Giáo trình Kỹ thuật lên men thực phẩm: Phần 2 - PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thuỷ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tiếp nội dung phần 1, Giáo trình Kỹ thuật lên men thực phẩm: Phần 2 được biên soạn gồm các nội dung chính sau: Vi khuẩn lactic - đặc tính và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm; Khoa học lên men sản xuất sữa chua; Vi khuẩn acetic; Công nghệ sản xuất giấm. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Kỹ thuật lên men thực phẩm: Phần 2 - PGS.TS. Đỗ Thị Bích Thuỷ

PHẦN 2 LÊN MEN LACTIC TRONG THỰC PHẨM CHƢƠNG 6 VI KHUẨN LACTIC - ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 6.1. Khái niệm và phân loại vi khuẩn lactic 6.1.1. Khái niệm về vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (LAB) là những vi khuẩn tạo ra sản phẩm chủ yếu là lactic acid trong quá trình lên men carbohydrate. Chúng là những vi khuẩn gram dƣơng, bất động, không sinh bào tử, catalase và oxydase âm tính. Do khả năng sinh tổng hợp những hợp chất cần cho sự sống là rất yếu nên LAB là những vi sinh vật đa khuyết dƣỡng đối với nhiều amino acid, nhiều loại vitamin,… không có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrine và không có cytochrome. Nhiều loài của LAB là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí và có khả năng tồn tại cả hiếu khí cũng nhƣ kỵ khí. Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng khá phức tạp, không có đại diện nào có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng vô cơ thuần khiết chứa glucose và các muối amoni. Phần lớn các vi khuẩn lactic không tự tạo đƣợc các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo sự phát triển chúng cần nguồn nitơ dạng hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng. Vì thế, LAB thƣờng có mặt trong những môi trƣờng giàu đạm hữu cơ nhƣ thịt, sữa, các amino acid và các dạng protein thủy phân nhƣ pepton, cao nấm men. Rất ít vi khuẩn lactic có thể tổng hợp đƣợc vitamin, do đó chúng cũng rất cần vitamin để phát triển. Các vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Do đó, để nuôi cấy LAB, ngƣời ta thƣờng phải bổ sung dịch chiết nấm men, nƣớc cà rốt, cà chua… Ngoài ra, LAB cũng cần rất nhiều muối vô cơ nhƣ Cu, Fe, K, P, S, Mn… Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc nhiều nguồn carbon khác nhau gồm nhiều loại đƣờng, một điểm quan trọng là chúng có thể sử dụng rất tốt đƣờng lactose, do đó chúng thích nghi tốt với các môi trƣờng có sữa và là một trong các nhóm vi khuẩn tiên phong trong hệ vi sinh đƣờng ruột của trẻ sơ sinh, ngoài ra chúng còn có thể sử dụng cả tinh bột, cellulose. Nơi sống chủ yếu của các vi khuẩn lactic là sữa và những nơi sản xuất và chế biến sữa, thực vật nguyên vẹn hoặc đang tự phân hủy, cũng nhƣ đƣờng ruột và niêm mạc 116
của ngƣời và động vật. Do tạo thành một lƣợng lớn lactat và chịu đƣợc pH thấp nên trong các môi trƣờng lên men lactic, vi khuẩn lactic thƣờng chiếm số lƣợng áp đảo, vì vậy có thể dễ dàng phân lập các vi khuẩn lactic từ các sản phẩm này trên các môi trƣờng dinh dƣỡng chọn lọc. 6.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào hình thái tế bào, tính chất sinh lý sinh hóa, cùng với những thành tựu của sinh học phân tử, LAB đƣợc phân thành các nhóm chính nhƣ sau: 6.1.2.1. Lactobacillus và Carnobacterium Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, gồm khoảng 80 loài với mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểm sinh hóa và sinh lý. Sự không đồng nhất thể hiện ở khoảng tỉ lệ mol G+C rất rộng, từ 32–55 %. Tuy nhiên, chúng vẫn đƣợc chấp nhận trong một chi thống nhất theo định nghĩa của chi, về cơ bản là những vi khuẩn lactic hình que. Chúng là những vi khuẩn gram dƣơng, catalase âm tính, sinh trƣởng trong điều kiện kỵ khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí. Các loài trong chi Lactobacillus có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thông qua con đƣờng Embden-Meyerhof hoặc dị hình thông qua con đƣờng pentose-phosphate. Chúng phát triển mạnh trong môi trƣờng có tính acid, tùy loài mà pH dao động từ 4,5–6,4. Trong tự nhiên, Lactobacillus có thể đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm thịt, sữa, bia hoặc trong nƣớc sạch, bùn, bề mặt thực vật, trái cây. Các loài thuộc chi này cũng là một phần quan trọng trong hệ thống vi sinh đƣờng ruột ở ngƣời và động vật bậc cao, có trong khoang miệng, đƣờng ruột và trong âm đạo. Chúng có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự ổn định của hệ vi sinh trong cơ thể, tạo ra những lợi ích sức khỏe cho vật chủ và ức chế một số vi sinh vật gây bệnh khác. Lactobacillus đƣợc ứng dụng trong lên men sản xuất lactic acid và lên men sữa. Tuy nhiên, chúng đôi khi cũng gây rắc rối vì làm hỏng thực phẩm do một số sản phẩm trao đổi chất cuối cùng của chúng gây ra mùi khó chịu cho bia, sữa, thịt. Các loài thuộc chi Carnobacterium trƣớc đây đƣợc xếp vào chi Lactobacillus, đó là các loài L. divergens, L. carnis, và L. piscicola, nhƣng sau đó đã thể hiện những tính chất khác biệt và đƣợc tách ra khỏi chi Lactobacillus. Các loài trong chi Carnobacterium có thể phát triển trong môi trƣờng có pH khá cao (khoảng 9) trong khi Lactobacillus không thể phát triển trong điều kiện này. 6.1.2.2. Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus Ban đầu, cả ba chi này đều đƣợc xếp chung vào chi Streptococcus. Chúng là các vi khuẩn lactic dạng cầu, tồn tại theo cặp hoặc xếp chuỗi và lên men lactic đồng hình. 117
Mặc dù có sự phân tách và tạo thành những chi mới, chi Streptococcus vẫn là một chi rất lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo. Nhìn chung, chúng đƣợc chia thành ba nhóm, nhóm pyogenic (sinh mủ), nhóm ở miệng (oral) và nhóm “khác” là những loài còn lại. Nhiều loài trong chi Streptococcus là loài gây bệnh. Loài đƣợc ứng dụng quan trọng trong công nghệ thực phẩm là S. thermophilus, sử dụng trong chế biến sữa chua và trong chế biến một số loại phomat. Loài này đƣợc xếp vào nhóm Streptococcus ở miệng (oral). Khả năng chịu nhiệt cao là đặc điểm nổi bật của chúng, chúng có thể phát triển ở cả nhiệt độ 52 oC. Lactococcus là chi liên quan chặt chẽ đến công nghệ chế biến sữa, đặc biệt là Lc. lactis. Chúng đƣợc phát hiện nhiều ở các môi trƣờng có sữa trong tự nhiên hoặc quanh các khu vực chế biến sữa. Đặc điểm phân biệt giữa Lactococcus, Enterococcus và Streptococcus chủ yếu dựa vào khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau và nồng độ NaCl khác nhau. Trong khi các chủng Lactococcus không thể phát triển ở 45 oC, NaCl 6,5 % và pH 9,6 thì các chủng Enterococcus lại phát triển đƣợc trong cả ba điều kiện trên, không có quy luật chung cho nhóm Streptococcus. Enterococcus không có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm. Một số loài trong chi này, ví dụ nhƣ E. faecalis có thể là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội, vì thế không đƣợc ƣa chuộng trong chế biến thực phẩm. Ngƣời ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng kháng sinh và khả năng chuyển một số tính trạng thông qua các yếu tố di truyền có khả năng dịch chuyển. Tuy nhiên, vẫn có nhiều nghiên cứu sử dụng E. faecium và E. faecalis làm probiotic do nhiều loài trong chi Enterococcus cƣ trú tự nhiên trong đƣờng ruột của động vật bậc cao và ngƣời. 6.1.2.3. Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus Aerococcus, Pediococcus và Tetragenococcus tạo nên các vi khuẩn lactic dạng tetrad (4 cầu khuẩn liên kết thành bộ 4). Chi Aerococcus nhìn chung chỉ có vai trò thứ yếu trong công nghệ thực phẩm. Pediococcus là dạng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, chịu acid có thể chuyển đổi giữa dạng 2 đƣờng trực giao (perpendicular) và dạng bộ 4 (tetrad). Chúng có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm theo cả nghĩa tích cực và tiêu cực. P. damnosus là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của chúng có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl và acetoin, làm cho bia có vị giống bơ. P. acidilactici và P. pentosaceus đƣợc sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu trong sản xuất xúc xích và ủ thức ăn gia súc. Chúng còn có vai trò quan trọng trong sự chín của phomat. Chi Tetragenococcus ban đầu đƣợc coi là P. halophilus. Ngoài đặc điểm là chịu đƣợc nồng độ muối rất cao (18 %) thì chúng còn một đặc điểm nữa để phân biệt với 118
các vi khuẩn lactic khác là chúng cần nồng độ muối khoảng 5 % để phát triển. Chi này có vai trò quan trọng trong các loại thực phẩm có hàm lƣợng muối cao, nhƣ nƣớc chấm đậu nành. 6.1.2.4. Leuconostoc, Oenococcus và Weissella Chi Leuconostoc đầu tiên đƣợc xem là những vi khuẩn lactic dạng cầu, lên men dị hình và chỉ tạo D-lactic từ glucose. Tuy nhiên, rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc với Lactobacillus lên men dị hình có hình thái dạng cầu-que (coccoid rod, tức là dạng hơi giống hình oval). Do đó, đã có sự tách ra một số loài từ cả chi Lactobacillus và Leuconostoc để hình thành chi mới: Weissella, gồm các vi khuẩn “giống nhƣ Leuconostoc”, đó chính