TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br />
<br />
ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO TRONG DỊCH SINH HỌC<br />
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG<br />
Lê Duy Cường1, Trần Thị Chi Mai2<br />
1<br />
<br />
Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec, 2Trường Đại học Y Hà Nội<br />
<br />
Nghiên cứu này nhằm thẩm định quy trình kỹ thuật cải tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh<br />
học bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Các acid amin trong mẫu thử được dẫn xuất bằng AQC<br />
(6 - aminoquinolyl - N - hydroxysuccinimidyl carbamate) để chuyển thành các chất có thể phát hiện được bằng<br />
đầu dò cực tím (UV), phân tách các dẫn xuất AQC của acid amin bằng phương pháp UPLC, định lượng bằng<br />
đầu dò TUV. Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 µmol/L. Khoảng tuyến tính của phương pháp là từ 5<br />
đến 1000 µmol/L. Độ chính xác ngắn hạn CV ≤ 2,4%, độ chính xác dài hạn CV ≤ 3%. Qui trình kỹ thuật cải<br />
tiến định lượng acid amin tự do trong dịch sinh học bằng phương pháp UPLC chính xác và xác thực, có thể<br />
sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị các rối loạn chuyển hoá bẩm sinh.<br />
Từ khoá: acid amin, dịch sinh học, sắc ký lỏng siêu hiệu năng, rối loạn chuyển hoá bẩm sinh<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Định lượng acid amin tự do trong máu và<br />
<br />
thần kinh, bệnh tim mạch, kháng insulin,<br />
<br />
nước tiểu là một công cụ quan trọng trong<br />
<br />
nghiên cứu sinh lý, dược lý, nuôi cấy tế bào<br />
<br />
chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa<br />
<br />
và phân tích giá trị dinh dưỡng ở thực phẩm<br />
<br />
bẩm sinh. Sử dụng phân tích acid amin tự do<br />
<br />
[3; 4; 5].<br />
<br />
trong chương trình sàng lọc sơ sinh đã cho<br />
phép chẩn đoán nhanh một số rối loạn chuyển<br />
hóa bẩm sinh như bệnh phenylceton niệu,<br />
MSUD (maple syrup urine disease), một số rối<br />
loạn trong chu trình urê, bệnh homocystine<br />
niệu [1; 2]. Việc theo dõi cẩn thận và duy trì<br />
nồng độ acid amin trong máu ở mức tối ưu ở<br />
những bệnh nhân này sẽ mang lại những lợi<br />
ích lâu dài trong điều trị. Bên cạnh ứng dụng<br />
trong đánh giá tình trạng dinh dưỡng ở bệnh<br />
nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, định<br />
lượng acid amin tự do trong các dịch sinh vật<br />
khác còn được áp dụng trong một số nghiên<br />
cứu như: tình trạng suy tế bào gan, bệnh lý<br />
ung thư, chuyển hóa cơ, rối loạn dẫn truyền<br />
<br />
Theo các báo cáo từ Khoa Nội tiết và Rối<br />
loạn chuyển hóa Bệnh viện Nhi Trung ương<br />
trong vài năm gần đây, số trẻ mắc các bệnh<br />
rối loạn chuyển hóa bẩm sinh với tỷ lệ 1/5000<br />
trẻ sinh ra, trong đó tỷ lệ tử vong lên đến<br />
48%. Đồng thời việc xét nghiệm chẩn đoán<br />
rất khó khăn, các mẫu bệnh phẩm định lượng<br />
acid amin tự do phải gửi ra nước ngoài dẫn<br />
