Đề Tài: Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện ASPERGILLUS FLAVUS sinh độc tố AFLATOXIN trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang

Chia sẻ: Pham Ngoc Linhdan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:109

Thêm vào BST

Báo xấu

192
lượt xem 65
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố Aflatoixin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp những dẫn liệu kho học về những sự tồn tại và khả năng có hoặc không có sinh độc tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề Tài: Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện ASPERGILLUS FLAVUS sinh độc tố AFLATOXIN trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ THANH TRANG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ASPERGILLUS FLAVUS SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRÊN NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 4240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÝ THỊ THANH LOAN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2009
i L ỜI C Ả M Ơ N Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. LÝ THỊ THANH LOAN Giám Đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ Cô là người đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, những bài học thật bổ ích giúp em phát triển trong công việc và trong nghiên cứu khoa học, là người luôn động viên và tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành luận văn này. Em xin chúc Cô thật nhiều sức khỏe để tiếp tục niềm đam mê nghiên cứu khoa học của mình và luôn tìm thấy niềm vui trong công việc và cuộc sống. Tiếp đến tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học. Xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong khoa sinh học đã tận tình giảng dạy trong suốt thời gian học đại học và cao học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM. Xin cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng, anh vừa là một người thầy vừa là một người cấp trên thật đáng quý. Anh đã luôn động viên, định hướng cho những người trẻ như chúng em có thêm nghị lực phấn đấu vươn lên trong học tập cũng như trong công việc. Cảm ơn các Anh, Chị, các bạn và các em đang làm việc tại Phòng Kiểm nghiệm Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Trung tâm Kỹ thuật 3, Viện Pasteur Tp.HCM, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin cảm ơn Anh đã luôn động viên em để em có thể vượt qua những khó khăn trong cuộc sống. Con cũng xin cảm ơn gia đình đã luôn khuyến khích và hỗ trợ để con có được ngày hôm nay.
ii MỤC LỤC Lời cảm ơn--------------------------------------------------------------------------------------i Mục lục------------------------------------------------------------------------------------------ii Danh mục chữ viết tắt ------------------------------------------------------------------------ iv Danh mục Bảng --------------------------------------------------------------------------------v Danh mục Hình ----------------------------------------------------------------------------- viii MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................5 1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu ......................................................................5 1.1.1. Hình thái:.............................................................................................5 1.1.2. Sinh thái ..............................................................................................5 1.1.3. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh..................................8 1.1.4. Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: ...........13 1.2. Tổng quan về Aflatoxin .................................................................................16 1.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin [8]:.........................................................16 1.2.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8] ......16 1.2.3. Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên: ............17 1.2.4. Tác hại của Aflatoxin:.......................................................................19 1.2.5. Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]: ...........................................................................................................24 1.3. Phương pháp phát hiện A. flavus ....................................................................27 1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]:.............................................27 1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]: ..................................28 1.4. Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] .........................................................30 1.4.1. Đặc tính .............................................................................................30 1.4.2. Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin .......................................32 1.4.3. Đặc điểm của phức bao cyclodextrin ................................................33 1.4.4. Ứng dụng của phức bao: ...................................................................35 1.4.5. Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15]............................35 1.5. Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14] .37 1.5.1. Giới hạn phát hiện .............................................................................37 1.5.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả .......37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................38 2.1. Vật liệu:..........................................................................................................38 2.1.1. Chủng chuẩn Aspergillus và mẫu thực phẩm.........................................38 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính........................................................................39 2.1.3. Môi trường và hóa chất ...........................................................................40 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................40
iii 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị phòng ẩm nuôi cấy mốc [13]..............................40 2.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] ......................41 2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14].......41 2.2.4. Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) để phân tích HPLC [11] .........44 2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phát huỳnh quang của các chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin ..........................................................................44 2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang. ........................45 2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] .......................................47 2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] ......................................48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................51 3.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin (dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang trên môi trường thạch) của một số chủng Aspergillus flavus. ......51 3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện tác động đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus. .....................................................56 3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .............................57 3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .............................61 3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .............................66 3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus:.......................70 3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .........74 3.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: ....................................................................78 3.3. Xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang của Aflatoxin khi kết hợp với cyclodextrin. ............................................80 3.4. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp mới xây dựng. ......................80 3.5. Xác định các thông số phương pháp mới:......................................................85 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ ...................................................................90 4.1. Kết luận ..........................................................................................................90 4.2. Đề nghị: ..........................................................................................................90 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................91 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG...................................................................................94 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ KIỂM TRA AFLATOXIN BẰNG HPLC .......................97 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT ....................................................................98
iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1. ATCC: American Type Collection Culture: Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ. 2. FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations: Tổ chức nông lương thế giới. 3. FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ ): Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ. 4. HPLC: high performance liquid chromatography: phương pháp sắc ký lỏng cao áp 5. ISO: International Organization for Standardization: Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa. 6. NRRL: bảo tàng chủng chuẩn của bộ Nông nghiệp Mỹ 7. TCN: Tiêu chuẩn ngành 8. VTCC: Vietnam Type Collection Culture: Bộ sưu tập chủng chuẩn Việt Nam.
