Đặc điểm mô bệnh học của mô ung thư phổi Lewis được ghép trên chuột thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA MÔ UNG THƢ PHỔI LEWIS<br /> ĐƢỢC GHÉP TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM<br /> Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Thái Biềng*<br /> Hồ Anh Sơn*; Phạm Xuân Phong**; Nguyễn Lĩnh Toàn*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá đặc điểm hình thái mô bệnh học của mô ung thư phổi (UTP) được ghép<br /> trên chuột thực nghiệm. Đối tượng và phương pháp: ghép tế bào (TB) UTP chuột Lewis vào<br /> dưới da đùi phải chuột nhắt trắng BALB/c, đánh giá hình ảnh giải phẫu bệnh bằng nhuộm HE.<br /> 7<br /> Kết quả: 15 chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 2 x 10 TB ung thư với tỷ lệ thành công<br /> 100%. Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm HE 4 tuần sau gây u cho thấy mô u có hình ảnh ung thư<br /> biểu mô TB kém biệt hóa. Kết luận: hình ảnh ung thư biểu mô TB kém biệt hóa trên đùi chuột.<br /> * Từ khóa: Tế bào ung thư phổi chuột Lewis; Chuột nhắt trắng BALB/c; Mô bệnh học; Hình<br /> thái vi thể.<br /> <br /> Histopathological Features of the Lewis Lung Cancer Cell Inoculated<br /> in Experimetal Mouse<br /> Summary<br /> <br /> Objectives: Evaluation of histopathological features of the lewis lung cancer tissue<br /> inoculated in experimental mouse. Subjects and methods: Mouse Lewis lung cancer cells<br /> were injected in 15 BALB/c mice in the right thigh and tumor tissue was stained by HE.<br /> 7<br /> Results: 15 mice developed tumors following inoculation of 2 × 10 cancer cells for each<br /> mouse, the successful rate reached 100.00%. After 4 weeks of the experiment,<br /> micromorphology of HE stained specimen showed the images of poorly differentiated<br /> carcinoma. Conclusion: the images of poorly differentiated carcinoma in mice thigh.<br /> * Key words: Lewis lung cancer cells; BALB/c mouse; Histopathology; Micromorphology.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất<br /> trên toàn cầu, số ca mắc mới mỗi năm tăng trung<br /> bình 0,5%. Tỷ lệ mắc UTP rất khác biệt ở các<br /> nước, ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 178.000 trường<br /> hợp mắc mới và 160.000 ca tử vong do UTP.<br /> Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc<br /> <br /> tế, năm 2008 tình hình UTP ở Việt Nam<br /> đứng hàng thứ hai với 20.659 ca mắc<br /> mới và 17.783 ca tử vong [2]. Mặc dù, có<br /> <br /> nhiều phương pháp điều trị UTP, nhưng<br /> hiệu quả chưa cao [5, 6]. Để góp phần<br /> nghiên cứu tác dụng nâng cao hiệu quả<br /> điều trị UTP và đáp ứng yêu cầu nghiên<br /> cứu tiền lâm sàng UTP, chúng tôi tiến<br /> hành thí nghiệm nhằm: Đánh giá đặc<br /> điểm hình thái mô bệnh học của mô<br /> UTP được ghép trên chuột thực<br /> nghiệm.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Viện Y học Cổ truyền Quân đội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhonhp@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 12/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/02/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 03/03/2015<br /> <br /> 130<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> trường Ham's F-12K, đếm số lượng TB/ml,<br /> sau đó đưa về nồng độ chuẩn 108 TB/ml.<br /> <br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu, chất liệu<br /> nghiên cứu.