là các loài trƣớc đây đƣợc xem nhƣ Ln. paramesenteroides; Lb. confusus; Lb. viridesens. Chi này vì thế có cả dạng hình cầu và que. Ngƣời ta nhận thấy loài Ln. oenos, còn đƣợc gọi là Leuconostoc ở rƣợu, có khả năng chịu nồng độ rƣợu và acid cao, vì thế đã đƣợc tách ra tạo thành một chi mới, Oenococcus. Trong khi việc phân biệt giữa Oenococcus và Leuconostoc khá đơn giản, thì việc phân biệt giữa Weissella và Leuconostoc vẫn là một vấn đề nan giải. 6.1.2.5. Bifidobacterium Bifidobacterium là vi khuẩn kỵ khí, gram dƣơng, không di động, lên men nguồn cacbonhydrat và tạo thành lactic acid hoặc acetic, không sinh khí CO2. Chi này chủ yếu sống ở trên cơ thể động vật bậc cao, có thể gặp chúng ở trong khoang miệng và đƣờng tiêu hóa của động vật và cả ở côn trùng, thậm chí ở cả bùn, chúng là vi sinh vật tiên phong trong hệ tiêu hóa của ngƣời. Chúng có ứng dụng quan trọng trong việc sản xuất các chế phẩm vi sinh làm probiotic. Chi này đƣợc phát hiện vào năm 1899, vào đầu thế kỷ XX chi này đƣợc xem nhƣ thuộc vào chi Lactobacillus, chúng có dạng hình que, thƣờng ở dạng đôi, tạo thành nhiều hình dáng đa dạng, dạng chữ V hoặc chữ Y. Theo khóa phân loại Bergey năm 1920, chúng có tên là L. bifidus. Năm 1967, theo Axelsson (2004), ở nhóm vi khuẩn này có mặt của enzyme fructose-6-phosphate phosphoketolase và vắng mặt của hai enzyme là aldolase và glucose-6-phosphatase dehydrogenase – hai enzyme có mặt trong Lactobacilli. Từ đó, ngƣời ta kết luận rằng việc phân loại nhóm Bifidobacterium trong chi Lactobacillus là không hợp lý. Với các thành tựu của sinh học phân tử, năm 1965, theo Axelsson (2004) tỷ lệ mol Guanine + Cytosine (G+C) trong DNA của vi khuẩn này khác với tỷ lệ có trong các chi Lactobacillus, Corynebacterium, và Propionibacterium. Ngày nay, nhóm này đƣợc xếp thành một chi riêng biệt, chi Bifidobacterium, thuộc họ Actinomycetaceae. 119
6.1.2.6. Những đặc điểm chủ yếu phân biệt các chi vi khuẩn lactic Theo phân loại của Axelsson (2004), sự khác nhau cƣo bản về hình thái và một số đặc tính sinh lý sinh hóa giữa các chi của LAB đƣợc thể hiện trên Bảng 6.1. Bảng 6.1. Các đặc điểm phân loại các chi trong nhóm vi khuẩn lactic Phát Phát Phát Phát Phát Sinh CO2 Phát Sinh Hình triển triển triển triển ở triển ở Tên chi từ triển ở lactic dạng a o ở ở pH ở pH NaCl NaCl glucose 10 C acid 45oC 4,4 9,6 6,5 % 18 % L, D, Lactobacillus Que ± ± ± ± − ± − DLc Carnobacterium Que −b + − ND + ND − L Cầu, dạng Aerococcus − + − − + + − L terad Enterococcus Cầu − + + + + + − L Lactococcus Cầu − + − ± − − − L Leuconostoc Cầu + + − ± − ± − D Cầu, dạng L, Pediococcus − ± ± + − ± − tetrad DLc Streptococcus Cầu − − ± − ± ± − L Cầu, tạo L Tetragenococcus dạng − + − − + + + tetrad D, Weissella Cầu + + − ± − ± − DLc (Nguồn: Axelsson, 2004) +: Dương tính; −: Âm tính; ±: Khác nhau giữa các loài; ND: Chưa xác định. a: một cách kiểm tra tương đối kiểu lên men lactic acid là đồng hình hay dị hình, nếu đồng hình sẽ cho kết quả âm tính và ngược lại. b: Có thể sinh một lượng nhỏ CO2 tùy thuộc vào loại môi trường. c: Khác nhau tùy theo loài. Bảng 6.1 cho thấy có thể phân loại các chi thuộc nhóm vi khuẩn lactic, ngƣời ta chủ yếu căn cứ vào các đặc điểm hình thái, gồm có hình dạng vi khuẩn (que, cầu) khả 120
năng sinh CO2 khi lên men từ nguồn glucose và các đặc điểm về khả năng phát triển ở các điều kiện pH khác nhau (4,4; 9,6), các nhiệt độ khác nhau (10 oC; 45 oC), ở các nồng độ muối khác nhau (6,5 %; 18 %). Các loài trong các chi vi khuẩn lactic đƣợc phân loại qua khả năng lên men các loại đƣờng khác nhau để tạo acid. Hiện nay nhờ thành tựu của sinh học phân tử, có thể phân loại vi khuẩn lactic bằng một số phƣơng pháp nhƣ DGGE, giải trình tự DNA ribosome 16S, Phenylalanin tRNA synthetase gene (PheS gene), RNA polymerase gene (rpoA gene), MALDI-TOF MS .... 6.2. Cơ chế lên men lactic của vi khuẩn lactic và ứng dụng 6.2.1. Cơ chế lên men lactic của vi khuẩn lactic Tùy vào hệ enyme nội bào mà quá trình sinh tổng hợp lactic acid trong tế bào LAB đƣợc thực hiện theo cơ chế lên men lactic đồng hình hoặc dị hình 6.2.1.1. Lên men lactic đồng hình Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm cuối cùng chủ yếu là lactic acid. Trong sự lên men “đồng hình”, sự phân giải glucose giống nhƣ lên men rƣợu tới giai đoạn tạo thành pyruvat (theo con đƣờng Embden - Mayerhoff - Parnas). Sau đó nhờ lactate dehydrogenase, pyruvat đƣợc khử bởi NADH2 (coenzyme khử này đƣợc tạo thành do sự tách hydro của glyceraldehyde 3 phosphate trong quá trình đƣờng phân) để tạo thành lactic acid (Sơ đồ 6.1). Việc xuất hiện D-, L+ hay DL- lactic là phụ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzyme vận chuyển lactate-dedihydrogenase và vào sự có mặt của một lactate- racemase. Chỉ một phần nhỏ pyruvat đƣợc loại cacboxyl và chuyển thành acetate, ethanol, CO2 và acetoin. Việc tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của oxy. Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đồng hình gồm Lactobacillus, Sporolactobacillus, Pediococcus, Enterococcus và Lactococcus. Lactate dehydrogenase hoạt động trong điều kiện acid sẽ tạo ra sản phẩm chính là lactate. Trong điều kiện kiềm, các vi khuẩn lactic lên men đồng hình sẽ tạo ra một lƣợng lớn acetate và ethanol. Sự lên men lactic “đồng hình” có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất lactic acid (sản phẩm chủ yếu chiếm đến 90 % tổng số sản phẩm lên men) dùng trong sản xuất đồ uống, làm sữa chua, sản phẩm dƣợc phẩm... 121
Glucose 2 ATP 2 ADP 2 Lactate 2 Glyceraldehyd 3 Phosphate 2 NAD 2 NADH2 2 Pyruvate 2 1,3 di Phosphate Glycerate 4 ATP 4 ADP Sơ đồ 6.1. Sơ đồ quá trình lên men lactic đồng hình 6.2.1.2. Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình tạo ra khoảng 50 % lactic acid, ngoài ra có thể tạo nhiều sản phẩm phụ nhƣ ethanol, acetic acid, hoặc CO2 với số lƣợng tƣơng đƣơng (Hình 6.1). Các loài vi khuẩn lactic thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus và Leuconostoc có khả năng lên men sinh lactic acid một cách đáng kể trong môi trƣờng. Trong quá trình lên men này, pyruvat đƣợc chuyển hóa thành lactate dƣới tác dụng xúc tác bởi lactate dehydrogenase: Pyruvat + NADH Lactate + NAD Do có tính chất đặc hiệu mà mỗi loại lactate dehydrogenase nhất định chỉ xúc tác để tạo thành L (+) hoặc D (-) lactic acid. Chẳng hạn nhƣ S. lactis chỉ tạo ra L (+) lactic acid, L. lactis sinh ra D(-) lactic acid và L. plantanum tạo ra DL-lactic acid. 122
Sơ đồ 6.2. Sơ đồ lên men lactic dị hình 123
Tùy vào hoạt động của hệ enzyme nội bào trong từng tế bào của từng loài của vi khuẩn lactic mà cơ chế lên men dị hình có khác nhau. Sơ đồ 6.2 và 6.3 là cơ chế lên men lactic dị hình lần lƣợt của hai chủng Bifidobacterium bifidum và Ln. mesenteroides. Sơ đồ 6.3. Sơ đồ cơ chế hóa sinh lên men lactic dị hình của Bifidobacterium bifidum 124
Sơ đồ 6.4. Cơ chế hóa sinh quá trình lên men lactic dị hình của Leuconostoc mesenteroides 125
Sự lên men lactic “dị hình” đƣợc ứng dụng trong lên men thức ăn gia súc và muối chua rau quả. Các vi khuẩn lactic có khả năng gây lên men các đƣờng mono và disaccharide (sau khi đã thủy phân thành monosaccharide nhờ enzyme tƣơng ứng của vi khuẩn). Nguyên liệu dùng cho sản xuất lactic acid là tinh bột, rỉ đƣờng và các vật liệu có đƣờng khác. Các nguyên liệu này đƣợc thủy phân trƣớc khi lên men. 6.2.2. Ứng dụng lên men lactic bởi vi khuẩn lactic trong công nghệ thực phẩm Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đƣờng tạo lactic acid trong môi trƣờng kỵ khí làm cho pH giảm xuống dƣới 5, ức chế đƣợc các vi sinh vật khác. Vì vậy, chúng đƣợc ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, trong chế biến thức ăn gia súc, chế biến sữa, các sản phẩm thực phẩm len men lactic và lên men thu nhận lactic acid ở quy mô công nghiệp. 6.2.2.1. Sản xuất lactic acid Trong công nghiệp nhẹ, lactic acid là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da. Nguyên liệu chính dùng để sản xuất lactic acid là rỉ mật, đƣờng, tinh bột đã đƣợc đƣờng hóa. Nồng độ đƣờng sử dụng cho quá trình lên men lactic từ 8-20%. Ngoài ra, còn sử dụng một số thức ăn bổ sung chứa đạm hữu cơ và các loại chất sinh trƣởng (nhƣ mầm đại mạch, cám, cao ngô…). Khả năng sinh lactic acid rất khác nhau tùy theo chủng. Trong sản xuất công nghiệp lactic acid thì chỉ có những loài lên men đồng hình là có giá trị. Hƣớng nghiên cứu hiện nay trong việc sản xuất lactic acid thông qua lên men lactic là tuyển chọn dòng sinh lactic acid cao; tối ƣu hóa khả năng lên men lactic, lên men lactic với nguồn nguyên liệu rẻ tiền và gây biến đổi di truyền để thu đƣợc các chủng sản xuất cao. 6.2.2.2. Bảo quản và chế biến thực phẩm Nhờ khả năng sinh lactic acid làm hạ pH môi trƣờng và sinh một số chất kháng khuẩn khác nhƣ H2O2, bacteriocin nên vi khuẩn lactic có thể ức chế các vi khuẩn làm hỏng thực phẩm. Mặt khác, quá trình lên men lactic làm tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của thực phẩm. Các loại thực phẩm lên men lactic thƣờng gặp nhƣ sữa chua, các loại thịt, hải sản lên men, rau quả và nƣớc ép quả muối chua. Thông thƣờng, để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối ngay từ đầu và tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển, ngƣời ta thƣờng bổ sung và nguyên liệu một lƣợng NaCl khoảng 3–5%. Ở Việt Nam, có khá nhiều sản phẩm loại này nhƣ tôm chua, nem chua, rau quả muối chua… Đặc biệt, trong ngành công nghiệp sữa vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng. Chúng là tác nhân chính trong quá trình sản xuất các sản phẩm sữa lên men có giá trị 126
