Đánh giá tác dụng của ghép tế bào gốc mô mỡ tự thân lên biến đổi siêu cấu trúc vết thương mạn tính

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA GHÉP TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ TỰ THÂN<br /> LÊN BIẾN ĐỔI SIÊU CẤU TRÚC VẾT THƯƠNG MẠN TÍNH<br /> Nguyễn Tiến Dũng*; Đinh Văn Hân*; Quản Hoàng Lâm**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu vai trò của ghép tế bào gốc mỡ tự thân (TBGM) lên biến đổi hình thái<br /> siêu cấu trúc mô vết thương mạn tính (VTMT). Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu 25 bệnh<br /> nhân (BN) bị VTMT, điều trị nội trú tại Khoa Liền vết thương, Viện Bỏng Quốc gia từ tháng 4 - 2015<br /> đến 6 - 2016. Tuổi trung bình 56,88 ± 16,81, tỷ lệ nam/nữ 2,12. Tất cả BN được ghép TBGM tự<br /> thân lên bề mặt vết thương mỗi 3 - 5 ngày. Sinh thiết mô tại chỗ vết thương. Đánh giá biến đổi<br /> siêu cấu trúc mô trước ghép, sau ghép TBGM 7 ngày, 15 ngày và 20 ngày trên kính hiển vi điện<br /> tử truyền qua. Kết quả: siêu cấu trúc VTMT có đặc điểm phá hủy chất nền ngoại bào. Sau ghép<br /> TBGM, siêu cấu trúc mô liên kết cải thiện rõ rệt theo thời gian: TBGM kích thích nguyên bào sợi<br /> tăng sinh, tăng chế tiết collagen, giảm tình trạng viêm và cải thiện chất nền ngoại bào. TBGM<br /> còn kích thích tăng sinh tế bào biểu mô ở lớp mầm và mạch máu tân tạo tại chỗ VTMT. Kết luận:<br /> TBGM tự thân có tác dụng kích thích quá trình liền vết thương thông qua kích thích tăng sinh<br /> tế bào và cải thiện chất nền ngoại bào tại chỗ VTMT.<br /> * Từ khóa: Vết thương mạn tính; Tế bào gốc mô mỡ; Siêu cấu trúc.<br /> <br /> Studying the Effectiveness of Autologous Transplantation of AdiposeDerived Stem Cells on Ultrastructure Changes of Chronic Wound<br /> Summary<br /> Objectives: Evaluating the effectiveness of autologous transplantation of adipose-derived<br /> stem cells on ultrastructure changes of chronic wound. Subjects and methods: We studied 25<br /> patients with chronic wound, who hospitalized at Department of Wound healing, National<br /> Institute of Burns from April, 2015 to June, 2016. The mean age was 56.88 ± 16.81, male/female<br /> ratio was 2.12. All patients were been grafted the autologous adipose-derived stem cells (ADSCs)<br /> once every 3 - 5 days. The wound biopsy was done before and after the autologous transplantation<br /> of ADSCs, 7 days, 15 days and 20 days for evaluation of ultrastructure changes by transmission<br /> electron microscope. Results: Before transplantation, extracellular matrix (ECM) was destroyed.<br /> After transplantation, ADSCs strongly stimulated fibroblast proliferation and fibroblasts to produce<br /> collagen. ADSCs helped to reduce swelling and improve the structure of ECM. ADSCs also<br /> promoted proliferations of epithelial cell and neovascularization at the chronic wound local.<br /> Conclusion: Autologous ADSCs promoted the wound healing process by cell proliferation and<br /> improvement of ECM in chronic wound local.<br /> * Key words: Chronic wound; Adipose-derived stem cells; Ultrastructure.