đến kết quả xét nghiệm rất chậm. Ở Việt<br />
Nam, có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn<br />
chuyển hóa bẩm sinh nhưng không được<br />
chẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến những<br />
di chứng nặng nề [1]. Trên Thế giới, định<br />
lượng acid amin tự do trong máu và nước<br />
tiểu đã được tiến hành từ những năm đầu<br />
thập niên 60 của thế kỷ XX [6; 7]. Phương<br />
<br />
Địa chỉ liên hệ: Lê Duy Cường, Bệnh viện Đa khoa Quốc<br />
tế Vinmec<br />
Email: v.cuongdl@vinmec.com<br />
<br />
pháp phổ biến nhất được sử dụng là sắc ký<br />
trao đổi ion với dẫn xuất hậu cột bằng<br />
<br />
Ngày nhận: 25/7/2016<br />
<br />
ninhydrin. Đây là phương pháp có ưu điểm rẻ<br />
<br />
Ngày được chấp thuận: 18/12/2016<br />
<br />
tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên, sắc ký trao đổi<br />
<br />
62<br />
<br />
TCNCYH 102 (4) - 2016<br />
<br />
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br />
ion có nhược điểm là thời gian phân tích dài<br />
<br />
Mẫu thử được khử protein bằng dung dịch<br />
<br />
(120 phút/mẫu) và đòi hỏi về bảo trì phức tạp<br />
<br />
acid sulfosalicylic (SSA) 10% chứa nội chuẩn<br />
<br />
nên kỹ thuật này trở nên không phù hợp với<br />
<br />
norvaline 250 µM với thể tích tương đương, ly<br />
<br />
các phòng xét nghiệm [2,8,9]<br />
<br />
tâm dung dịch trong thời gian 5 phút ở tốc độ<br />
<br />
Trong những năm gần đây, một phương<br />
pháp mới đã được ứng dụng để thay thế cho<br />
phương pháp sắc ký trao đổi ion: sắc ký lỏng<br />
siêu<br />
<br />
hiệu<br />
<br />
năng<br />
<br />
(Ultraperformance<br />
<br />
liquid<br />
<br />
chromatography - UPLC). So với sắc ký trao<br />
<br />
13000 vòng/phút, thu dịch nổi và tiến hành tạo<br />
dẫn xuất theo quy trình của nhà sản xuất.<br />
Phương pháp phân tích acid amin bao<br />
gồm các giai đoạn sau:<br />
(1) Kiềm hoá mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu<br />
<br />
đổi ion, phương pháp UPLC có ưu thế vượt<br />
<br />
trắng (blank) đã được khử tạp bởi SSA bằng<br />
<br />
trội ở hiệu năng và rút ngắn được thời gian<br />
<br />
dung dịch NaOH/ borat.<br />
<br />
phân tích [8; 9; 10]. Khoa Hóa sinh, Bệnh viện<br />
Nhi Trung ương đã được trang bị hệ thống<br />
<br />
(2) Phản ứng tạo dẫn xuất: Dẫn xuất hoá<br />
<br />
UPLC nhằm phân tích acid amin tự do trong<br />
<br />
các acid amin trong mẫu thử bằng AQC (6 -<br />
<br />
các dịch sinh vật, phục vụ cho việc chẩn đoán,<br />
<br />
aminoquinolyl<br />
<br />
sàng lọc, theo dõi điều trị một số rối loạn<br />
<br />
carbamate) để chuyển các acid amin bậc một<br />
<br />
chuyển hóa bẩm sinh. Để có thể áp dụng thiết<br />
bị UPLC vào phân tích acid amin tự do, cần<br />
<br />
-<br />
<br />
N<br />
<br />
-<br />
<br />
hydroxysuccinimidyl<br />
<br />
và bậc hai thành các chất có thể phát hiện<br />
được bằng đầu dò cực tím (UV).<br />
<br />
phải đánh giá phương pháp trước khi đưa vào<br />
