăng sinh kỳ đầu được. Tuy nhiên khi nuôi cấy các thymo bào trong môi trường điều chỉnh lấy từ dịch nuôi cấy các tế bào đại thực bào đã hoạt hoá thì các thymo bào tăng sinh đáp ứng lại kích thích của PHA và được chỉ điểm bằng đồng vị phóng xạ thymidine [3H] (hình 11.3). Yếu tố hoạt động thu được từ các đại thực bào này có tác dụng kích thích các thymo bào được gọi là yếu tố hoạt hoá lympho bào - LAF (Lymphocyte Activating Factor). Cuối cùng thì người ta cũng đã tinh
chế được nó và đặt lại tên là interleukin-1. Ngày nay khả năng kích thích các thymo bào đã được xử lý bằng PHA vẫn là một thử nghiệm sinh học chủ yếu để thử hoạt tính của IL-1. Ðầu tiên người ta nghĩ rằng IL-1 chỉ do các tế bào mono và đại thực bào chế tiết ra. Tuy nhiên gần đây người ta lại thấy rằng các yếu tố giống IL-1 (được xác định bằng khảo sát hoạt tính hoạt hoá các thymo b ào đã được xử lý bằng PHA) lại do rất nhiều loại tế bào khác nhau chế tiết, bao gồm các tế bào mono, các đại thực bào, các tế bào lympho B, các tế bào có tua, các nguyên bào sợi, nguyên bào sừng, các tế bào Langerhan, các bạch cầu trung tính, các tế bào hình sao, các tế bào biểu mô, và các tế bào nội mô. Ngoại trừ một số ít trường hợp là các dòng tế bào đã chuyển dạng còn ngoài ra thì IL-1 chỉ được tạo ra khi mà các tế bào này đã bị kích thích. Việc chế tiết IL-1 của các tế bào mono và các đại thực bào có thể tạo ra được bởi rất nhiều chất kích thích khác nhau. Quá trình thực bào một số vi khuẩn nhất định cũng đóng vai trò như một tác nhân kích thích sản xuất IL-1. Sở dĩ có thêm được tác dụng này là do bản thân một lipopolysacharite thành tế bào vi khuẩn gram âm đã có khả năng gây ra chế tiết IL-1. Việc thực bào các tiểu thể chất rắn hoặc các phức hợp kháng nguyên-kháng thể-bổ thể cũng gây kích thích đại thực bào sản xuất IL-1. Có nhiều chất khác bao gồm các muramyl dipeptide, phorbol myristate acetate, các thành phần bổ thể nhất định (như C3a và C5a) và IFN-( cũng gây kích thích đại thực bào sản xuất IL-1 hoặc là bằng cách tương tác màng giữa thụ thể của tế bào T và phức hợp kháng nguyên-phân tử hoà hợp mô
chủ yếu trên màng đại thực bào; hoặc là bằng cách chế tiết các cytokine của tế bào Th như M-CSF, IFN-( hoặc TNF-(. Sau khi đại thực bào bị kích thích trong vòng 30 phút đầu có thể thấy được một lượng nhỏ IL-1 ở trong bào tương của chúng và sau 3 giờ kích thích thì có một lượng lớn IL-1 được chế tiết ra. Việc tinh chế IL-1 bằng phương pháp hoá sinh đã cho thấy rằng có hai polypeptide riêng biệt cùng có chung hoạt tính của IL-1. Mỗi polypeptide này có trọng lượng phân tử vào khoảng 17 kD, nhưng chúng khác nhau về điện tích nên có thể phân tách chúng ra bằng phương pháp đẳng điện. Việc clone hoá gene cũng đã khẳng định các kết quả nghiên cứu về hoá sinh và cho biết thêm rằng hai gene độc lập (IL-1( và IL-1() mã hoá hai polypeptide IL-1; hai gene này có 27% trình tự tương đồng nhau. Cả hai protein có chức năng của IL-1 đều gắn vào cùng một loại thụ thể dành cho IL-1 trên tế bào. Người ta vẫn chưa biết được hai protein khác nhau như thế nào về phương diện hoạt tính sinh học. IL-1( cũng tồn tại dưới dạng kết hợp với màng, dạng này cũng góp phần vào việc hoạt hoá tế bào T sau khi tương tác màng. Chức năng chủ yếu của IL-1 là tham gia vào quá trình hoạt hoá các tế bào Th. Quá trình này cần phải có hai loại tín hiệu hoạt hoá. Một tín hiệu đặc biệt đ ược tạo ra giữa thụ thể của tế bào T với phức hợp kháng nguyên đã bị xử lý + phân tử hoà hợp mô chủ yếu lớp II. Chỉ riêng tín hiệu này thì chưa đủ để cho các tế bào Th tăng sinh mà cần phải có một tín hiệu thứ hai gọi là tín hiệu đồng kích thích . Tín hiệu đồng kích thích có thể được phát ra khi diễn ra sự gắn của hoặc IL-1 hoà