dinh dƣỡng cao, dễ bảo quản. Hai chủng S. thermophilus và L. delbrückii subsp. bulgaricus đƣợc dùng để sản xuất sữa chua và một số loại phomat. Lactococcus lastic cũng đƣợc dùng trong sản xuất phomat. Một số chủng Leuconostoc có liên quan đến quá trình chín và quá trình lên men ban đầu của sữa chua và phomat. Ngoài ra còn có một số nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mới để sản xuất sữa chua thông thƣờng và sữa chua từ đậu nành. 6.2.2.3. Ủ chua thức ăn gia súc Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong các trang trại chăn nuôi. Thức ăn khi ủ không những giảm đƣợc sự tổn thất giá trị dinh dƣỡng mà còn bổ sung nhiều loại vitamin do vi sinh vật tổng hợp. Phƣơng pháp này dựa vào sự chuyển hóa đƣờng có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic. Nguyên liệu đƣợc ủ thành đống, hoặc chất vào các hố sâu trong đất. Các vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu sẽ phát triển dần lên. Đầu tiên là nhóm vi khuẩn hiếu khí phát triển mạnh sử dụng hết lƣợng oxy có trong đống nguyên liệu, làm tiêu thụ phần thức ăn dễ tiêu và phân giải protein của nguyên liệu. Kết quả là tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển, làm tích lũy dần lactic acid. Ngoài những mặt có lợi đƣợc ứng dụng và phát huy, vi khuẩn lactic còn gây ra những tác dụng có hại. Chúng gây ra hiện tƣợng vẫn đục và chua trong công nghệ sản xuất bia, nƣớc ngọt, rƣợu vang, làm ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng của sản phẩm. Do đó chúng ta cần phải có biện pháp phòng và chống lại những ảnh hƣởng xấu đó. 6.3. Tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic 6.3.1. Khái niệm probiotic Từ “probiotic” đƣợc bắt nguồn từ Hy Lạp, theo tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống”, chỉ những vi sinh vật sống trong cơ thể động vật và mang lại những tác động có lợi cho cơ thể vật chủ. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic đã đƣợc đề nghị, Fuller (1989) (theo FAO/WHO, 2001) đã chỉ rõ bản chất vi sinh vật của probiotic qua định nghĩa: “một sự bổ sung vi sinh vật sống qua đƣờng tiêu hóa mà tạo ra những tác động có lợi lên vật chủ thông qua việc gia tăng sự cân bằng trong đƣờng tiêu hóa”. Năm 1998, Guarner và Schaafsma (theo FAO/WHO, 2001) định nghĩa probiotic “là những vi sinh vật sống, khi đƣợc đƣa vào một lƣợng thích hợp, mang lại những lợi ích sức khỏe cho vật chủ”. Định nghĩa của FAO/WHO (2001) đã khái quát đƣợc những đặc điểm chính của probiotic, theo đó probiotic là “vi sinh vật sống khi đƣợc đƣa vào với số lƣợng hợp lý đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ”. Nhƣ vậy, những điểm chính về probiotic là: 127
- Những sản phẩm gồm có các vi sinh vật sống khi có mặt trong cơ thể sẽ gây ra tác động có lợi cho vật chủ. - Cần đƣợc đƣa vào với một lƣợng phù hợp để mang lại tác động mong muốn. Các vi sinh vật có tính chất nhƣ một probiotic có mặt trong đời sống, trong thực phẩm hàng ngày, và có thể đƣợc đƣa bổ sung vào cơ thể thông qua đƣờng ăn uống các sản phẩm ăn sống có chứa chúng nhƣ sữa chua, nem, tôm chua, dƣa cải… Probiotic hiện nay không chỉ có lợi cho con ngƣời mà còn đƣợc ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, sử dụng trong chăn nuôi gia súc, trong việc xử lý môi trƣờng. Các lợi ích sức khỏe mà probiotic mang lại cho con ngƣời nhƣ sau: * Giảm nguy cơ tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa Probiotic có thể làm giảm đƣợc nguy cơ tiêu chảy do có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột, cạnh tranh chổ trú đóng với vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản chúng bám dính vào thành ruột, tiết ra các enzyme hỗ trợ quá trình tiêu hóa nên có thể làm giảm nguy cơ các triệu chứng rối loạn về tiêu hóa, tiêu chảy. * Giảm nguy cơ nhiễm Helicobacter pylori Helicobacter pylori là một loại vi khuẩn gram âm gây viêm dạ dày, có thể dẫn đến loét và ung thƣ dạ dày. Vi khuẩn lactic có thể ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và làm giảm hoạt tính của enzym urease, một