v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ảnh hưởng của chủng A. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra Aflatoxin ------------------------------------------------------------------------------------- 11 Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên sản lượng Aflatoxin-- 12 Bảng 1.3. Qui định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc Aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các Aflatoxin (B1+B2+G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb): ---------------------------------------------- 24 Bảng 1.4. Những quy định mức cho phép Aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO, 1995): ----------------------------------------------------------------------------------------- 25 Bảng 1.5. Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước thuộc EU: ------------------------------------------------------------- 26 Bảng 2.1. Danh mục các chủng A. flavus sử dụng trong nghiên cứu khảo sát chủng có và không có khả năng sinh độc tố Aflatoxin B1 ------------------------------------- 38 Bảng 2.2. Cách sắp xếp tần suất 4 nhóm kết quả:--------------------------------------- 50 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang của các chủng A. flavus ------------------------------------------------------------- 54 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra mối tương quan giữa việc sinh Aflatoxin và việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc A. flavus ------------------------------------------- 56 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 ------------------------------- 58 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 ------------------------------- 59 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 ------------------------------- 60
vi Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 ------------------------ 63 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 ------------------------ 64 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 ------------------------ 65 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 ------------------------------- 67 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 ------------------------------- 68 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 ------------------------------- 69 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 ------------------------ 71 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 ------------------------ 72 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 ------------------------ 73 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 --- 75 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 --- 76 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 --- 77
vii Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus ------------------------------------------------------------------------------------- 79 Bảng 3.19 Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp trên nền mẫu thức ăn dạng hạt ở 03 chủng A. flavus: ---------------------------------------------------------------------------- 81 Bảng 3.20 Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp trên nền mẫu thức ăn dạng bột ở 03 chủng A. flavus ------------------------------------------------------------------------------- 82 Bảng 3.21. Giới hạn phát hiện A. flavus trên nền mẫu thức ăn dạng hạt ------------ 84 Bảng 3.22. Giới hạn phát hiện A. flavus trên nền mẫu thức ăn dạng bột ------------ 84 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát các thông số của phương pháp khi phân tích mẫu bằng phương pháp mới xây dựng và các phương pháp tham chiếu: ------------------------ 87 Bảng 3.24. Các thuộc tính của phương pháp trên nền mẫu thức ăn dạng hạt ------ 88
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái nấm mốc A. flavus----------------------------------------------------- 5 Hình 1.2. Nấm mốc A. flavus trên hạt đậu -------------------------------------------------7 Hình 1.3. Nấm mốc A. flavus trên lạc ------------------------------------------------------7 Hình 1.4. Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (Vitoria, 2001)------------------------------------------------------------------------------------------- 17 Hình 1.5. (a) A. flavus trên môi trường AFPA, sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau môi trường thành màu cam. -------------------------- 28 (b) A. flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A. flavus ----- 28 Hình 1.6. Cyclodextrin α, β, γ ------------------------------------------------------------- 31 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của phức bao cyclodextrin với phân tử khách thể - 33 Hình 1.8. Mô hình tương tác giữa cyclodextrin và Aflatoxin dạng HINT/GOLD - 36 Hình 1.9. Bản đồ đường mức cực kỵ nước của AFB1, phần kỵ nước màu xanh lá và phần hiếu nước màu xanh da trời---------------------------------------------------------- 36 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình gây nhiễm bào tử nấm mốc vào mẫu---------------------- 43 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp ----------- 48 Hình 3.1. Khuẩn lạc A. flavus trên SAB sau 3 ngày------------------------------------ 52 Hình 3.2. Hình thái A. flavus (thân nhám) ----------------------------------------------- 52 Hình 3.3. Bào tử A. flavus ------------------------------------------------------------------ 52 Hình 3.4. Bọng hình chùy đến cầu A. flavus -------------------------------------------- 52 Hình 3.5. Chủng A. oryzae không phát huỳnh quang (trái), nấm A. flavus phát huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày ở 28oC ----------------------------------------------------------------------------------------- 53
