Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 7

Chia sẻ: Doc Tai | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

268
lượt xem 113
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chương 7 PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE(POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR) Tóm tắt: Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (Polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả năm 1986 và cũng chính do sự phát minh này mà Mullis đã xứng đáng nhận giải thưởng Nobel về Y học và Sinh lí học năm 1993. Phản ứng chuỗi polimerase (PCR) là kĩ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính: (1). Biến tính ADN mẫu; (2). Tiếp hợp...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 7

Chương 7 PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE(POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR) Tóm tắt: Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (Polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả năm 1986 và cũng chính do sự phát minh này mà Mullis đã xứng đáng nhận giải thưởng Nobel về Y học và Sinh lí học năm 1993. Phản ứng chuỗi polimerase (PCR) là kĩ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử. Phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính: (1). Biến tính ADN mẫu; (2). Tiếp hợp mồi, (3). Tổng hợp đoạn ADN mới. PCR cũng như các kĩ thuật sinh học phân tử khác cần phải có ADN tinh sạch và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Hiện nay đã có nhiều phiên bản của PCR như RT-PCR, RAPD, AFLP... PCR và các kĩ thuật cải tiến từ PCR có nhiều ứng dụng trong thực tiễn, như: sản xuất mẫu dò, khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN, định lượng bằng PCR, phân tích đột biến, phân tích ADN đa hình, phân lập gene và tách dòng gene, phân tích sinh vật chuyển gene, xác định quan hệ di truyền... Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Phản ứng chuỗi polimerase (PCR); (2). Phân tích tính đa hình của ADN được nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD); (3). Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản có chọn lọc (Amplifed Fragment Length Potimorphism - AFLP). §1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR) 1. Nguyên tắc Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự ADN lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene (đột biến điểm, tái tổ hợp, retrovirus) từ những đoạn ADN ngắn được phân lập hoặc từ một lượng rất nhỏ lấy ra được khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự ADN trong bộ gene của các cơ thểsinh vật khác nhau. Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện khi có ADN mẫu, 2 đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-30 bazơ), Taq polimerase (ensyme chịu nhiệt được tách từ vi 92
khuẩn Thermus aquaticus):,bốn loại deoxyronucleotit triphotphate ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và con Mg2+ Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện trên thiết bị nhân ADN (máy PCR). Hình 7.1. Thiết bị nhân ADN (Máy PCR) Kĩ thuật PCR là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích hệ gen. Sử dụng kĩ thuật PCR có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách và nhân dòng. Thực chất PCR là một phương pháp invitro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban dầu hạn chế. Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polimerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hoá trị 1, ion Mg2+ và dung môi (nước khử ion khử trùng). Enzyme Taq polimerase là enzyme chịu nhiệt, được tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme Taq có trọng lượng phân tử là 94 kDa và không mất hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN. Hoạt tính của enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt 92,50C; sau 40 phút ở nhiệt độ 950C và sau 5-6 phút ở nhiệt độ 970C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzyme Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng. Nồng độ enzyme Taq tối ưu cho phản ứng PCR là 0,5-2,5 đơn vị, nhưng nếu nồng độ enzyme quá cao sẽ làm giảm hiệu suất xúc tác của phản ứng. Ngoài ra, nồng độ Mg2+ và dNTP cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, có nhiều loại polimerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện hơn như Tth polimerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của ARN khuôn và ion Mg2+. ADN khuôn (template) ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi có độ tinh 93
sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thường, nồng độ của ADN khuôn được đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-500ng. Đoạn mồi (primer) Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4-10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12-24 bazơ (đối với mồi đặc trưng). Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5 μ M. Lượng mồi đưa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lượng ADN cần tổng hợp (thường 106 phân tử ADN cần 108 phân tử mồi). Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trước khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu. Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Mồi phải được thiết kế sao cho không được bổ trợ lẫn nhau, số lượng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lượng G-C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh những vùng trình tự không bình thường như polipurine hoặc poliprimidine hay các trình tự lặp. Các nucleotit (dNTPs) dNTPs là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã được thay đổi như gắn thêm biotin hoặc digoxygenin... Nồng độ phản ứng của các dNTP thường dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10- 100mM) Taq ADN polimerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối ưu của chúng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: Nồng độ Mg2+ nồng độ chất mồi, độ dài của sản phẩm được khuếch đại số chu kì của phản ứng. Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme polimerase được sử dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ lớn Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polimerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu. Nhìn chung, nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm như AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn. 94
Mỗi một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau: (1) Giai đoạn tách chuỗi ADN: ADN bị biến tính từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn ờ nhiệt độ 94-950C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1-1,5 phút). (2). Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 400- 650C cho phép hai đoạn mồi gắn vào ADN mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) ở hai đầu ADN cần nhân. (3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C ADN Taq polimerase hoạt động kéo dài đoạn ADN từ đoạn mồi và hai đoạn ADN mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn ADN khuôn ban đầu. Sau một chu kì gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kì lại được coi là ADN khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2K đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu. 95
Kĩ thuật phản ứng di truyền dùng polimerase là kĩ thuật tương đối đơn giản và phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền ở mức độ phân tử ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể (Innis và cộng sự, 1990). PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích genome của sinh vật, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự ADN đặc hiệu từ bất kì cơ thể nào. PCR được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như xác định trình tự trực tiếp của ADN được nhân bản, thiết kế các trình tự ADN mới, nhân bản quần thể ADN để làm mẫu lai, xác định các trình tự đặc hiệu từ cADN hay thư viện gene, phân tích tiến hoá và sự đa dạng ADN của quần thể sinh vật hay giữa các cá thể. Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác và tương đối đơn giản để đánh giá cây chuyển gene, phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền ở cấp độ phân tử ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể. Hình 7.2. Sơ đồ phản ứng chuỗi polimerase (PCR) Sự hạn chế lớn nhất của kĩ thuật này là phải có một trình tự ADN nhất 96