tan hoặc IL-1 gắn trên màng vào thụ thể dành cho IL-1 trên màng tế bào Th. Hai tín hiệu cùng nhau gây ra sự phiên mã của một số gene trong tế bào Th bao gồm các gene mã hoá IL-2, IL-3, IL-4, và IFN-(. Việc hoạt hoá tế bào Th phụ thuộc vào tín hiệu đồng kích thích là IL-1 được Weaver C .T và Unanue E .R mô tả trong thí nghiệm sử dụng các đại thực bào xử lý bằng paraformaldehyde làm cho chúng trở nên bất hoạt về mặt chuyển hoá và vì thế không còn khả năng sản xuất IL-1 (hình 11.4). Trong mô hình thí nghiệm này các đại thực bào đầu tiên được xử lý bằng TNF-( để làm tăng biểu lộ các phân tử hoà hợp mô chủ yếu lớp II, sau đó một số tế bào được xử lý với LPS để sinh ra IL-1, số tế bào còn lại để nguyên. Sau đó cố định cả hai loại đại thực bào này bằng paraformaldehyde để ngăn cản sự chuyển hoá tiếp theo. Khi ủ hai mẫu đại thực bào này với các tế bào Th của cùng một clone và một kháng nguyên peptit đặc hiệu với clone tế bào này thì chỉ có các đại thực bào đã được xử lý với LPS mới có khả năng gây tăng sinh các tế bào Th. Các đại thực bào này cung cấp cả hai loại tín hiệu hoạt hoá đặc hiệu và không đặc hiệu. Tín hiệu hoạt hoá đặc hiệu bắt nguồn từ sự tương tác giữa các thụ thể của tế bào T với các phức hợp peptit kháng nguyên-phân tử hoà hợp mô chủ yếu trên đại thực bào; tín hiệu hoạt hoá không đặc hiệu là tín hiệu đồng kích thích IL-1 kết hợp màng, tín hiệu này vẫn tiếp tục chức năng ngay cả sau khi đã cố định bằng paraformaldehyde. Các đại thực bào mà không được hoạt hoá bởi LPS sẽ bị thiếu mất hoạt tính của tín hiệu đồng kích thích IL-1 kết hợp màng này, do vậy không hoạt hoá được tế bào Th.
Ngoài vai trò thiết yếu là một tín hiệu đồng kích thích đối với tế bào Th thì IL-1 còn cho thấy nó là một tác nhân hoạt động đa hướng, có rất nhiều tác dụng khác nhau lên các loại tế bào khác nhau. Nó có tác dụng đẩy nhanh tốc độ chín của các tế bào B và sự tăng sinh về số lượng của một dòng tế bào B sau khi được hoạt hoá bởi kháng nguyên. IL-1 làm tăng hoạt động của tế bào NK và ảnh hưởng lên phản ứng viêm tại chỗ thông qua các tác dụng của nó lên các tế bào tạo máu, các nguyên bào sợi và các tế bào nội mô mạch máu. Khi đưa IL-1 vào cơ thể thì các tế bào bạch cầu trung tính được tạo ra rời tuỷ xương vào tuần hoàn rồi sau đó thoát mạch qua thành các mao mạch vào kẽ mô. Cả các bạch cầu trung tính và các đại thực bào đều bị hấp dẫn theo kiểu hoá h ướng động bởi IL-1, làm tăng nhanh mật độ các tế bào thực bào trong quá trình viêm. IL-1 cũng còn có một số tác dụng giống như tác dụng xa kiểu chất nội tiết lên các tế bào và mô khác nhau. Chẳng hạn nó tác dụng lên các tế bào gan sản xuất ra một số protein trong pha viêm cấp như fibrinogen, protein phản ứng C, và haptoglobin. Mỗi chất này đều góp phần vào sức đề kháng của túc chủ trong quá trình nhiễm khuẩn. IL-1 cũng có tác dụng lên hệ thống thần kinh trung ương thông qua vùng dưới đồi gây ra sốt, ngủ gật và chán ăn. Ngoài ra nó còn tác dụng lên các tế bào cơ gây sản xuất các prostaglADNin, hoạt tính này được biết là dẫn tới thuỷ phân protein, cuối cùng có thể dẫn tới nhược cơ.