ix Hình 3.6. Chủng A. ochraceus không phát huỳnh quang (trái), chủng A. flavus phát huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày ở 28oC ----------------------------------------------------------------------------------------- 53 Hình 3.7. Chủng A. flavus phát huỳnh quang trên cả hai đĩa thạch YES (bên trái không bổ sung và bên phải có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin) trong 3 ngày ở 28oC-------------------------------------------------------------------------------------------- 62 Hình 3.8. Chủng A. flavus phát huỳnh quang trên đĩa thạch YES có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin (phải), không phát huỳnh quang trên PDA có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin (trái) trong 3 ngày ở 28oC -------------------------------------- 62
1 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU Hiện nay, chất lượng thực phẩm được quan tâm nhiều bởi có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Có rất nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá trị dinh dưỡng, vấn đề an toàn thực phẩm được đặc biệt chú trọng, trong đó nhiễm các chất gây hại cho người như các độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim lọai nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, dư lượng phân bón,… Trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao, điều kiện bảo quản trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm gây ảnh hưởng đến chất lượng lương thực thực phẩm cung cấp cho người dân. Trong điều kiện như vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư. Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin B1 (AFB1). Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus, mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1 (AFB1) chủ yếu do loài Aspergillus flavus sinh ra có độc tính rất cao (Nabil Saad, 2004; Victoria, 2001; Roberts, 2002) [8]. Các loài động vật, kể cả con người, nếu ăn phải thức ăn có chứa AFB1, hoặc sử dụng nguyên liệu, thức ăn có nguồn gốc từ ngũ cốc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có thể nguy hại đến tính mạng. Trong khi hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng. Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]. Phương pháp phân tích định danh loài nấm mốc Aspergillus flavus hiện nay chủ yếu dựa vào các đặc tính hình thái như: Tiêu chuẩn ngành y tế 52 TCN – TQTP 0001:2003: “Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm” [1] dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào để định danh. Tuy nhiên, đối với phương pháp định danh dựa vào hình thái và màu sắc thì rất khó phân biệt với loài HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
2 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU Aspergillus oryzae mà chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai loài này. Do đó, để kiểm soát được chất lượng nông sản, các nhà quản lý cần kiểm soát cả hai yếu tố : sinh học - có nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus hay không và yếu tố hóa học - có nhiễm độc tố Aflatoxin vượt ngưỡng cho phép hay không từ đó có thể đề xuất những biện pháp kỹ thuật phù hợp nhằm tránh được những nguy hại của các loại ngũ cốc có chứa Aflatoxin. Bên cạnh đó, trên thế giới để kiểm soát chất lượng thực phẩm đã sử dụng quy trình định lượng nấm mốc A. flavus theo hướng dẫn của FAO 1414-1992 chủ yếu cũng dựa trên đặc điểm hình thái để phân lập định danh [10]. Gần đây, nhóm tác giả Fente C.A., Jaimez Ordaz J., B. I., Vázquez C. M. (2001) [11] đã nghiên cứu đưa ra phương pháp mới dùng để sàng lọc các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng cách thêm cyclodextrin vào môi trường nuôi cấy nấm mốc để kích thích sự phát huỳnh quang của Aflatoxin. Sự phát huỳnh quang được quan sát trực tiếp trên môi trường nuôi cấy dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm. Khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin có được là do sự hình thành cấu trúc dị vòng 5 bị oxi hóa. Cyclodextrin là những phân tử được hình thành do phản ứng của enzyme cyd – transglycolase lên dextrans. Các phân tử cyclodextrin có các kích thước khác nhau [cyclodextrin chứa 6- 8 đơn phân glucose liên kết với nhau bằng liên kết (1-4) do đó chúng được gọi là -, -, or -cyd]. Các phân tử này được dùng để làm tăng khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin. Với cơ sở lý thuyết nêu trên và với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin, được sự đồng ý của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang” HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
3 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU * Mục tiêu của đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố Aflatoxin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp những dẫn liệu khoa học về những sự tồn tại khả năng có hoặc không có sinh độc tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả. * Luận điểm mới của đề tài: Ở nước ta hiện nay, trong các quy trình phát hiện nấm mốc A. flavus dựa trên đặc điểm hình thái là chủ yếu và do đó chỉ phân biệt được loài mà không phân biệt được khả năng sinh độc tố Aflatoxin của loài đó. Vì vậy, điểm mới của đề tài là xây dựng được phương pháp phát hiện nấm mốc A. flavus trong đó có thể phân biệt được những loài có khả năng sinh độc tố với những loài không có khả năng sinh độc tố. Với đối tượng đã chọn, chúng tôi đã khảo sát các yếu tố tác động đến việc sinh Aflatoxin để đưa ra các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng một phương pháp mới phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin được ghi nhận bằng việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dười đèn UV ở bước sóng 365nm. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành đánh giá, xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp mới theo tiêu chuẩn ISO 16140:2003 [14] trên 2 dạng nền mẫu thức ăn chăn nuôi có cấu trúc khác nhau: dạng hạt và dạng bột làm cơ sở để mở rộng phạm vi áp dụng trên các nền mẫu khác như ngũ cốc dạng hạt và dạng bột… * Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học: - Làm cơ sở để xây dựng phương pháp định danh, định lượng và phân tích nấm mốc trong lương thực thực phẩm, trong thức ăn chăn nuôi. - Làm cơ sở cho việc nghiên cứu sự đa dạng của A. flavus và các loại nấm mốc khác sinh Aflatoxin. HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