enzyme cần cho Helicobacter pylori để thích nghi với điều kiện acid của dạ dày. * Ngăn ngừa ung thư Một số vi khuẩn đƣờng ruột có thể tạo ra các chất gây ung thƣ (carcinogen) nhƣ các nitrosamine, sự có mặt của probiotic sẽ gây ức chế sự tăng trƣởng của các vi khuẩn này và do đó làm giảm đƣợc khả năng ung thƣ. * Giảm hấp thu cholesterol và lượng cholesterol huyết thanh Hàm lƣợng cholesterol trong huyết thanh ảnh hƣởng rất lớn đến các bệnh về tim mạch. Nếu hàm lƣợng này cao hơn so với mức bình thƣờng thì ngƣời bệnh có nhiều nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và béo phì. Việc sử dụng các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lƣợng cholesterol trong máu. * Ổn định hệ vi sinh vật trong đường niệu-sinh dục Chi Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong việc chống lại mất cân bằng và nhiễm trùng đƣờng sinh dục và niệu đạo. Do có khả năng sinh lactic acid làm giảm pH âm đạo và sinh một số chất kháng khuẩn khác nên chúng có thể ức chế một số vi sinh vật gây nhiễm trùng đƣờng âm đạo. 128
* Kích thích hệ miễn dịch tự nhiên Bên cạnh chức năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột và ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột, vi khuẩn probiotic còn có khả năng kích thích miễn dịch. Hệ thống miễn dịch tự nhiên của cơ thể có các tế bào đại thực bào (Macrophage), tế bào trung tính (neutrophil), tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK, gồm có tế bào T gamma và T delta). Chúng là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể bằng cách tiêu diệt tế bào lạ xâm nhập và trình diện kháng nguyên. Sự xâm nhập của vi khuẩn lactic có tác dụng kích thích hoạt động của các tế bào này, từ đó tăng cƣờng đƣợc hoạt động miễn dịch. Sự có mặt của vi khuẩn lactic còn có thể kích thích sản xuất kháng thể IgA. * Chức năng dinh dưỡng và hỗ trợ tiêu hóa Vi khuẩn lactic trong đƣờng ruột tạo ra một số vitamin nhƣ thiamine, nicotin, folic acid, pyridoxin, vitamin B12,…; tạo ra enzyme có lợi nhƣ lactase; giải phóng các amino acid tự do, các acid béo mạch ngắn. Ngoài ra, sự có mặt của vi khuẩn lactic trong các sản phẩm lên men cũng làm tăng giá trị dinh dƣỡng của chúng. Các sản phẩm nhƣ sữa chua, thịt lên men chua (nem, xúc xích…) dễ tiêu hơn và kích thích đƣợc vị giác, tạo cảm giác ngon miệng. Đối với những ngƣời thƣờng bị chứng không dung nạp lactose (lactose intolerant) thì enzyme lactase của vi khuẩn lactic sẽ giúp họ tiêu hóa đƣờng này dễ dàng hơn. 6.3.2. Một số tính chất có tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic * Khả năng chịu điều kiện của dạ dày Các chế phẩm probiotic đều đƣợc sử dụng qua đƣờng uống hoặc bổ sung vào thực phẩm chức năng, nên đều phải đi qua dạ dày trƣớc khi đến ruột non, nơi nó thể hiện các chức năng probiotic. Nhiều chủng LAB có thể sống sót qua đƣợc điều kiện khắc nghiệt của dạ dày nhƣ pH thấp (1–4) và các enzyme của dạ dày. * Khả năng kháng muối mật Đây là khả năng quan trọng đảm bảo sự sống sót và phát triển của vi khuẩn probiotic sau khi đi vào đƣờng ruột. Chỉ có những loài chịu đƣợc nồng độ muối mật trong ruột và có thể phát triển đƣợc thì mới phát huy đƣợc những đặc tính probiotic của chúng. Các chủng LAB đƣợc ông bố là có khả năng chịu muối mật của probiotic sử dụng dịch mật bò ở các mức nồng độ từ 0,1–0,3 % (tƣơng ứng với nồng độ muối mật trong đƣờng ruột ở ngƣời). * Khả năng bám dính Bám dính là một khái niệm chỉ mối quan hệ liên kết vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào ký chủ. Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính 129
đƣợc gọi là yếu tố bám dính. Có ba chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic có liên quan đến tác động của chúng với vật chủ, đó là khả năng tự kết dính, đồng kết dính và bám dính với đƣờng ruột của vật chủ. Khả năng tự kết dính là khả năng tự dính với nhau của các tế bào vi khuẩn cùng loại trong môi trƣờng lỏng. Đối với vi khuẩn lactic khả năng này liên quan chặt chẽ đến khả năng hình thành các quần lạc vi khuẩn (colony) trong dịch lỏng, tạo ra sự hỗ trợ về mặt sinh thái đối với các tế bào trong quần lạc. Khả năng đồng kết dính là khả năng dính với nhau của 2 hoặc nhiều tế bào vi khuẩn của 2 hoặc nhiều loài khác nhau. Vi khuẩn lactic có thể đồng kết dính với các tế bào của các loài gần gũi với chúng và tạo ra hiệu quả tƣơng tự sự tự kết dính, mặt khác, khi đồng kết dính với vi khuẩn gây bệnh, chúng tạo ra sự ức chế mạnh hơn lên vi khuẩn gây bệnh. Khả năng bám dính đƣờng ruột rất quan trọng đối với vi khuẩn có tiềm