định mà từ đó người ta thiết kế và tổng hợp các đoạn mồi (đoạn khởi đầu cho tổng hợp ADN). Tuy vậy sau này các nhà sinh học phân tử đã cải tiến kĩ thuật này mà không cần thiết phải biết trước trình tự chuỗi ADN. John Welsh và Michael Mc Clelland đã sử dụng kĩ thuật PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên trong việc xác định in dấu genome. Kĩ thuật PCR được ứng dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm và phân tích ADN đa hình. PCR còn được ứng dụng phân lập gene, phân tích sinh vật chuyển gene. Ở Việt Nam các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập các gene liên quan đến khả năng chống chịu ở cây trồng, như gene chịu hạn ở cây lúa (Lê Trần Bình và cộng sự, 1998), gene chịu nóng ở đậu tương (Trần Phương Liên và cộng sự, 1999),... và hàng loạt các gene đã được tách và giải trình tự nucleotit. Hình 7.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (Đinh Duy Kháng, 2002) 1.2. Phản ứng RT-PCR (PCR ngược) 1.2.1. Nguyên lí Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn ARN, gồm 2 giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN 2 sợi từ sợi ARN làm khuôn; (2) Trình tự ADN 2 sợi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng biến đổi ARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt độ 500C - 550C trong 30 phút. Sau khi có sản phẩm ADN 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn. RT-PCR được sử dụng để nhân ARN của retrovirut hoặc mARN tách từ tế bào chất. 1.2.2. Tiến hành phản ứng RT- PCR - Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kì, thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn sang ADN sợi kép ở nhiệt độ 500C- 550C, trong 30 phút. - Giai đoạn 2 (PCR): (1). Biến tính ở nhiệt độ 940-950C /1phút; (2).Tiếp hợp mồi ở 40-650C; (3). Tổng hợp ADN ở 720C/1 phút. 1.3. Kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR cùng với ADN marker được kiểm tra bằng phương pháp điện ới trên gel agarose 0,8-2%. Tiến hành chụp ảnh trên ánh sáng đèn UV để xác định sự có mặt của đoạn ADN được nhân bởi PCR. 97
Hình 7.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR (Đinh Duy Kháng, 2002) 1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Kết quả của phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của các yếu tử như: ADN khuôn, Taq polimerase, primer và nhiệt độ nóng chảy của mồi, ton Mg++, nguyên liệu là các dNTP, nước, dung dịch đệm,... 1.5. Các lĩnh vực ứng dụng của phản ứng PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, từ khi được Kary Mullis đề xuất hoàn thiện, đã có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, cả trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội. Trong nghiên cứu, kĩ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotit của các đoạn ADN được nhóm có thể sử dụng PCR để phát hiện đột biến, PCR cho phép phân tích liên kết gene từ những tế bào riêng lẻ, giúp nghiên cứu quá trình tiến hoá ở mức phân tử, thậm chí phục hồi những gene đã tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng, đặc biệt đối với động vật và thực vật bậc cao, vốn trước đây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống là rất khó khăn. cần nhiều năm, thì nay kĩ thuật PCR cho phép thực hiện chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giờ. Trong y học PCR có thể chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ virut đến vi khuẩn và các bệnh do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư... Trong tư vấn di truyền y học PCR cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đoán trước sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể có từ khi thai mới được 8 tuần tuổi và điều quan trọng là không cần chọc ối, chỉ cần lấy một giọt máu ngoại vi của mẹ để làm mẫu thí nghiệm. Ngày nay kĩ thuật PCR là không thể thiếu trong khoa học hình sự, giúp chẩn đoán nhanh, chính xác thủ phạm chỉ từ một vết máu khô, một sợi tóc hoặc một sinh phẩm nào đó mà thủ phạm để lại trên hiện trường. Ngoài ra kĩ thuật này còn cho phép xác định chính xác quan hệ huyết thống cha - con, ông - cháu... cũng chỉ trong vài giờ. 98
