Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

Chia sẻ: Nguyễn Duy Khanh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

151
lượt xem 37
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP Đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2
MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ........................................................................................... 3 PHẦN NỘI DUNG ....................................................................................... 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................ ...................... 6 1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC ................................ 6 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum .................................................... 7 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 15 2.1. Vật liệu ................................................................................................. 15 2.1.1. Vật liệu chính ................................................................ .................... 15 2.1.2. Hoá chất và thiết bị........................................................................... 15 2.1.2.1. Hoá chất ......................................................................................... 15 2.1.2.2. Thiết bị ........................................................................................... 25 2.1.3. Môi trường ........................................................................................ 16 2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1) ................................................ 16 2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)................................ .......... 16 2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng ................................. 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 17 2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN 2 17 2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN 2 trên môi trường thạch nghiêng ................................................................................. 27 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum B HN 2 ............................................................................ 27 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN 2 ................................................... 18
KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CH ỌN Đ Ề TÀI Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồ m các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đ ặc tính vượt trộ i với độ dẻo dai, bề chắc.[17] Trên thế giới màng Bacterial cellulose đ ã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng d ụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏ ng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ d ưỡng da cho con người.[13 ] Ở V iệt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở m ức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ d ừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như m ới chỉ dừng lại ở đ iều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đ ại họ c Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người.
V ới mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN 2 ” 2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài - N ghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A. xylinum BHN 2 phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm. - K hảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuẩn A. xylinum BHN 2 . - Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo màng BC được tốt nhất. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệ t độ nuôi cấy đ ến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN 2 . - Nghiên cứu mộ t số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng A. xylinum BHN 2 từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng.
PHẦN NỘ I DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC 1.1.1. Phân loại và đặ c điểm hình thái của A. Xylinum Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc giố ng Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21] A. xylinum có d ạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể d i động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗ i. H ình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN2 K huẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5mm), tròn, bề m ặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồ i lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.[18]
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum V i khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25 -350C, pH = 4-6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế b ào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tố i ưu. A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.[12] Các đặc điểm sinh hoá dùng đ ịnh danh của A. xylinum bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính; K hông tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose.[12] 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A. xylinum hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp b ởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọ i là màng Bacterial cellulose hay màng BC. * Cấu trúc của màng Bacterial cellulose: Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). D ải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 -9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những d ải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏ ng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15 ] Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (kho ảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn. Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu đầu tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose.[22] 1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum 1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose N guồn cacbon có ảnh hưởng m ạnh m ẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ N guyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là glucose. Để tạo màng phục vụ m ục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Q uỳnh đã quyết định sử d ụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng A. xylinum BHN 2 .[14] 1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO 4
V i sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào. Nhân tố (NH 4)2SO4 là mộ t trong những nhân tố có ảnh hưởng lớn đến sự p hát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồ n nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất.[14] 1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4.7H2O MgSO 4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị K im Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC.[14] 1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có vai trò hết sức quan trọ ng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO 4 sẽ cho sản lượng BC cao nhất.[14] 1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấ y đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩ n A.xylinum 1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống. Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn.
Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng. V ì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các tế b ào liên kết với phân tử glucose đ ể hình thành lớp màng BC trên bề mặt nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho phù hợp có ý nghĩa quan trọng đ ể thu được màng BC với năng suất cao nhất. Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ giố ng và thời gian lên men.[14] 1.3.2. Độ thông khí V i khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí b ắt buộc. Điều kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ thông khí quyết đ ịnh năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và sử dụng cánh khuấy trong lên men độ ng là phù hợp cho sản lượng BC cao trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng d ụng cụ có bề m ặt rộng, thoáng và lớp môi trường mỏng.[19] Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất
oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC.[20] 1.3.3. Nhiệt độ 0 N hiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25-30 C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt độ ng và đ ến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.[21 ] 1.3.4. Độ PH V i khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21 ] 1.4. Ứng dụng của màng BC 1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồ i, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đ ầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề m ặt tiếp xúc lớn hơn bộ t gỗ thường, bề dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh họ c, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, m ỹ phẩm, b ảo vệ môi trường, công nghiệp.[22] 1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng Bỏng là mộ t tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