năng probiotic. Nhờ đó chúng duy trì đƣợc thời gian lƣu lâu hơn trong đƣờng tiêu hóa và đảm bảo sự phát triển của mình. Khả năng này còn liên quan đến sự cạnh tranh về nơi ở giữa vi khuẩn lactic và các vi khuẩn gây bệnh. Khi vi khuẩn lactic kết dính với vi khuẩn gây bệnh thì nó gây ra sự ức chế tốt hơn. * Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn lactic có khả năng sinh nhiều chất ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các loài có một quan hệ gần gũi với chúng trong hệ thống phân loại. Một số chất kháng khuẩn của chúng có phổ rộng có thể ức chế nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Các chất kháng khuẩn do vi khuẩn lactic sinh ra gồm các acid hữu cơ, ethanol, H2O2, và bacteriocin. Bacteriocin là các peptide mạnh ngắn, có khả năng kháng khuẩn. Rất nhiều loại vi khuẩn lactic có thể tạo ra bacteriocin, đáng chú ý là Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Lactococcus. Nhóm vi khuẩn bị ức chế thƣờng thấy là Helicobacter pylori, E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae…. * Khả năng kháng kháng sinh Một số chủng vi khuẩn lactic có thể kháng đƣợc một số kháng sinh. Khả năng này có thể liên quan đến một số gen trên nhiễm sắc thể, tranposome hoặc plasmid. Mối quan ngại lớn khi các chủng probiotic có khả năng này là liệu chúng có thể chuyển các gen này cho các vi khuẩn gây bệnh hay không. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chƣa có những thông tin có liên quan về các vấn đề lâm sàng gây ra do hiện tƣợng này. Theo kết luận của WHO/FAO trong khuyến cáo về probiotic (2001) thì các plasmid của một số chủng Lactobacillus sp. và Bifidobacterium sp., nhất là các chủng phân lập từ ruột ngƣời có thể chứa gen kháng kháng sinh. 130
Bỏ qua mối lo ngại về an toàn sinh học trong vấn đề này, thì khả năng kháng kháng sinh đƣợc coi là có lợi đối với chế phẩm probiotic. Nhờ đó chúng có thể phát triển tốt khi bệnh nhân sử dụng các thuốc kháng sinh đƣờng uống, duy trì đƣợc trạng thái tiêu hóa tốt và ổn định đƣờng ruột khi ngƣời bệnh dùng kháng sinh. Do vậy, WHO và FAO khuyến cáo cần có thêm những nghiên cứu về vấn đề này ở các chủng probiotic. * Khả năng thủy phân muối mật Khả năng thủy phân muối mật của probiotic làm giảm khả năng hấp thu cholesterol từ đƣờng tiêu hóa vào máu. Muối mật gồm các muối của cholic acid và các dẫn xuất của nó, có chứa nhân cholesterol. Để hấp thu cholesterol và các acid béo trong ruột, gốc cholate liên kết với các acid béo tạo thành dạng choleic và đi vào tĩnh mạch ruột. Tại gan sẽ xảy ra quá trình tách gốc cholate, phục hồi lại muối mật và acid béo. Vi khuẩn lactic và một số loại vi khuẩn đƣờng ruột khác không chỉ kháng đƣợc nồng độ muối mật cao của đƣờng ruột mà còn có khả năng thủy phân chúng, do đó làm giảm khả năng hấp thu các chất béo từ ruột vào máu, từ đó giảm đƣợc lƣợng lipid trong máu và các chứng bệnh có liên quan. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1. Cơ chế hóa sinh của quá trình lên men lactic Câu 2. Ứng dụng của lên men lactic trong thực phẩm. Câu 3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men lactic. Câu 4. Các đặc điểm có tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic. 131
CHƢƠNG 7 KHOA HỌC LÊN MEN SẢN XUẤT SỮA CHUA 7.1. Tác nhân vi sinh vật trong lên men sữa chua Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò quan trọng trong sản xuất sữa chua. Những thông tin chi tiết về nhóm vi khuẩn này gồm khái niệm, phân loại, cơ chế hóa sinh của quá trình lên men lactic đã đƣợc mô tả khá chi tiết ở chƣơng 6. Trong công nghệ sản xuất sữa chua, các chủng LAB thực hiện lên men đƣờng lactose tạo lactic acid làm cho sữa đông tụ, đồng thời còn tạo ra những chất thơm đặc trƣng cho sản phẩm. Trong đó, hai chủng thuộc loài L. bulgaricus (trực khuẩn) và S. thermophillus (liên cầu khuẩn) đƣợc sử dụng làm tác nhân lên men (Hình 7.1). Chúng đều là những vi khuẩn lên men đồng hình. L. bulgaricus phát triển tốt ở nhiệt độ 45–50 oC, lƣợng acid tạo thành là 1,5 %, pH 4,29. S. thermophillus là vi khuẩn chịu nhiệt, phát triển ở 50 oC, lƣợng acid tạo thành là 0,7 %, pH 4,2–4,4. Khi nuôi cấy đồng thời hai chủng này trong một môi trƣờng sẽ thu đƣợc lƣợng lactic acid cao hơn so với nuôi độc lập do chúng có tác dụng tƣơng hỗ lẫn nhau. Ở giai đoạn đầu của quá trình sản xuất, pH thích hợp cho sự phát triển của loài S. thermophillus hoạt động chiếm ƣu thế hơn. Hoạt độ enzyme proteolytic đƣợc tạo ra từ chủng L. bulgaricus kích thích sự phát triển của S. thermophillus, độ acid tăng lên. Vào giai đoạn cuối của quá trình lên men, pH có thể giảm xuống 4,2–4,4. S. thermophillus khó phát triển, chủng L. bulgaricus thay thế và sữa bắt đầu đông tụ. Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus Hình 7.1. Hình thái tế bào của hai chủng vi khuẩn lên men sữa chua 7.2. Công nghệ sản xuất sữa chua 7.2.1. Giới thiệu chung Việc sản xuất sữa chua đã có cách đây hàng nghìn năm. Tuy nhiên, cơ sở lý thuyết 132