<br />
(3) Phân tách các dẫn xuất AQC của acid<br />
<br />
sử dụng. Do đó, đề tài được tiến hành với<br />
<br />
amin bằng phương pháp UPLC, định lượng<br />
<br />
mục tiêu: Thẩm định quy trình định lượng acid<br />
<br />
bằng đầu dò TUV.<br />
<br />
amin tự do trong máu và nước tiểu bằng<br />
phương pháp UPLC.<br />
<br />
3. Thẩm định phương pháp định lượng<br />
acid amin tự do trong dịch sinh học bằng<br />
<br />
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
1. Trang thiết bị và chất liệu nghiên cứu<br />
<br />
UPLC<br />
- Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp:<br />
Nước cất tinh khiết và chuẩn nồng độ cao<br />
<br />
Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng<br />
(UPLC) Acquity của Waters; Cột sắc ký<br />
MassTrak AAA Column, 1,7 µm 150 x 2,1 mm;<br />
Chuẩn acid amin của Sigma-Aldrich; Thuốc<br />
thử MassTrak AAA tạo dẫn xuất acid amin của<br />
Waters. Pha động A: MassTrak AAA Eluent A<br />
Concentrate, pha loãng 1:10 (8 - 10%<br />
acetonitrile, 4 - 6% formic acid, 84 - 88%<br />
ammonium<br />
<br />
acetate/H2O).<br />
<br />
Pha<br />
<br />
động<br />
<br />
B:<br />
<br />
MassTrak AAA Eluent B đậm đặc (≥ 95%<br />
acetonitrile, ≤ 5% acetic acid).<br />
2. Kỹ thuật định lượng acid amin bằng<br />
UPLC<br />
TCNCYH 102 (4) - 2016<br />
<br />
gần với giá trị trên dự đoán của khoảng phân<br />
tích. Trộn hai mẫu chuẩn trên với các tỷ lệ thể<br />
tích như sau: 1/0, 4/1, 3/2, 2/3, 1/4 và 0/1.<br />
Tiến hành phân tích định lượng các acid amin<br />
trong 6 mẫu trên. Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần.<br />
Tính giá trị trung bình thu được của mỗi mẫu.<br />
Vẽ đồ thị để đánh giá độ tuyến tính bằng phần<br />
mềm được tích hợp trong hệ thống UPLC với:<br />
trục hoành X là nồng độ pha loãng (0%, 20%,<br />
40%, 60%, 80%, 100%), trục tung Y là nồng<br />
độ trung bình đo được mỗi nồng độ qua 3 lần.<br />
Thiết lập phương trình Y = aX + b. Tính hệ số<br />
tương quan R, nếu R2 ≥ 0,99 thì chấp nhận<br />
<br />
63<br />
<br />
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br />
dải giá trị này, nếu không đạt thì phải thu hẹp<br />
2<br />
<br />
dải nồng độ cho đến khi đạt được R ≥ 0,99.<br />
- Khảo sát giới hạn định lượng (LOQ)<br />
LOQ được xác định bằng phân tích các<br />
<br />
bình thường được phân tích trong một lần<br />
chạy, đo lặp lại 10 lần (n = 10), thu thập dữ<br />
liệu và đánh giá độ chính ngắn hạn.<br />
+ Xác định độ chính xác dài hạn (độ tái<br />
<br />
chuẩn ở các mức độ<br />
<br />
lặp): mẫu QC được chạy trong 20 mẻ khác<br />
<br />
khác nhau trong một lần chạy. Pha loãng dung<br />
<br />
nhau (n = 20) trong vòng 3 tháng, trong mỗi<br />
<br />
dịch chuẩn có nồng độ cao nhất để thu được<br />
<br />
mẻ, mẫu QC được đo lặp lại 3 lần, thu thập<br />
<br />
các dung dịch có tỷ lệ pha loãng 2, 4, 8, 16,<br />
<br />
dữ liệu và đánh giá độ chính xác dài hạn.<br />
<br />
dung dịch acid amin<br />
<br />