N goài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại di chứng nặng đến khả năng vận độ ng, thẩm m ỹ và sức khỏ e của người bệnh. Ở V iệt Nam, chỉ riêng Viện Bỏ ng Quố c gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏ ng chủ yếu là bỏng nước sôi. N goài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.[6] V iệc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đ ặc biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏ ng có tác d ụng làm giảm đau ngăn ch ặn các biến chứ ng nhiễ m khu ẩn, tạo điều kiện tố t cho q uá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại chỗ có tác dụng lớn trong việ c điều trị dự phòng các biến chứ ng c ủa nhiễm khuẩn tạ i chỗ , không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừ a sự m ất nư ớc và dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), lo ại bỏ nhanh các tổ chức ho ại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình thành sẹo, chuẩn bị tố t nền ghép da trong phẫu thuật.[6] 1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới 1.5.1. Trên thế giớ i N ghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên th ế giới. Tác giả Brown, 1989, dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh họ c, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đ ặc biệt Brown (1989) đã dùng BC làm vải đặc biệt, Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006)
dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay cho sắc kí.[5 ] Tuy nhiên, những ứng d ụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và m ỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997), Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs, (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏ ng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đ ã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm m ặt nạ dưỡng da cho p hụ nữ.[5] 1.5.2. Ở Việt Nam Tại Việt Nam tình hình điề u trị b ỏng trong nư ớc ngày càng đư ợc cải tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng trị bỏ ng như màng ố i, trung bì da lợn, da ế ch, màng chitosan, sử d ụng các c hất có n guồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả N guyễn Văn Thanh và cộng sự đ ã có mộ t số công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏ ng ở Việt Nam.[9] Đ iều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã đ ược áp d ụng từ rất lâu và phổ b iến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết thương, vết loét… Màng BC có nhiều ưu điể m để trở thành chất mang các hợp chất có nguồ n gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.[14 ]
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài Luậ n văn thạc sĩ vi sinh học 2 009 : “Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như Q uỳnh- ĐHSP Hà Nộ i đã làm đ ược một số vấn đề sau: - Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN 2. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đ ến quá trình lên men tạo màng BC của chủng A.xylinum BHN2, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp cho chủng A.xylinum BHN2 lên men tĩnh. + Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ 4,5- 5,5. + Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH4)2SO 4: 2 g/l; KH2PO 4: 2 g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l. - Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng A.xylinum BHN2 tạo màng tốt nhất. - Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏ ng và khảo sát các đặc tính của màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí 120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm2/24 giờ; màng không có triệu chứng kích ứng. - Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điều trị.
CHƯƠNG 2 : VẬ T LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu chính Đối tượng nghiên cứu là các chủng A. xylinum BHN 2 được p hòng thí nghiệm Thực vật - V i Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp. 2.1.2. Hoá chất và thiết bị 2.1.2.1. Hoá chất - N guồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose, D ihyroxyaceton, Axit acetic. - N guồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH 4)2SO 4 - Các muố i khoáng: KH4PO 4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaOH, CuSO4. - Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô. - Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol. - Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol. - N goài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả. 2.1.2.2. Thiết bị Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức). Nồi hấp Tommy (Nhật). Máy so màu UV – vis ( Nhật). Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ). Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh). Máy li tâm Sorvall (Mỹ). Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20 l – 10ml.
K ính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40. Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ). Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đ èn cồn… 2.1.3. Môi trường 2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH 2PO4: 2 g MgSO 4.7H 2O: 2 g CaCO 3 : 10g Agar: 20g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước máy: 1000ml. 2.1.3.2 . Môi trường nhân giống cơ bản (MT2) Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH 2PO4: 2 g MgSO 4.7H 2O: 2 g Pepton: 4g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước máy: 1000ml. 2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng Glucose: 20 g (NH4)2SO4: 3 g KH 2PO4: 2 g MgSO 4.7H 2O: 2 g Cao nấm men: 3g Pepton: 4g Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng). Nước dừa: 1000ml.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN 2 G iống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ. 2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN 2 Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách b ổ sung vào môi trường lên men 5% giống đã ho ạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10 ngày. 2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN 2 trên môi trường thạch nghiêng Các chủng giống sau khi nhận từ p hòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 – 4 ngày ở 30 0C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 4 0C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ giố ng trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4] 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum B HN 2
2.2.4.1 . Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhấ t từ chủng A. xylinum BHN 2 S: diện tích b ề mặt lên men tạo màng BC (cm2) V : thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3) V ới phương pháp cố định diện tích bề m ặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng A.xylinum BHN 2 , chúng tôi tiến hành theo các bước sau: - Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đổ i thể tích từ đơn vị ml sang đơn vị cm3. Sau đó tính tỷ lệ S/V. + D ụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15 x 10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là S= 15 x 10= 150 (cm2). + Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì ta phải quy đổ i ml sang cm3. Ta đ ã biết 1ml=1cm 3. Ta có bảng sau:
Bảng 1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu S (cm2) V ( ml =cm3) S/V (cm -1) 150 150 1,0 150 167 0 ,9 150 187.5 0 ,8 150 215 0 ,7 150 250 0 ,6 150 300 0 ,5 - Bước 2 : Tiến hành lên men b ề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN 2 với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ d ai, cân nặng, trọng lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất. 2.2.4.2 . Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC Độ chịu kéo(độ dai)(tensile strenght): Lực kéo lớn nhất mà m ẫu thử . chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu chuẩn.[14] Độ bền kéo (độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σk. Đ ộ bền kéo được ứng dụng rất nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng, khoa học vật liệu.[14 ]
Đ ể xác định độ d ai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là N- N iutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách: + Cố đ ịnh đầu trước của màng + Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố đ ịnh vào đ ầu sau + Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N . 2.2.4.3 . Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đ ến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tố t nhất. 2.2.4.4 . Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. x ylinum BHN 2 Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-40 0C đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN 2 theo các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọ ng lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng BC tốt nhất.