4 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN MỞ ĐẦU Ý nghĩa thực tiễn: - Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và hiệu quả hơn so với các phương pháp nuôi cấy hiện nay. - Việc phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin là công cụ quan trọng trong việc kiểm tra, quản lý chất lượng nông sản, lương thực thực phẩm và thức ăn trong chăn nuôi. * Nội dung nghiên cứu Sàng lọc các chủng A. flavus sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các chủng A. flavus sinh Aflatoxin Xây dựng dự thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”. Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp * Nơi thực hiện - Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 - Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. * Thời gian thực hiện: Từ tháng 07/2008 đến tháng 7/2009 HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 5 TỔNG QUAN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Hình thái: Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón cục của tán. Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài. Các thể chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một lớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại [3]. Hình 1.1: Hình thái nấm mốc A. flavus Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng nâu đến hơi lục, hơi sần sùi. Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài A. flavus những loài nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài A. parasiticus thì cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp [3]. 1.1.2. Sinh thái A. flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các chất hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu. Từ lâu, người ta đã phát hiện sự có mặt của nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc Sahara, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì. Người ta còn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước. Đất đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới. Nó thường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì. HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 6 TỔNG QUAN Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này. Nó có rất nhiều trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra... Ngoài ra người ta còn thấy nó trên: hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác... Sự có mặt của các loài này trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô gia súc cũng vậy. Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6m. Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5% [3]. Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát triển của nó, và cũng ở lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất. Người ta ngiên cứu hơn 1.000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc. Còn trên khô lạc: 42% số mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc. Như vậy chất độc tích lũy lại trong khô lạc là do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển mạnh lên [3]. Bào tử của nấm A. flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước, trong đất. Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng. Vì phạm vi ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó khăn. Nấm A. flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn, trên một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng..., trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi bị dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,… Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố Aflatoxin [3]. HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 7 TỔNG QUAN Hình 1.2: Nấm mốc A. flavus trên Hình 1.3: Nấm mốc A. flavus trên lạc hạt đậu Gạo và lạc là nguồn lương thực, thực phẩm rất cần thiết và quan trong đối với con người. Song nếu gạo và lạc không đảm bảo an toàn thì đây lại là nguồn lây nhiễm cho con người những căn bệnh hiểm nghèo, đặc biệt là ung thư gan. Đứng trên góc độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân gây ngộ độc thực phẩm lớn nhất trong gạo và lạc là nấm mốc [4], [6], [7]. Lạc và các sản phẩm từ lạc chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất của A. flavus. Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi kèm với nó, trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật : một số loài Fusarium trong đó có F. monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium citrinum, P. purpurogenum...[4], [6], [7]. Lạc là một loại hạt có nước:7,4%, protein:28%, lipid: 44,5%, glucid: 15%...Các nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong lạc có một loài nấm độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan đến nấm mốc độc đó. Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác nhưng với lạc có thể là môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển. Nấm mốc khi xâm nhập vào trong lạc chúng phát triển làm cho lạc bị mốc xanh hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố Aflatoxin [4], [6], [7]. Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein: 6,6%, nước:10%, lipid: 1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitaminB1: 0,08%. Do đó HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 8 TỔNG QUAN đây là một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp bảo quản không hiệu quả. So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các chất dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại. Đặc biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng của gạo. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài nấm mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay gặp nhất là Aspergillus và Penicilium [4], [6], [7]. 1.1.3. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh Tên Aflatoxin đã được dùng để gọi một hỗn hợp độc tố do Aspergillus flavus sinh ra trước khi bản chất phức tạp của mỗi hợp chất được biết rõ. Thực ra, Apergillus flavus chủ yếu sản sinh ra Aflatoxin B1 và các Aflatoxin khác có bản chất hóa học tương tự gọi là Aflatoxin G1, B2, G2. Trong khi hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng. Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa genotype của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]. 1.1.3.1. Các chủng sinh độc tố : Đã có một số lớn quan sát về tính chất ít nhiều sinh độc tố của nhiều chủng nấm khác nhau: những quan sát này tiến hành trên các cơ chất tự nhiên hoặc trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng về mặt sinh độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Aspergillus flavus và tùy theo nguồn gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94% số chủng sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc, và 71% cũng được phân lập từ lạc như ở Ixraen. Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn đới [3]. HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 9 TỔNG QUAN Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng, người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơ chất và trong những điều kiện như nhau. Người ta đã ghi lại những mức sản sinh từ một vài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất. Gần đây hơn, ngoài việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần của các Aflatoxin đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó là Aflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp [3]. Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái. Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thể bình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố có sự phình to một số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường đặc trưng cho các dòng sản sinh Aflatoxin. Tuy nhiên thường có lẻ rất khó thăm dò biết một cách chắc chắn những chủng có sinh Aflatoxin và những chủng không sinh Aflatoxin ngoài cách dùng con đường sinh học và hóa học [3]. 1.1.3.2. Cơ chất và các điều kiện xung quanh để các chủng A. flavus sản sinh aflatoxin : Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm từ lạc được ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc ở các nước thuộc địa. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố. Ngược lại, gần một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin [3]. Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúng được những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt động. Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm Aspergillus flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp. Nghiên cứu các củ lạc đó, thì phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các Aflatoxin hoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất ít độc HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 10 TỔNG QUAN hơn. Người ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học nhằm tẩy độc các sản vật đã bị hư hỏng [3]. Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nó giảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này tương ứng với sự phân hủy các Aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc mạnh các bình nuôi cấy [3]. Nhìn chung, sự sản xuất Aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường, bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Aspergillus flavus, nó tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẻ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút [3]. Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxin được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tư nhiên. Những biến thiên về nhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45- 50oC cho thấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 25oC [3]. Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh Aflatoxin, gắn liền với sự phát triển tương đối của A. flavus, ở 32oC trên lạc có hàm lượng nước trong khoảng 15 và 30% Aflatoxin hình thành sau 2 ngày. Như vậy, trong điều kiện nhiệt đới, nếu A. flavus phát triển trên lạc không có Aflatoxin thì 48h sau có thể phát hiện được Aflatoxin. Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% hoặc trên ngô 19- 24%, Aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm [3]. Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin. Giá trị pH thích hợp để A. flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5. Hàm lượng khí cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của A. flavus do đó giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí quyển hàm lượng Aflatoxin cũng giảm [3]. Các Aflatoxin được xem là nhạy cảm với ánh sáng, nhưng thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại [3]. HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