32, 64 lần. Các chuẩn pha loãng được chạy<br />
<br />
+ Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn<br />
<br />
lặp lại 3 lần trong một mẻ phân tích. Tính SD<br />
<br />
(SD) và hệ số biến thiên (CV) để đánh giá<br />
<br />
và CV, LOQ là giá trị nồng độ thấp nhất mà tại<br />
<br />
độ chính xác ngắn hạn và dài hạn. Tiêu<br />
<br />
đó phương pháp vẫn còn tuyến tính chặt chẽ<br />
<br />
chuẩn chấp nhận: theo AOAC, độ chính chấp<br />
<br />
với R > 0,99, CV ≤ 20%.<br />
<br />
nhận được khi phân tích nồng độ 10-6 - 10-4<br />
<br />
- Độ chính xác của phương pháp<br />
<br />
mol/L là CV < 11% đối với độ chính xác dài<br />
<br />
+ Xác định độ chính xác ngắn hạn (độ lặp<br />
<br />
hạn, và CV < 5,3% đối với độ chính xác ngắn<br />
<br />
lại): mẫu QC được tạo từ huyết tương của trẻ<br />
<br />
hạn. [3]<br />
<br />
III. KẾT QUẢ<br />
<br />
Hình 1. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 430 C<br />
Ở nhiệt độ được khuyến cáo bởi Waters trong quy trình chuẩn, hiệu năng phân tách kém<br />
ở các cặp His + PEA, EA + Asp, Lys + Tyr, Arg + Gly. Các cặp His + PEA và Lys + Tyr bị lẫn vào<br />
nhau.<br />
<br />
Hình 2. Kết quả phân tích ở nhiệt độ 41,20 C<br />
64<br />
<br />
TCNCYH 102 (4) - 2016<br />
<br />
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br />
Có sự cải thiện rõ ở tất cả các cặp peak khó phân tách: His + PEA, Arg + Gly, EA + Asp, Lys +<br />
Tyr.<br />
<br />
Hình 3. Sự cải thiện hiệu năng phân tách khi thay đổi gradient pha động<br />
Khảo sát ở nhiệt độ 41,20 C, chúng tôi đã thu được sự cải thiện rõ rệt tại các thời gian lưu xuất<br />
hiện các cặp peak khó phân tách: His/PEA, Arg/Gly, EA/Asp, Lys/Tyr.<br />
Bảng 1. So sánh gradient của hai phương pháp<br />
Gradient tiêu chuẩn (Waters)<br />
<br />
Gradient cải tiến<br />
<br />
Thời gian (phút)<br />
<br />
mL/phút<br />
<br />
%A<br />
<br />
%B<br />
<br />
Curve<br />
<br />
Thời gian (phút)<br />
<br />
%A<br />
<br />
%B<br />
<br />
Curve<br />
<br />
4,5<br />
<br />
0,400<br />
<br />
98,5<br />
<br />
1,5<br />
<br />
6<br />
<br />
4,5<br />
<br />
98,1<br />
<br />
1,9<br />
<br />
6<br />
<br />
7,0<br />
<br />
0,400<br />
<br />
98,0<br />
<br />
2,0<br />
<br />
6<br />
<br />
7,0<br />
<br />
97,5<br />
<br />
2,5<br />
<br />
5<br />
<br />
8,0<br />
<br />
0,400<br />
<br />
98,0<br />
<br />
2,0<br />
<br />
6<br />
<br />
8,0<br />
<br />
97,9<br />
<br />
2,1<br />
<br />
5<br />
<br />
20,0<br />
<br />
0,400<br />
<br />
88,0<br />
<br />
12,0<br />
<br />
6<br />
<br />
20,0<br />
<br />
87,0<br />
<br />
13,0<br />
<br />
6<br />
<br />
21,0<br />
<br />
0,400<br />
<br />
88,0<br />
<br />
12,0<br />
<br />
6<br />
<br />
21,0<br />
<br />
88,0<br />
<br />
12,0<br />
<br />
6<br />
<br />
Thay đổi tỷ lệ % A/B có ý nghĩa trong việc thay đổi nhẹ mức pH tại mỗi thời điểm mong muốn,<br />
tại phút 4,5 (His + PEA), 7 (Arg), 8 (Gly) và 20 (Lys + Tyr) giảm % A và tăng % B làm tăng nhẹ pH<br />