<br /> <br /> - Ghép TB ung thư vào chuột: chuột<br /> được cạo sạch lông vùng đùi sau bên<br /> phải, cố định và tiêm 0,2 ml dung dịch TB<br /> vào dưới da đùi phải (tiêm 2 x 107 TB<br /> UTP/chuột).<br /> <br /> * Đối tượng, vật liệu nghiên cứu:<br /> - TB ung thư phổi chuột Lewis (mã<br /> LLc1/ LL/2; ATCC, Hoa Kỳ).<br /> - Chuột nhắt trắng BALB/c 8 - 10 tuần<br /> tuổi, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm (Charles<br /> River Laboratories, Hoa Kỳ).<br /> - Nuôi động vật nghiên cứu trong điều<br /> kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày<br /> trước khi tiến hành ghép TB, đảm bảo<br /> thức ăn và nước uống theo nhu cầu.<br /> * Dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu:<br /> - Môi trường nuôi cấy TB ung thư EMEM<br /> (eagle's minimal essential medium), FBS<br /> (fetal bovine serum) 10%; dung dịch penicillin<br /> và streptomycin 1%; trypsin-EDTA (Invitrogen<br /> GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức).<br /> - Hệ thống phòng thí nghiệm phục vụ<br /> nuôi cấy TB: phòng sạch, tủ ấm CO2, kính<br /> hiển vi soi ngược, máy ly tâm, tủ mát 40C,<br /> tủ âm -200C, -800C, bình chứa nitơ lỏng…<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> * Nuôi cấy và ghép TB ung thư vào chuột:<br /> - Nuôi cấy TB: TB UTP chuột Lewis<br /> trong môi trường EMEM, bổ sung FBS<br /> 10%, penicillin và streptomycin 1%. TB<br /> được nuôi cấy tăng sinh ở điều kiện nhiệt<br /> độ 370C, nồng độ CO2 5% và thay môi<br /> trường 2 lần mỗi tuần. Mỗi chai nuôi cấy<br /> có diện tích 75 cm2. Khi TB phát triển đạt<br /> 80% diện tích chai nuôi, tiến hành cấy<br /> chuyển sang chai nuôi cấy mới với tỷ lệ 1:3.<br /> - Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước<br /> khi tách được rửa 2 lần bằng dung dịch<br /> PBS 1X, sau đó tách bằng dung dịch<br /> trypsin-EDTA 1X. Cho thêm 2 - 3 ml môi<br /> 131<br /> <br /> * Theo dõi và xác định sự hình thành<br /> khối ung thư trên chuột:<br /> Đánh giá khối u, theo dõi sự phát triển<br /> tại vị trí tiêm (đùi phải), xác định kích<br /> thước khối u: đo khối u theo hai kích<br /> thước dài x rộng bằng thước chính xác<br /> NSK 2 lần/tuần. Đưa chuột xuất hiện khối<br /> u vào nghiên cứu. Ghi số liệu kích thước<br /> khối u và diễn biến toàn trạng của chuột<br /> mang u vào hồ sơ của mỗi chuột. Thể tích<br /> khối u [3, 4] được tính theo công thức:<br /> V = (D x R2) x 0,5<br /> Trong đó:<br /> + V: thể tích khối u (mm3).<br /> + D: chiều dài đo được của khối u (mm).<br /> + R: chiều rộng đo được của khối u (mm).<br /> - Theo dõi trọng lượng chuột 2 lần/<br /> tuần, xác định biến đổi trọng lượng chuột<br /> giữa các lần cận kế tiếp.<br /> * Xác định hình thái vi thể khối ung thư<br /> trên chuột:<br /> - Sau 4 tuần, tiến hành giết chuột, bóc<br /> tách khối u, bảo quản trong dung dịch<br /> formalin 10%, trong 24 - 48 giờ. Tiếp<br /> theo, đúc khối paraffin khối u, cắt lát dày<br /> 5 µm, nhuộm HE (hematoxylin eosin).<br /> - Đọc, phân tích hình thái vi thể mô và<br /> tạng dưới kính hiển vi quang học. Kỹ<br /> thuật tiến hành tại Khoa Giải phẫu Bệnh<br /> lý, Bệnh viện Quân y 103.<br /> * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm<br /> SPSS 15.0.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Tình trạng toàn thân chuột trong quá trình thí nghiệm.<br /> Sau khi ghép TB Lewis, chuột vẫn ăn uống, hoạt động bình thường, nhanh nhẹn,<br /> lông mượt, mắt trong, hậu môn khô, không thấy biểu hiện đi lỏng. 2 chuột bị chết do<br /> khối u có kích thước lớn (vào ngày thứ 22 và 29 sau tiêm TB). Sau 29 ngày thí<br /> nghiệm, tỷ lệ chuột sống 86,67%.