Đối chiếu kết quả giữa phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đặc hiệu và phương pháp giải trình tự gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> ĐỐI CHIẾU KẾT QUẢ GIỮA PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HÓA MÔ MIỄN DỊCH<br /> ĐẶC HIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN EGFR TRONG<br /> UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ<br /> Ngô Thị Tuyết Hạnh*; Hoàng Anh Vũ**, Hứa Thị Ngọc Hà*, Đặng Hoàng Minh*, Nguyễn Sào Trung*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Ngày nay tỉ lệ ung thư phổi ngày càng tăng cao nên việc phân tích đột biến gen EGFR trong<br /> ung thư phổi là rất cần thiết vì những bệnh nhân có đột biến gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ<br /> (UTPKTBN) gắn với tiên lượng xấu và có khả đáp ứng tốt với thuốc nhắm trúng đích phân tử ức chế miền<br /> tyrosine kinase (erlotinib, gefitinib). Nhuộm HMMD với kháng thể đặc hiệu EGFR mất đoạn E746 –A750 tại<br /> exon 19 và đột biến điểm L858R tại exon 21 đồng thời với phương pháp giải trình tự gen nhằm đối chiếu kết quả<br /> giữa hai phương pháp và nhằm xác định phương pháp nhuộm HMMD đặc hiệu có phải là một phương pháp sàng<br /> lọc hữu ích đầu tay cho việc phát hiện EGFR đột biến.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 70 bệnh nhân UTPKTBN được giải trình tự gen EGFR bằng máy<br /> ABI 3130 Genetic Analyzer tại TT Y sinh học phân tử – Đại học Y Dược TPHCM. Các trường hợp này cũng đã<br /> được nhuộm HMMD bằng máy Benchmark, với kháng thể kháng protein EGFR đặc hiệu (kháng thể đặc hiệu mất<br /> đoạn E746 –A750 tại exon 19 và đột biến điểm L858R tại exon 21) và được tính dựa vào cường độ bắt màu màng<br /> bào tương với điểm cắt là 10% tế bào u như sau: (0) không nhuộm màng hoặc nhuộm cường độ mờ nhạt < 10%<br /> các tế bào u; (1+): cường độ nhuộm mờ nhạt > 10% các tế bào u; (2+): cường độ nhuộm trung bình; (3+): Cường<br /> độ nhuộm mạnh. Các trường hợp được coi là dương tính: 1+; 2+; 3+. Các trường hợp âm tính: 0 điểm. Đối chiếu<br /> kết quả HMMD đặc hiệu với kết quả giải trình tự gen.<br /> Kết quả: có 17 trường hợp có biểu hiện protein E746-A750 (24,3%), có 18 trường hợp có biểu hiện protein<br /> L858R (25,7%), có 34 trường hợp có đột biến của EGFR (48,6%) trong đó có 1 trường hợp đột biến exon 18, 20<br /> trường hợp đột biến exon 19 (28,6%); 1 trường hợp đột biến exon 20 và 14 đột biến exon 21 (20%). Có 2 trường<br /> hợp mang cùng lúc đột biến của cả 2 gen exon 19 và 21. Có sự liên quan có ý nghĩa thống kê giữa phương pháp<br /> nhuộm hóa mô miễn dịch đặc hiệu và phương pháp giải trình tự đột biến gen EGFR (p = 0,001 và p = 0,004).<br /> Kết luận: Phương pháp nhuộm HMMD protein EGFR đặc hiệu mất đoạn E746-A750 và đột biến điểm<br /> L858R có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho việc xác định EGFR đột biến và là phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay<br /> cho việc phát hiện EGFR đột biến có ý nghĩa cho việc điều trị nhắm đích.<br /> Từ khóa: Hóa mô miễn dịch, EGFR đặc hiệu, giải trình tự gen EGFR, ung thư phổi không tế bào nhỏ<br /> ABSTRACT<br /> COMPARISON OF SPECIFIC IMMUNOHISTOCHEMISTRY STAINING MOTHOD WITH<br /> SEQUENCING OF EGFR MUTATION IN PATIENTS WITH NON-SMALL CELL LUNG CANCER<br /> Ngo Thi Tuyet Hanh, Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha, Dang Hoang Minh, Nguyen Sao Trung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - No 5 - 2015: 91 - 96<br /> <br /> Background: Currently, the percentage of lung cancer cases is increasing. Therefore, the analysis of EGFR<br /> mutations in lung cancer is necessary for patients with EGFR mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC)<br /> associating with poor prognosis and are likely to respond well to drugs targeting molecules on targeted tyrosine<br /> <br /> * Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TP.HCM ** TT Sinh Học Phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> <br /> Tác giả liên lạc: ThS. Ngô Thị Tuyết Hạnh ĐT: 0918181722 Email: tuyethanhngo72@gmail.com<br /> <br /> 91<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> kinase domain inhibitors (erlotinib, gefitinib). Immunohistochemistry (IHC) staining with EGFR specific<br /> antibodies deletion E746-A750 in exon 19 and point mutation L858R in exon 21 was tested in conjunction with<br /> sequencing method to compare the results between two methods, and to determine the usefulness of IHC specific<br /> methods prior to detect EGFR mutations.<br /> Methods: 70 NSCLC patients were sequenced EGFR gene by ABI 10 Genetic Analyer in Center for<br /> Molecular Biomedicine, Ho Chi Minh City Medicine and Pharmacy University. These cases also had been dyed<br /> IHC by Benchmark with antibodies against EGFR specific protein (deletion specific antibodies in exon 19 E746-<br /> A750 and L585R point mutations in exon 21), and calculated based on the intensive staining of cytoplasmic<br /> membrane with 10% cutoff point of tumor cells as follows: 0: no staining is observed, or membrane staining <<br /> 10% of tumor cells; 1+: a faint/barely perceptible membrane staining > 10% of tumor cells; 2+: a weak to moderate<br /> complete membrane staining; 3+: a strong complete membrane staining; The cases were considered postitive: 1+;<br /> 2+; 3+; Negative cases: 0; The results of specific IHC and gene sequencing were compared.<br /> Results: Seventeen cases had protein expression E746-A750 (24.3%), 18 cases had L858R protein expression<br /> (25.7%). There were 34 cases of EGFR mutations (48.6%), in which 1 case in exon 18, 20 cases in exon 19<br /> (28.6%); 1 case in exon 20, and 14 cases in exon 21. Two cases had mutations in both exon 19 and 21. There was a<br /> statistically significant between specific IHC method and mutation sequencing of EGFR (p 10% các tế<br /> phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay cho việc<br /> bào u<br /> phát hiện EGFR đột biến, có ý nghĩa cho việc<br /> 2+: cường độ nhuộm trung bình<br /> điều trị nhắm đích.<br /> 3+: Cường độ nhuộm mạnh<br /> Đột biến gen EGFR<br /> Các trường hợp được coi là dương tính: 1+;<br /> Các nghiên cứu trước đây đều cho thấy<br /> 2+; 3+<br /> đột biến EGFR trong ung thư phổi tập trung<br /> Các trường hợp âm tính: 0 tại 4 exon 18 – 21. Chúng tôi đã sử dụng kỹ<br /> 5. Đối chiếu kết quả nhuộm HMMD đặc thuật giải trình tự DNA để khảo sát 4 exon<br /> hiệu với kết quả giải trình tự gen EGFR. Các này cho 70 bệnh nhân, phát hiện 34 trường<br /> số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm hợp có đột biến EGFR (48,6%). Trong 62<br /> stata 10. trường hợp carcinôm tuyến có 31 trường hợp<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN có đột biến EGFR, chiếm 50%; trong khi các<br /> loại mô học khác mang đột biến với tỉ lệ thấp<br /> Tuổi và giới hơn là 37,5 %. Trong những đột biến được<br /> Bao gồm 39 bệnh nhân nam và 31 nữ, tỉ lệ phát hiện, đột biến tại exon 19 chiếm tỉ lệ cao<br /> nam/nữ là 1,3/1. nhất 20 trường hợp (28,6%), kế đến là exon 21<br /> <br /> <br /> 94<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> chiếm 14 trường hợp (20%). Exon 18 và 20 ít bị hợp có đột biến cho cả hai exon 19 và 21.