<br /> * Viện Bỏng Quốc gia<br /> ** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tiến Dũng (ntzung_0350@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 05/06/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 21/07/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/07/2016<br /> <br /> 74<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tế bào gốc (TBG) phân lập được từ<br /> mô mỡ, gọi tắt là TBG mỡ, là TBG trung<br /> mô có hình dáng nguyên bào sợi, có khả<br /> năng tạo colony và biệt hóa thành nhiều<br /> loại mô khác nhau [3, 6, 7]. Hiện nay,<br /> TBGM được ứng dụng nhiều trong y học<br /> tái tạo và sửa chữa, trong đó có điều trị<br /> các VTMT. Đối với VTMT, tại chỗ vết thương<br /> tiết quá nhiều cytokine tiền viêm và enzym<br /> phân hủy protein, kèm theo tế bào thì lão<br /> hóa, nhiễm trùng dai dẳng, thiếu hụt TBG<br /> [8]. VTMT thường xuất hiện trên BN có<br /> bệnh lý nội hoặc ngoại khoa. Vì vậy, việc<br /> điều trị VTMT trở nên khó khăn. Trị liệu tế<br /> bào, trong đó có sử dụng TBGM là một<br /> lựa chọn khá phổ biến hiện nay. Trên thực<br /> nghiệm, TBGM được cho là có khả năng<br /> kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, chế<br /> tiết các protein của chất nền ngoại bào,<br /> kích thích biểu mô hóa và tăng sinh mạch<br /> máu tân tạo, một trong những yếu tố quan<br /> trọng của quá trình liền vết thương da<br /> [4, 10]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên<br /> cứu đề tài này nhằm làm sáng tỏ vai trò<br /> của ghép TBGM tự thân lên biến đổi hình<br /> thái siêu cấu trúc mô VTMT.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 25 BN bị VTMT do các nguyên nhân<br /> khác nhau, điều trị nội trú tại Khoa Liền vết<br /> thương, Viện Bỏng Quốc gia từ tháng<br /> 04 - 2015 đến 6 - 2016.<br /> * Tiêu chuẩn lựa chọn BN: BN ≥ 16 tuổi,<br /> tình nguyện viết đơn tham gia nghiên cứu.<br /> * Tiêu chuẩn loại trừ: BN mắc viêm<br /> gan B, viêm gan C, HIV. BN bị vết loét do<br /> ung thư, xạ trị ung thư. Phụ nữ mang thai,<br /> cho con bú.<br /> <br /> 2. Trang thiết bị, vật tư nghiên cứu.<br /> Tấm TBGM tự thân do Khoa Labo,<br /> Viện Bỏng Quốc gia cung cấp. Kim sinh<br /> thiết (biopsy puch) đường kính 7 mm<br /> (Italia) và kính hiển vi điện tử truyền qua<br /> JEM 1400 (Hãng JEOL, Nhật Bản).<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu.<br /> Tất cả BN nghiên cứu khi vào viện đều<br /> được theo dõi nguyên nhân trực tiếp hoặc<br /> gián tiếp gây VTMT, những bệnh lý kết hợp<br /> ảnh hưởng tới quá trình liền vết thương.<br /> Đánh giá tình trạng vết thương. Theo dõi<br /> diễn biến tại chỗ vết thương trước và sau<br /> ghép TBGM tự thân.<br /> * Phương pháp ghép TBGM tự thân:<br /> sau khi BN hoặc người giám hộ đồng ý<br /> viết đơn tham gia ghép TBGM, tiến hành<br /> thu thập mô mỡ. Làm tiểu thủ thuật lấy<br /> 3 - 5 gram mô mỡ dưới da ở vùng bụng,<br /> bẹn hoặc mặt trong đùi của BN. Cố định<br /> mô mỡ trong dung dịch Dulbecco’s Modified<br /> Eagle’s Medium (DMEM), chuyển lên Khoa<br /> Labo, Viện Bỏng Quốc gia, phân lập, nuôi<br /> cấy tăng sinh và tạo tấm TBGM tự thân.<br /> Trong thời gian chờ tạo tấm TBGM, BN<br /> được thay băng bằng các thuốc kháng<br /> khuẩn tại chỗ, lấy bỏ hoại tử. Khi trên lâm<br /> sàng không còn dấu hiệu nhiễm khuẩn,<br /> tiến hành ghép TBGM. Ghép tấm TBGM<br /> tự thân lên bề mặt vết thương và thay<br /> tấm TBGM mỗi 3 - 5 ngày.