<br /> Bảng 1: Trọng lượng cơ thể chuột nghiên cứu (g).<br /> NGÀY<br /> <br /> N1<br /> <br /> N8<br /> <br /> N15<br /> <br /> N22<br /> <br /> N29<br /> <br /> 15<br /> <br /> 15<br /> <br /> 15<br /> <br /> 14<br /> <br /> 13<br /> <br /> 27,39 ± 5,88<br /> <br /> 27,53 ± 6,14<br /> <br /> 27,09 ± 5,60<br /> <br /> 28,96 ± 5,22<br /> <br /> 30,58 ± 6,56<br /> <br /> THÔNG SỐ<br /> <br /> n<br /> X ± SD<br /> <br /> Chuột có trọng lượng ít thay đổi trong 15 ngày đầu sau ghép TB ung thư. Sau đó,<br /> trọng lượng chuột tăng đều đến thời điểm kết thúc thí nghiệm.<br /> 2. Kích thƣớc khối u<br /> Bảng 2: Thể tích trung bình khối u (mm3).<br /> NGÀY<br /> THÔNG SỐ<br /> n = 15<br /> X ± SD<br /> <br /> N1<br /> <br /> N4<br /> <br /> N8<br /> <br /> N11<br /> <br /> N18<br /> <br /> N22<br /> <br /> N29<br /> <br /> 0<br /> <br /> 03/15<br /> <br /> 09/15<br /> <br /> 15/15<br /> <br /> 14/15<br /> <br /> 13/15<br /> <br /> 09/15<br /> <br /> 0<br /> <br /> 56,17 ±<br /> 45,26<br /> <br /> 143,76<br /> ± 112,60<br /> <br /> 529,39<br /> ± 293,84<br /> <br /> 1.329,92<br /> ± 980,34<br /> <br /> 1.508,12 ±<br /> 1.422,94<br /> <br /> 3.431,05 ±<br /> 3.346,79<br /> <br /> Sau khi tiêm TB Lewis khoảng 3 ngày, tại chỗ tiêm bắt đầu thấy xuất hiện khối u và<br /> có thể đo được, 3/15 chuột có khối u. Số lượng chuột có u và kích thước khối u tăng<br /> dần lên. Sau khi tiêm TB 10 ngày, cả 15 chuột có khối u, đạt tỷ lệ 100%. Kích thước<br /> khối u tăng liên tục từ sau ghép TB đến thời điểm kết thúc thí nghiệm.<br /> 3. Hình ảnh đại thể khối UTP ghép trên chuột thực nghiệm.<br /> Sau khi tiêm TB Lewis khoảng 3 ngày, tại chỗ tiêm bắt đầu thấy xuất hiện khối u ở<br /> vùng đùi phải.<br /> <br /> Hình 1: Khối u xuất hiện sau 3 ngày tiêm TB Lewis và tăng kích thước nổi rõ dưới da<br /> đùi chuột (phải) sau 15 ngày.<br /> 132<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> Hình 3: TB u xâm lấn vào cơ vân (trái) và<br /> vùng hoại tử (phải).<br /> Hình ảnh giải phẫu bệnh cho thấy khối TB<br /> ung thư nằm dưới da và xâm lấn vào mô cơ<br /> vân (hình 3, trái). Vùng trung tâm khối u bị<br /> Hình 2: Hoại tử khô tại chỗ khối u (trái) và<br /> <br /> hoại tử với hình ảnh TB thoái hóa, mất cấu<br /> <br /> hoại tử ướt tại chỗ khối u<br /> <br /> trúc màng, hoại tử ở các giai đoạn khác nhau<br /> <br /> sau 15 - 21 ngày.<br /> <br /> (hình 3, phải).<br /> <br /> Khi phát triển lớn, khối u nổi rõ, bám chắc<br /> vào khối cơ đùi, ít di động (hình 1). Một số<br /> khối u có dấu hiệu tím, loét, xuất huyết dưới<br /> da, hoại tử khô. Một số khối u loét, hoại tử<br /> ướt, rò mủ ra ngoài (hình 2).<br /> 4. Đặc điểm vi thể khối u đùi trên chuột<br /> nhắt trắng BALB/c.<br /> Sau 4 tuần gây u, tiến hành giết chuột, lấy<br /> tiêu bản làm mô học (nhuộm HE) và quan sát<br /> trên kính hiển vi quang học.<br /> <br /> Hình 4: Hình ảnh nhân quái, nhân chia bất<br /> thường.<br /> Hình ảnh các TB biểu mô tăng sinh mạnh,<br /> sắp xếp sát nhau, ranh giới TB không rõ. Các<br /> TB u có nhân tròn hoặc bầu dục, tăng sắc,<br /> nhiều TB có hạt nhân to, rõ. Mật độ nhân chia<br /> cao, nhiều nhân chia bất thường. Bào tương<br /> hẹp, một số bào tương có nhánh. Đây là hình<br /> ảnh ung thư biểu mô kém biệt hóa.