Trong bảo vệ môi trường, việc xác định mức độ ô nhiễm sinh học có thể thực hiện rất hiệu quả và nhanh chóng bằng kĩ thuật PCR. Những ứng dụng thực tiễn đa dạng của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR thật vô cùng tận. Nếu như năm 1985 mới có 3 công trình được công bố về PCR thì 5 năm sau kĩ thuật này đã được sử dụng trong hàng nghìn phòng thí nghiệm trên khắp thế giới. Ngay ở nước ta, kĩ thuật PCR cũng đã và đang được dùng trong nhiều trường đại học, viện nghiên cứu và ngày càng trở nên phổ biến. Phản ứng chuỗi trùng hợp thật sự đã đưa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực ứng dụng thực tế của di truyền học phân tử. Tóm lại, những ứng dụng cơ bản của PCR có thể tóm tắt như sau: - Sản xuất mẫu dò. - Khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN. - Định lượng bằng PCR. - Phân tích đột biến. - Phân tích ADN đa hình. - Phân lập gene và tách dòng gene. - Phân tích sinh vật chuyển gene. §2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CỦA ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN NGẪU NHIÊN (RANDQM AMPLIFIED PQLIMORPHIC DAN - RAPD) Williams và cọng sự (1990) đã xác định hiện tượng đa hình của phân tử ADN dựa trên phản ứng khuếch đại phân đoạn ADN ngẫu nhiên bằng các đoạn mồi có trình tự ADN tuỳ ý. Kĩ thuật này được gọi là kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình (RAPD technology). Hiện tượng đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các đoạn mồi liên kết (chẳng hạn đột biến điểm) hoặc do biến đổi các nhiễm sắc thể trong khu vực gene khuếch đại (lồng đoạn, mất đoạn). Phương pháp này đơn giản về mặt kỹ thuật, tiến hành nhanh chóng và chỉ cần một lượng rất ít phân tử ADN (nanogram). Các đoạn ADN đa hình được khuếch đại là một loại chỉ thị phân tử đặc thù mà chúng có thể phát hiện hiện tượng đa hình giữa các cá thể khác nhau ở mức độ phân tử ADN. Các mồi có trình tự nucleotit ngắn (10 nucleotit) liên kết bổ trợ với nhiều locus khác nhau và có khả năng khuếch đại nhiều đoạn ADN khác nhau (từ 2 99
đến 10 đoạn ADN khác nhau) trong một phản ứng dây truyền dùng enzym polimeraza. Kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình đã được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền các hệ thống sinh học. Kĩ thuật này tỏ ra rất hữu ích đặc biệt trong các trường hợp nơi mà không có sẵn các chỉ thị đồng enzyme (isozyme) hoặc các nhân tố đánh dấu RFLP. Hình 7.5. Sơ đồ phương pháp RAPD (theo CIMMYT, 1997 và Đinh Thị Phòng, 2001) Các yếu tố cắn thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: (1) ADN khuôn mẫu (DNA template) với nồng độ 5-50ng trong 25 μ l; (2) Đoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotit có trật tự nucleotit ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotit, trong đó C+G chiếm 50-80%; (3)ADN-polimeraza (Taq polimeraza): hoạt động của Taq polimeraza phụ thuộc vào Mg2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính ADN; (4) Bốn loại deoxynucleotit triphotphat (dNTP): ATP, TTP, GTP: CTP; (5) Ion Mg2+. 100
Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR: - Giai đoạn biến tính ADN: ở nhiệt độ 950C trong khoảng 30-60 giây làm cho hai mạch khuôn ADN tách nhau. - Giai đoạn tiếp hợp mồi: Khi nhiệt độ hạ xuống 32-400C mồi tiếp hợp và bám vào sợi ADN khuôn. - Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq polimeraza. Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn như trên, một đoạn ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kì lại được coi là ADN khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2k các đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu. RAPD có thể thực hiện từ 40-45 chu kì. Kĩ thuật này khác với kĩ thuật PCR ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên, số chu kì nhiều hơn và ở giai đoạn 2 nhiệt độ hạ thấp xuống 32-360C, không đòi hỏi thông tin về trình tự ADN được nhân bản. Dựa trên sự xuất hiện hay biến mất của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD được quan sát thấy ở các cá thể khác nhau và được đánh giá theo quy ước 1 = xuất hiện và 0 = không xuất hiện. Một bảng gồm các giá trị 0 và 1 được thiết lập từ các cá thể nghiên cứu sẽ cho phép tính ra hệ số tương đồng di truyền của các cặp theo Nei và Li. Trong quá trình thiết lập mối quan hệ giữa các loài hay nhóm loài, một số tác giả (Apostol và CS, 1993) đã xây dựng kĩ thuật phân nhóm thông qua các biểu đồ RAPD (RAPD Lot). Thực chất kĩ thuật này gồm 3 bước: Bước 1: So sánh từng cặp đối tượng trong nghiên cứu bằng cách tính toán khoảng cách quan hệ giữa chúng. Bước 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán được trước đó. Bước 3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trưng. Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập được phần mềm máy tính để tự động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tương đồng di truyền của các đối tượng nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các phân đoạn được nhân bản của các cá thể. NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics lúc., USA., 1998) là tên của một chương trình thuộc kiểu trên để lập ra biểu đồ hình cây Biểu đồ hình cây thu được sẽ thể hiện mức độ gần nhau của các cá thể cho phép đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể được nghiên cứu. Chương trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chính xác cao nên nó là một phần mềm 101
có hiệu quả trong việc phân tích kĩ thuật RAPD. Đối với đa số thực vật, các đoạn mồi dài khoảng 10 nucleotit với 60% GC sẽ tạo ra 2-10 sản phẩm được nhân bản. Hiện tượng đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotit tại vị trí các đoạn mồi liên kết. Vì vậy các đa hình thường được nhận ra do có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locut. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng, chỉ cần một lượng nhỏ (nanogram) phân tử ADN có nguồn gốc từ hệ gen. Các đoạn ADN đa hình được nhân bản là một loại chỉ thị phân tử đặc thù mà chúng ta có thể phát hiện hiện tượng đa hình giữa các cá thể khác nhau ở mức độ phân tử ADN. Kĩ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền. Người ta đã áp dụng thành công kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình vào nhiều lĩnh vực khác nhau, như lập bản đồ gen, in dấu ván ADN, chọn giống... Lập bản đồ gene (Gene Mapping) Các nhân tố RAPD cũng phân li theo quy luật Mendel và có thể được sử dụng như các gene đánh dấu di truyền trong việc thiết lập các bản đồ phân tử (Williams và cộng sự, 1990; Foolad và cộng sự, 1993). So với kĩ thuật phân tích hiện tượng đa hình độ dài các phân đoạn ADN (RFLF Technology) thì kĩ thuật này có một số ưu điểm nổi bật là: có thể phát hiện hiện tượng đa hình trong phân tử ADN trên một phạm vi rộng lớn hơn; tính đơn giản và nhanh gọn; cần ít lượng ADN. Kĩ thuật này đã được áp dụng thành công vào nhiều loại cây trồng khác nhau để thiết lập các bản đồ di truyền phân tử như Brassica (Quyros và cộng sự 1991), Arabidopsis thaliana (Reiter và cộng sự, 1992) cà chua (Klein Lankhorst và cộng sự, 1991; Foolad và cộng sự, 1993)... In dấu vân ADN(ADN Fingerprinting) xác định bản đồ giống ở mức độ phân tử và tính đa dạng sinh học. 102
Hình 7.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD ở đậu tương và đậu xanh (1. ADN marker, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Sản phẩm RAPD) Hình 7.7. Quy trình sử dụng kĩ thuật phân tích RAPD Việc dễ dàng phát hiện hiện tượng đa hình trong phân tử ADN bằng cách 103
sử dụng tác nhân tố RAPD làm cho kĩ thuật này trở hấp dẫn trong nghiên cứu nhận dạng các cá thể, chẩn đoán các bệnh di truyền, phân loại thực vật và tiến hoá ở mức độ phân tử, các mối quan hệ phát sinh chủng loại trong giới tính. Trong phạm vi giới thực vật kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình đã được sử dụng để nhận dạng các giống cây trồng (cây hoa lơ - Hu và Quyros, 1991; cây cần tây - Yang và Quyros, 1993), phát hiện mối quan hệ phát sinh chủng loại (bèo hoa dâu - Van Coppennolle và cộng sự, 1993; Scroch và cộng sự, 1992; ngũ cốc - Dweikat và cộng sự, 1993), đánh giá giống và sự đa dạng di truyền trong tập đoàn giống cây trồng (lúa mì - Vierling và Nguyen, 1992; Caetano - Anolles và cộng sự, 1991). Zheng và cộng sự (1991) khi sử dụng hai đoạn mồi khác nhau đã phát hiện các chỉ thị phân tử RAPD trong tập đoàn 19 giống lúa và chỉ ra tính hữu hiệu lớn lao của các chỉ thị phân tử đó trong việc nhận dạng giống. Hình 7.