<br /> đột biến hơn 1 trường hợp (1,4%), có 2 trường<br /> Tương quan giữa đột biến gen và các đặc điểm giải phẫu bệnh<br /> Bảng 1: Tương quan đột biến gen với đặc điểm giải phẫu bệnh<br /> Giải trình tự gen EGFR OR<br /> Đặc điểm P<br /> Bình thường (n = 36) Đột biến (n = 34) (95% CI)<br /> Giới tính Nam 26 13 4,2<br /> 0,004<br /> Nữ 10 21 (1,4 -13,0)<br /> Tuổi ≤60 20 18 1,1<br /> 0,826<br /> >60 16 16 (0,4-3,2)<br /> Loại mô học Carcinôm tuyến 31 31 0,6<br /> 0,057<br /> Khác * 5 3 (0,1-3,4)<br /> *Bao gồm carcinôm gai – tuyến và carcinôm tế bào lớn<br /> Chúng tôi thấy có mối liên quan có ý nghĩa chúng tôi cũng không có trường hợp carcinôm<br /> thống kê giữa đột biến gen EGFR với giới tính (p gai - tuyến nào mang gen đột biến. Hơn nữa, đột<br /> = 0,004). Bệnh nhân nữ có đột biến cao gấp 4,2 biến cũng thường tìm thấy hơn trên bệnh nhân<br /> lần bệnh nhân nam. Trong các nghiên cứu khác nữ so với bệnh nhân nam(13). Không thấy có sự<br /> trên thế giới, đột biến hầu như chỉ gặp trên loại liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến gen<br /> carcinôm tuyến, rất hiếm khi tìm thấy ở với độ mô học và tuổi của bệnh nhân.<br /> carcinôm gai – tuyến (9) (14), trong nghiên cứu của<br /> Tương quan giữa nhuộm HMMD đặc hiệu với đặc điểm giải phẫu bệnh<br /> Bảng 2: Tương quan kết quả nhuộm HMMD đặc hiệu với đặc điểm giải phẫu bệnh<br /> Biểu hiện của protein EGFR OR<br /> Đặc điểm P<br /> Âm tính (n = 38) Dương tính (n = 32) (95% CI)<br /> Giới Nam 27 12 4,1<br /> 0,005<br /> Nữ 11 20 (1,4-12,6)<br /> Tuổi ≤ 60 22 16 1,4<br /> 0,509<br /> > 60 16 16 (0,5-3,9)<br /> Loại mô học Carcinôm tuyến 34 28 1,2<br /> 0,796<br /> Khác* 4 4 (0,2-7,1)<br /> *: Carcinôm gai tuyến và carcinôm tế bào lớn<br /> Kết quả nghiên cứu gợi ý có mối liên quan có 0,001) Những trường hợp biểu hiện protein<br /> ý nghĩa thống kê giữa nhuộm HMMD đặc hiệu EGFR dương tính L858R sẽ có đột biến gen<br /> với giới tính. Bệnh nhân nữ có HMMD đặc hiệu EGFR cao hơn gấp 5,6 lần những trường hợp<br /> dương tính cao gấp 4,1 lần bệnh nhân nam có biểu hiện protein EGFR âm tính (p= 0,001).<br /> (OR=4,1; 95% CI: 1,4-12,6). Không thấy có sự liên Kháng thể E746-A750: độ nhạy = 80%, đặc<br /> quan có ý nghĩa thống kê giữa nhuộm HMMD hiệu = 98%. Kháng thể L858R: độ nhạy = 78,6%<br /> với tuổi và loại mô học của bệnh nhân. và đặc hiệu = 85,7%. Chung 2 kháng thể: độ<br /> nhạy = 79,4% và đặc hiệu = 86,1%.<br /> Tương quan giữa nhuộm HMMD E746 –<br /> A750 và L858R với đột biến gen EGFR Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp<br /> nhuộm HHMD gen EGFR đặc hiệu E746-A750<br /> Những trường hợp biểu hiện protein<br /> và L858R là khá cao và chỉ có hai loại này của đột<br /> EGFR dương tính E746-A750 sẽ có đột biến<br /> biến EGFR (hai loại chính chiếm hơn 90%) được<br /> gen EGFR cao hơn gấp 31,1 lần những trường<br /> đánh giá bởi HMMD còn các loại đột biến khác<br /> hợp có biểu hiện protein EGFR âm tính (p=<br /> với tần số thấp hơn có thể không được kiểm tra<br /> <br /> <br /> 95<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số 5 * 2015<br /> <br /> bằng HMMD vì chưa có kháng thể đột biến đặc Protein Expression and Impact on Prognosis. J Clin Oncol<br /> 21:3798-3807.<br /> hiệu (chưa sản xuất). Vì vậy nếu ung thư phổi 6. Huang SF, Liu HP, Li LH, Ku YC, Fu YN, Tsai HY, et al<br /> với đột biến EGFR qua kiểm tra bằng HMMD (2004). High frequency of epidermal growth factor receptor<br /> mutations with complex patterns in non-small cell lung<br /> âm tính nên tiếp tục làm thêm phương pháp giải<br /> cancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan. Clin<br /> trình tự gen. Cancer Res;10(24): 8195-203.<br /> 7. Inoue A, Suzuki T, Fukuhara T, Maemondo M, Kimura Y,<br /> Bảng 3: Tương quan kết quả nhuộm HMMD với đột<br /> Morikawa N, et al (2006). Prospective phase II study of<br /> biến gen gefitinib for chemotherapy-naive patients with advanced non-<br /> EGFR OR small-cell lung cancer with epidermal growth factor receptor<br /> Đặc điểm P gene mutations. J Clin Oncol;24(21): 3340-6.<br /> Bình thường Đột biến (95% CI)<br /> 8. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, Gurubhagavatula S, Okimoto<br /> E746 - A750 RA, Brannigan BW, et al (2004). Activating mutations in the<br /> Âm tính 49 (a) 4 (c) 196 epidermal growth factor receptor underlying responsiveness<br />