<br /> <br /> 133<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Kết quả nghiên cứu hình thái mô bệnh học<br /> của mô UTP được ghép trên chuột thực<br /> nghiệm có hình ảnh của ung thư biểu mô kém<br /> biệt hóa. Điều này có ý nghĩa làm tiền đề cho<br /> nghiên cứu đặc tính sinh học hình thành và<br /> phát triển khối u, từ đó tiếp tục nghiên cứu<br /> nhằm tìm ra các dược chất cũng như phương<br /> pháp trị liệu ung thư mới trong điều trị UTP<br /> trên thực nghiệm.<br /> Chúng tôi lựa chọn phương pháp tiêm TB<br /> ung thư vào tổ chức dưới da chuột là cách<br /> làm khá phổ biến, được các tác giả thực hiện<br /> trước đây [1, 3, 5]. Tiêm TB ung thư dưới da<br /> tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát khối<br /> u bằng mắt thường và đo trực tiếp bằng<br /> thước kẹp. Bằng phương pháp này, chúng tôi<br /> đã ghép thành công TB UTP chuột Lewis vào<br /> chuột nhắt trắng BALB/c. Sau ghép, TB Lewis<br /> có thể phát triển tốt trên cơ thể động vật để<br /> tạo thành khối u với tỷ lệ thành công rất cao<br /> (100%) ngay tại vị trí ghép dưới da vùng đùi<br /> phải. Mô hình này có ưu điểm là được tiến<br /> hành trên chuột BALB/c, chi phí thấp, kỹ thuật<br /> tiến hành đơn giản, không cần gây mê động<br /> vật, khối u có thể phát triển, dễ dàng can thiệp<br /> vào khối u để điều trị và đo kích thước, thời<br /> gian theo dõi ngắn hơn. Tuy nhiên, trong<br /> nghiên cứu này, chúng tôi phải ghép với số<br /> lượng TB nhiều hơn so với ghép TB trước<br /> đây [1, 3] do chuột khỏe mạnh nên có tỷ lệ<br /> thoái u khá cao [7]. Việc ghép thành công TB<br /> UTP chuột Lewis vào chuột BALB/c đã cung<br /> cấp thêm một mô hình ung thư trên động vật<br /> có hệ miễn dịch đầy đủ. Kết quả này có ý<br /> nghĩa trong việc lựa chọn giống chuột để gây<br /> mô hình ung thư cũng như thời điểm lựa chọn<br /> đánh giá hiệu lực điều trị hoặc các thử nghiệm<br /> mới.<br /> <br /> Sau khi ghép TB UTP chuột Lewis, hình<br /> ảnh giải phẫu bệnh của tổ chức u là hình ảnh<br /> ung thư biểu mô kém biệt hóa. Với các biểu<br /> hiện khối TB ung thư nằm dưới da và xâm lấn<br /> mô cơ vân. U có cấu trúc gồm các TB biểu mô<br /> tăng sinh mạnh, sắp xếp sát nhau, ranh giới<br /> TB không rõ, TB có hình ảnh nhân quái, nhân<br /> chia bất thường. Trung tâm khối u có vùng bị<br /> hoại tử.<br /> <br /> 134<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Nguyễn Lĩnh Toàn, Hồ Anh Sơn, Bùi Khắc<br /> Cường. Xây dựng mô hình UTP người. Tạp chí Y Dược học Quân sự, Số chuyên đề KC.10. 2012,<br /> tr.25-30.<br /> 2. Khánh Thị Nhi và CS. Đánh giá tác dụng của<br /> thuốc tiêm liposome doxorubicin trên chuột nude<br /> mang khối ung thư tiền liệt tuyến người. Tạp chí Y<br /> - Dược học Quân sự. 2013, 38 (8), tr.19-23.<br /> 3. Đỗ Thị Thảo và CS. Gây u thực nghiệm trên<br /> chuột bằng DMBA (7,12 Dimethyl benz[A]<br /> anthracene). Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công<br /> nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2009, 25, tr.107111.<br /> 4. Ferlay J, Shin HR, Bray F et al. Estimates of<br /> worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN<br /> 2008. Int J Cancer. 2010, 127 (12), pp.2893-2917.<br /> 5. Jiang Li, Michael R Johnston. Experimental<br /> animal models for studying lung cancers (abstract). Lung<br /> Cancer Metastasis. 2010, pp.241-265.<br /> 6. National Collaborating Centre for cancer.<br /> The.diagnosis.and.treatment.of lung.cancer(upd<br /> ate) - Full guideline. 2011, p.1.<br /> 7. Nguyen Thai Bieng et al. Establishment of<br /> mouse lewis lung cancer on mouse model. Journal<br /> of Military Pharmaco-medicine. 2014, 39 (7)<br /> inprogress.<br /> <br />