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD ở lạc (a) và lúa cạn (b) Fukuoka và cộng sự (1992) đã xác định các đoạn ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên ở 16 giống lúa khác nhau và cho rằng chúng khác biệt nhau bởi ít nhất là một băng ADN đa hình và phân bố trong ba nhóm lúa khác nhau tương ứng với các loại phụ Japonica, Javanica và Indica. L. X. Yu và H. T. Nguyen (1993) đã nghiên cứu sự biến dị di truyền của các giống lúa cạn thông qua sử dụng tới 42 đoạn dò ADN khác nhau. Các tác giả đã thu được 260 đoạn gene khuếch đại khác nhau, trong số đó thì 208 đoạn gene (tức là 80%) thể hiện sự đa hình và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa đó. David. J. Mackill (1995) cũng bằng kĩ thuật này đã thành công xác định sự đa dạng di truyền của 134 giống lúa có nguồn gốc khác nhau và chỉ ra rằng sự biến dị di truyền của các nhân tố RAPD là rất quan trọng bổ sung thêm cho việc lập bản đồ gene và in dấu vân ADN. Dán nhãn gene (tagging Genes) Kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn ADN đa hình cũng đã được sử 104
dụng một cách thành công để đánh dấu (dán nhãn) các gene điều khiển các tính trạng quan trọng của cây trồng, chẳng hạn như gene quy định tính chống chịu bệnh đốm vi khuẩn ở cây cà chua (Martin và cộng sự, 1991), gene quy định khả năng chống bệnh giun tròn ở cây cà chua (Klein - Lankhorst và cộng sự, 1991), gene chống bệnh gỉ sắt. Kĩ thuật RAPD còn được ứng dụng trong chọn giống. Việc xác định các chỉ thị RAPD đặc trưng. làm cơ sở cho chọn giống gián tiếp. Căn cứ vào sản phẩm điện di RAPD người ta có thể thiết lập bảng thống kê sự có mặt các phân đoạn ADN được nhân (số 1 : có mặt đoạn ADN; số 0: đoạn ADN không được nhân). Trên cơ sở đó xác định dược hệ số đồng dạng di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu, lập sơ đồ phả hệ (cây phát sinh). Từ kết quả đó sẽ xác định được sự sai khác về bộ gene của các đối tượng nghiên cứu. Bảng 7.1. Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD Ước lượng Đoạn Các đoạn Các dòng đột biến và giống gốc kích thước được mồi (kb) nhân Giống gốc ML81 ML10 ML61 ML70 ML59 ML48 8,0 1 1 1 0 0 0 1 1 7,0 2 1 1 0 0 0 1 1 6,0 3 1 1 0 0 0 1 1 RA 31 5,1 4 1 1 0 0 0 1 1 5,0 5 0 0 1 1 1 0 0 4,9 6 1 1 1 1 1 1 1 4,8 7 0 0 1 1 1 0 0 2,5 8 0 0 1 0 1 0 1 2,0 9 0 0 1 0 1 0 0 1,9 10 0 0 1 0 1 0 0 1,5 11 1 1 1 1 1 1 1 1,49 12 0 0 0 1 0 0 0 1,48 13 0 0 0 1 0 1 1 1,43 14 1 1 1 0 1 0 0 1,40 15 0 0 1 0 1 0 0 1,38 16 0 0 1 0 1 0 0 1,35 17 0 0 1 0 1 0 0 1,33 18 0 1 1 1 0 1 1 1,2 17 0 1 0 1 0 0 1 0,98 20 0 0 1 0 1 1 0 0,83 21 0 0 1 0 1 0 0 0,60 22 0 1 0 0 0 1 1 105
Bảng 7.2. Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng đậu tương Dòng ĐB Giống gốc ML81 ML10 ML61 ML70 ML59 ML48 và G.gốc Lạng Sơn G.Gốc 1.0000000 ML81 0.7954545 1.000000 ML10 0.5000000 0.5681818 1.000000 ML61 0.5681818 0.7272727 0.704545 1.000000 0 ML70 0.5909091 0.4772727 0.772727 0.522727 1.000000 3 3 0 ML59 0.7954545 0.7727273 0.431818 0.690909 0.522727 1.000000 ML48 0.7500000 0.8636364 0.477272 0.691818 0.522727 0.818181 1.00000 2 3 8 00 Hình 7.9. Sơ đồ phả hệ của các dòng đậu tương đột biến chọn lọc từ giống gốc Các vệ tinh cũng như chỉ thị phân tử khác như đa hình độ dài các phân đoạn ADN (RFLP), các đoạn ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) đã được sử dụng rộng rãi để thiết lập bản đồ phân tử chi tiết và định vị các gene điều khiển các tính trạng giá trị ở cây đậu tương (Keim và cộng sự, 1990; Diers và cộng sự, 1992; Yu và cộng sự, 1994). Shoemaker and Specht (1995) đã thông báo sáp nhập các nhóm liên kết cổ điển với các nhóm liên kết di truyền phân tử ở cây đậu tương bằng cách sử dụng 20 1ocus cổ điển, 8 1ocus chỉ thị phân tử RAPD và 110 1ocus chỉ thị phân tử RFLP. §4. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH CHIỀU DÀI CÁC PHÂN ĐOẠN ADN ĐƯỢC NHÂN BẢN CÓ CHỌN LỌC (Amplified Fragment Length Polimorphism - AFLP) Zabeau và Vos (1993), Vos và cộng sự (1995) đã đưa ra và mô tả một kĩ thuật mới về in dấu vân ADN. Đó là kĩ thuật khuếch đại chọn lọc các đoạn ADN đa hình (AFLP - Technology). Kĩ thuật này dựa trên cơ sở siêu sao chép chọn 106