của hỗn hợp pha di động. Phút 21 đặt lại tỷ lệ ban đầu nhằm thiết lập pH như trong trong<br />
phương pháp tiêu chuẩn. Kết quả được cải thiện sau khi thay đổi tỷ lệ % giữa A và B.<br />
Bảng 2. Khảo sát độ tuyến tính trong khoảng 5 - 1000 µmol/L<br />
TT<br />
<br />
Acid amin<br />
<br />
R<br />
<br />
R2<br />
<br />
TT<br />
<br />
Acid amin<br />
<br />
R<br />
<br />
R2<br />
<br />
1<br />
<br />
Ala<br />
<br />
0,999810<br />
<br />
0,999620<br />
<br />
14<br />
<br />
Thr<br />
<br />
0,999972<br />
<br />
0,999944<br />
<br />
2<br />
<br />
His<br />
<br />
0,998439<br />
<br />
0,996881<br />
<br />
15<br />
<br />
Cyst<br />
<br />
0,999885<br />
<br />
0,999769<br />
<br />
3<br />
<br />
PEA<br />
<br />
0,987842<br />
<br />
0,975832<br />
<br />
16<br />
<br />
Phe<br />
<br />
0,999079<br />
<br />
0,998160<br />
<br />
4<br />
<br />
Asn<br />
<br />
0,999897<br />
<br />
0,999793<br />
<br />
17<br />
<br />
Orn<br />
<br />
0,999777<br />
<br />
0,999554<br />
<br />
5<br />
<br />
Ser<br />
<br />
0,999508<br />
<br />
0,999016<br />
<br />
18<br />
<br />
Lys<br />
<br />
0,999516<br />
<br />
0,999032<br />
<br />
TCNCYH 102 (4) - 2016<br />
<br />
65<br />
<br />
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br />
TT<br />
<br />
Acid amin<br />
<br />
R<br />
<br />
R2<br />
<br />
TT<br />
<br />
Acid amin<br />
<br />
R<br />
<br />
R2<br />
<br />
6<br />
<br />
Gln<br />
<br />
0,999973<br />
<br />
0,999947<br />
<br />
19<br />
<br />
Tyr<br />
<br />
0,999225<br />
<br />
0,998451<br />
<br />
7<br />
<br />
Carn<br />
<br />
0,999709<br />
<br />
0,999418<br />
<br />
20<br />
<br />
Tryp<br />
<br />
0,998685<br />
<br />
0,997372<br />
<br />
8<br />
<br />
Arg<br />
<br />
0,999697<br />
<br />
0,999394<br />
<br />
21<br />
<br />
Met<br />
<br />
0,999664<br />
<br />
0,999329<br />
<br />
9<br />
<br />
Gly<br />
<br />
0,999800<br />
<br />
0,999600<br />
<br />
22<br />
<br />
Val<br />
<br />
0,999994<br />
<br />
0,999988<br />
<br />
10<br />
<br />
EA<br />
<br />
0,999218<br />
<br />
0,999177<br />
<br />
23<br />
<br />
Ile<br />
<br />
0,999983<br />
<br />
0,999966<br />
<br />
11<br />
<br />
Asp<br />
<br />
0,997961<br />
<br />
0,995925<br />
<br />
24<br />
<br />
allo<br />
<br />
0,999948<br />
<br />
0,999896<br />
<br />
12<br />
<br />
Glu<br />
<br />
0,998928<br />
<br />
0,997858<br />
<br />
25<br />
<br />
Leu<br />
<br />
0,999968<br />
<br />
0,999936<br />
<br />
13<br />
<br />
Cit<br />
<br />
0,999953<br />
<br />
0,999907<br />
<br />
26<br />
<br />
HCys<br />
<br />
0,999813<br />
<br />
0,999627<br />
<br />
Tất cả các acid amin điển hình đều có hệ số tương quan R > 0,99 trong khoảng nồng độ 5 1000 µmol/L.<br />
Giới hạn định lượng (LOQ): Trong nghiên cứu này, LOQ của các acid amin là 5 µmol/L.<br />
Bảng 3. Minh hoạ giới hạn định lượng của Valine<br />
<br />
66<br />
<br />
TCNCYH 102 (4) - 2016<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