<br /> * Phương pháp làm tiêu bản siêu cấu<br /> trúc mô tại chỗ VTMT:<br /> Tại các thời điểm 72 giờ đầu sau khi<br /> nhập viện (T0), trước khi tiến hành ghép<br /> TBGM tự thân (T1), sau khi ghép TBGM 7<br /> ngày (T2), 15 ngày (T3) và 20 ngày (T4),<br /> tiến hành sinh thiết mô vùng mép vết thương<br /> sao cho mảnh sinh thiết chứa 50% mô nền<br /> vết thương và 50% da lành mép vết thương<br /> bằng kim sinh thiết đường kính 7 mm.<br /> 75<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016<br /> Cố định bệnh phẩm trong dung dịch<br /> glutaraldehyt 4%. Làm tiêu bản hiển vi<br /> điện tử truyền qua theo phương pháp của<br /> Nguyễn Kim Giao (2004) [1], thực hiện tại<br /> Khoa Hình thái, Viện 69, Bộ Tư lệnh Lăng<br /> Chủ tịch Hồ Chí Minh để xác định biến đổi<br /> siêu cấu trúc. Đọc kết quả trên kính hiển<br /> vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL<br /> (Nhật Bản).<br /> <br /> các mức độ khác nhau. Xuất hiện tế bào<br /> viêm là đại thực bào, bạch cầu đa nhân,<br /> tế bào lympho đang hoạt động (ảnh 1 - 4).<br /> <br /> * Xử lý số liệu:<br /> Trên cơ sở diễn biến lâm sàng tại chỗ<br /> VTMT, đánh giá chi tiết hình ảnh siêu cấu<br /> trúc mô tại các thời điểm nghiên cứu để<br /> xác định biến đổi cấu trúc tế bào và thành<br /> phần ngoại bào điển hình tại mỗi thời điểm<br /> nghiên cứu.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đặc điểm nhóm BN nghiên cứu.<br /> 25 BN nghiên cứu có tuổi trung bình<br /> 56,88 ± 16,81, tỷ lệ nam/nữ 2,12. Nguyên<br /> nhân gây VTMT gặp nhiều nhất là do nhiễm<br /> khuẩn mô mềm (36%), tiếp theo là tỳ đè<br /> (32%) và các nguyên nhân khác như đái<br /> tháo đường (16%), bệnh mạch máu (8%).<br /> 24/25 BN (96%) có bệnh lý kết hợp. Các<br /> bệnh kết hợp gặp với tỷ lệ cao là bệnh tim<br /> mạch (28%), đái tháo đường (20%), chấn<br /> thương tủy sống (16%). VTMT có thời gian<br /> tồn tại khá lâu trước khi vào viện điều trị<br /> (trung bình 4,20 ± 3,20 tháng).<br /> <br /> Ảnh 1: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT khi mới vào viện.<br /> Hình ảnh phù viêm (a), các sợi collagen<br /> bị đứt gãy (b). Xuất hiện đại thực bào (c),<br /> các tế bào hoại tử (nhân đông vón (d).<br /> Hiển vi điện tử truyền qua. Phóng đại<br /> 1.500 lần. BN Trần Văn Đ (số BA: 7071)<br /> <br /> 2. Biến đổi siêu cấu trúc mô tại chỗ<br /> VTMT trước và sau ghép TBGM tự thân.<br /> * Thời điểm mới vào viện (T0):<br /> Hình ảnh siêu cấu trúc thấy phá hủy<br /> chất nền ngoại bào ở đáy vết thương với<br /> biểu hiện: hoại tử mạnh, phù viêm chất<br /> nền ngoại bào (biểu hiện các khoảng gian<br /> bào giãn rộng). Sợi collagen chân bì bị<br /> giãn tách, thưa thớt, đứt gãy phá hủy ở<br /> 76<br /> <br /> Ảnh 2: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT khi mới vào viện.<br /> Hình ảnh bạch cầu đa nhân (a) bên<br /> cạnh là nguyên bào sợi (b). Hiển vi điện<br /> tử truyền qua. Phóng đại 3.000 lần. BN<br /> Đinh Thị H (số BA: 0196)<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016<br /> <br /> Ảnh 3: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh<br /> sinh thiết mô VTMT khi mới vào viện.<br /> <br /> Ảnh 5: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT trước khi ghép TBGM.