lọc các đoạn ADN đa hình từ hệ gene. Kĩ thuật khuếch đại có chọn lọc các đoạn ADN hiện nay là một kĩ thuật có sức mạnh lớn và đầy tiềm năng về in dấu vân ADN. Nó tạo ra một cách nhanh chóng nhất, hiệu quả nhất một bản đồ di truyền dày đặc các chỉ thị phân tử nhằm chọn lọc các tính trạng mong muốn thông qua chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử đồng thời là một công cụ lí tưởng đối với việc xác định và đánh giá cây trồng ở mức độ phân tử ADN. Các nhân tố AFLP là những chỉ thị phân tử, nhanh chóng được áp dụng vào việc nghiên cứu di truyền, lập bản đồ gene, dán nhãn gene quan trọng ở nhiều loài thực vật khác nhau như khoai tây (Ballvoro và cộng sự, 1995; Folkertsma và cộng sự, 1996), lúa mạch (Becker và cộng sự, 1995). Kĩ thuật phân tích ADN đa hình có chọn lọc (hay là kĩ thuật khuếch đại chọn lọc các đoạn ADN đa hình - AFLP) gồm 3 bước cơ bản sau đây: (1) Phân cắt phân tử ADN bằng enzyme giới hạn tiếp theo là gắn kết chất gá (adapter). (2) Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polimerase để khuếch đại các đoạn ADN. (3) Phân tích các đoạn ADN trên gel poliacrylamid. Do có sự phối hợp các loại enzyme, giới hạn khác nhau với nucleotit chọn lọc của chất mồi nên kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại này cho phép tạo ra nhiều các chỉ thị phân tử hơn so với các phương pháp trước đó. Bằng các nhân tố RFLP và AFLP K. Meksem và cộng sự (1995) trong chiến lược phân lập các diễn chống chịu bệnh sương mai (Phytophthora Infestans) ở cây khoai tây đã thành công thiết lập bản đồ gene có độ phân giải cao về vùng phụ cận locus R1 trên nhiễm sắc thể số 5. Các tác giả đã góp phần chọn lọc một cách gián tiếp các giống khoai tây có khả năng chống bệnh sương mai thông qua chọn giống nhờ các chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection - MAS). D. J. Mackill (1996) đã sử dụng các chỉ thị phân tử AFLP, RAPD và trình tự nucleotit lặp lại đơn giản (Microsatellite) để nghiên cứu mức độ đa hình trên 14 giống lúa khác nhau và cho rằng các chỉ thị phân tử AFLP và trình tự nucleotit lặp lại đơn giản có thể được xem như là các chỉ thị phân tử bổ sung cho việc lập bản đồ gene ở nhiều loại cây trồng nói chung cũng như ở cây lúa nói riêng, đồng thời các chỉ thị phân tử này cũng tỏ ra thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ các locus điều khiển tính trạng số lượng thông qua con lai bắt nguồn từ 2 loài phụ Japonica và Indica. Ngoài ra các chỉ thị phân tử AFLP trở nên cần thiết đối với việc lập bản đồ gene có chất lượng cao nơi mà cần phải làm bão hoà một 107
đoạn nhiễm sắc thể đặc hiệu với nhiều số lượng các chỉ thị phân tử (Thomas và cộng sự, 1995). Sự khám phá ra các đại phân tử axit nucleic và protein - cơ sở vật chất chủ yếu của sự sống và nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn bằng các kĩ thuật hiện đại trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử. Trong công nghệ sinh học thực vật. việc phân loại genome trong tế bào thực vật và mối quan hệ giữa chúng làm sáng tỏ vai trò vật liệu di truyền thực vật, những hiểu biết về axit nucleic và hệ gene trong tế bào thực vật là nền tảng cho các kĩ thuật sinh học phân tử. Các kĩ thuật sinh học phân tử được ứng dụng trong phân tích genome thực vật. Trong các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng vào chọn tạo giống cây trồng thì các kĩ thuật PCR và RAPD có thể được ứng dụng rộng rãi và, hiệu quả trong điều kiện Việt Nam. Bằng kĩ thuật RAPD, dựa vào sản phẩm điện di lập bảng thống kê các phân đoạn ADN được nhân bản, từ đó thiết lập biểu đồ so sánh sự khác nhau ở mức phân tử giữa các dòng và các giống với nhau. Những kết quả bước đầu về ứng dụng kĩ thuật PCR và RAPD cho phép khẳng định hiệu quả của sự kết hợp phương pháp chọn giống truyền thống với những phương pháp sinh học phân tử hiện dại trong tạo giống cây trồng, vật nuôi. THẢO LUẬN 1. Trình bày cơ sở, nguyên tắc của phản ứng chuỗi PCR và những ứng dụng của PCR. 2. PCR trong phân tích hệ gene của sinh vật và trong công tác chọn giống. 3. RAPD là gì? Phương pháp xác định dấu chuẩn RAPD và quan hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp RAPD. 4. Thế nào là AFLP? Các bước của kĩ thuật AFLP. Ứng dụng của AFLP. 108