về sản xuất sản phẩm này ít đƣợc biết đến cho đến trƣớc thế kỷ 19. Hầu hết đƣợc sản xuất ở quy mô nhỏ, thủ công và đƣợc truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Tuy nhiên, trong những thập niên gần đây, công nghệ sản xuất sữa chua đã đƣợc khám phá và cải tiến dựa trên lý thuyết về vi sinh vật học, enzyme học, vật lý, kỹ thuật, hóa học và hóa sinh học. Quy trình truyền thống Quy trình cải tiến Cô đặc sữa để còn 2/3 thể tích ban đầu Sữa đã đƣợc xử lý Làm nguội đến Đồng hóa nhiệt độ phòng Giống khởi động Gia nhiệt (sữa chua mẻ trƣớc) Phối trộn với giống Làm lạnh đến nhiệt độ khởi động lên men Nhân giống khởi động Ủ lên men Phối trộn với giống cho đến khi tạo gel khởi động Làm lạnh Sản xuất set Sản phẩm sữa hoặc stirred yoghurt chua Sơ đồ 7.1. Sơ đồ tổng quát các phƣơng pháp sản xuất sữa chua khác nhau Theo tiêu chuẩn công nghệ ngày nay, quy trình sản xuất sữa chua vẫn là một quá trình phức tạp kết hợp cả nghệ thuật và khoa học với nhau. Tác nhân vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong sản xuất sữa chua. Chúng tạo ra acid và hƣơng vị cho sản phẩm. Việc phân loại và đặc điểm của các chủng vi sinh vật này đã đƣợc trình bày ở Chƣơng 6. Tuy nhiên, để hiểu đƣợc nguyên tắc làm sữa chua thì cần phải hiểu đƣợc kỹ thuật của từng giai đoạn và ảnh hƣởng của chúng đến chất lƣợng của sữa chua. Bên 133
cạnh đó, chúng ta cần hiểu rõ về quy trình, thiết bị cần thiết ở quy mô sản xuất nhỏ và quy mô sản xuất lớn. Quy trình tổng quát của sản xuất sữa chua truyền thống và cải tiến đƣợc minh họa trong Sơ đồ 7.1. Có thể nhận thấy rằng phƣơng pháp truyền thống có một số nhƣợc điểm nhƣ sau: - Giống khởi động không điều khiển đƣợc tỉ lệ giữa S. thermophilus và L. delbrueckii subsp. bulgaricus, hoặc có thể xảy ra sự đột biến sau 15–20 lần sử dụng. - Nhiệt độ lên men thấp (nhiệt độ phòng) nên quá trình tạo acid trong sữa chậm, trong khi nếu lên men ở 40–45 oC thì chỉ mất 2–3 giờ. - Tốc độ lên men tạo acid chậm có thể dẫn đến nhƣng ảnh hƣởng không mong muốn, nhƣ sự tách nƣớc, làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm. - Lên men bằng phƣơng pháp truyền thống không kiểm soát đƣợc lƣợng acid tạo thành trong quá trình lên men. Tuy nhiên, quy trình lên men truyền thống chính là nền tảng cơ bản để sản xuất sữa chua ở quy mô công nghiệp hiện tại (Sơ đồ 7.1). Sự thay đổi cơ bản đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Sử dụng giống khởi động thuần chủng. - Nhân giống giống khởi động trong môi trƣờng vô trùng hoặc sử dụng trực tiếp giống khởi động không qua quá trình nhân giống. - Nhiệt độ lên men đƣợc kiểm soát một cách chính xác. - Sữa chua sau lên men đƣợc làm lạnh nhanh nên kiểm soát đƣợc mức độ acid tạo thành, từ đó chất lƣợng sữa chua đƣợc đồng nhất hơn. - Có thể dễ dàng kiểm tra độ pH hoặc độ acid trong quá trình lên men nên kiểm soát đƣợc quá trình sản xuất theo từng giai đoạn một cách dễ dàng. 7.2.2. Xử lý sữa nguyên liệu 134
Sữa Các chất không phải Nƣớc Lipid chất béo Vit. C và vit. Các hợp Lactose Khoáng Triglycerid Các chất hòa nhóm B chất N e tan trong chất béo Casein Protein whey Các hợp chất N phi protein Vit. A, D, E & K αs1, αs2, β, γ & κ Steroid Lecithin Carotenoid CephLine Nhạy cảm Bền nhiệt Sphingomyllin với nhiệt Protease, peptone Enzyme Albumin β2-Microglobulin Immunoglobin Lactoferrin (IgG1, IgG2, (α-La, β-Lg & Transferrin IgM, IgA & Bovine Serum Glycoprotein SIgA (FSC)a) Albumin) Sơ đồ 7.2. Các thành phần hóa học chính của sữa bò 7.2.2.1. Nguyên liệu sữa Thành phần của sữa nguyên liệu khác nhau và có ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sữa chua. Chẳng hạn nhƣ sữa có hàm lƣợng chất béo cao sẽ tạo ra sản phẩm sữa chua cho cảm giác ở miệng tốt hơn so với sữa chua đƣợc sản xuất từ sữa có hàm lƣợng chất béo thấp (sữa gầy). Lactose có trong sữa cung cấp năng lƣợng cho tác nhân gây lên men, trong khi hàm lƣợng protein ảnh hƣởng đến đông tụ, độ đặc, độ nhớt của sản phẩm. Hƣơng vị của sữa chua phụ thuộc nhiều vào sự chuyển hóa của tác nhân gây lên men nhƣng chất lƣợng của sữa nguyên liệu cũng có ảnh hƣởng đến tính chất này. 135