<br /> <br /> Hình ảnh tế bào lympho đang hoạt<br /> động (a). Hiển vi điện tử truyền qua. Phóng<br /> đại 3.000 lần. BN Đinh Thị H (số BA: 0196)<br /> <br /> Hình ảnh phù viêm (a), bó sợi collagen<br /> đứt gãy, mất cấu trúc (b), nguyên bào sợi<br /> chế tiết collagen (c). Hiển vi điện tử truyền<br /> qua. Phóng đại 3.000 lần. BN Nguyễn Thị N<br /> (số BA: 2318)<br /> <br /> Ảnh 4: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh<br /> sinh thiết mô VTMT khi mới vào viện.<br /> Hình ảnh bó sợi collagen đứt gãy, mất cấu<br /> trúc (a). Hiển vi điện tử truyền qua. Phóng đại<br /> 1.500 lần. BN Nguyễn Thị S (số BA: 2731)<br /> * Thời điểm trước ghép TBGM (T1):<br /> Hình ảnh siêu cấu trúc thấy chất nền<br /> ngoại bào thưa thớt, phù viêm khoảng gian<br /> bào, các sợi collagen đứt gãy, tế bào viêm<br /> chủ yếu là tế bào lympho, có cả bạch cầu<br /> đa nhân. Nguyên bào sợi xuất hiện và có<br /> biểu hiện chế tiết sợi collagen (ảnh 5 - 6).<br /> <br /> Ảnh 6: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT trước khi ghép TBGM.<br /> Thấy hình ảnh phù viêm (a), xuấn hiện<br /> bạch cầu đa nhân (b) và lympho (c). Hiển<br /> vi điện tử truyền qua. Phóng đại 1.500 lần.<br /> BN Trần Thị S (số BA: 1506)<br /> * Thời điểm sau ghép TBGM 7 ngày (T2):<br /> Hình ảnh siêu cấu trúc thấy bắt đầu<br /> xuất hiện tăng sinh tế bào: nguyên bào<br /> sợi tăng sinh, trong bào tương của nguyên<br /> bào sợi có nhiều lưới nội bào có hạt hoạt<br /> 77<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2016<br /> động mạnh. Vùng ngoại bào có các sợi<br /> collagen mảnh, nằm song song với nguyên<br /> bào sợi (ảnh 7 - 8).<br /> <br /> * Thời điểm sau ghép TBGM 15 ngày (T3):<br /> Hình ảnh siêu cấu trúc thấy tăng sinh<br /> tế bào: biểu bì tăng sinh lớp mầm, tăng<br /> sinh nguyên bào sợi, các nguyên bào sợi<br /> tăng sản xuất, chế tiết collagen, tế bào sắp<br /> xếp có trật tự và theo một hướng (ảnh 9 - 10).<br /> <br /> Ảnh 7: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT sau ghép TBGM 7 ngày.<br /> Hình ảnh bào tương nguyên bào sợi có<br /> nhiều lưới nội bào có hạt hoạt động (a),<br /> các sợi collagen mỏng nằm song song với<br /> nguyên bào sợi (b). Hiển vi điện tử truyền<br /> qua. Phóng đại 3.000 lần. BN Nguyễn Thị N<br /> (số BA: 2318)<br /> <br /> Ảnh 8: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT sau ghép TBGM 7 ngày.<br /> Tăng sinh tế bào, các nguyên bào sợi<br /> nằm sát nhau, bào tương có nhiều lưới nội<br /> bào có hạt (a). Hiển vi điện tử truyền qua.<br /> Phóng đại 3.000 lần. BN Trần Thị S (số BA:<br /> 1506)<br /> 78<br /> <br /> Ảnh 9: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT sau ghép TBGM 15 ngày.<br /> Hình ảnh tế bào biểu mô lớp mầm nằm<br /> sát nhau, không thấy khoảng gian bào (a).<br /> Hiển vi điện tử truyền qua. Phóng đại<br /> 3.000 lần. BN Nguyễn Thị N (số BA: 2318)<br /> <br /> Ảnh 10: Hình ảnh siêu cấu trúc mảnh sinh<br /> thiết mô VTMT sau ghép TBGM 15 ngày.<br /> Tăng sinh nguyên bào sợi (a), các nguyên<br /> bào sợi tăng chế tiết collagen, sợi collagen<br /> nằm song song với thành tế bào (b). Hiển vi<br /> điện tử truyền qua. Phóng đại 3.000 lần.<br /> BN Trần Thị S (số BA: 1506)<br /> <br />