Giáo trình Phương pháp chẩn đoán bệnh ký sinh trùng ở gia súc, gia cầm

Chia sẻ: Ngọc Duyên | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:22

Thêm vào BST

Báo xấu

325
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Phương pháp chẩn đoán bệnh ký sinh trùng ở gia súc, gia cầm đề cập đến phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán và bệnh đơn bào ký sinh ở gia súc, gia cầm vì sự phổ biến và vai trò gây bệnh quan trọng của giun sán và động vật đơn bào ký sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Phương pháp chẩn đoán bệnh ký sinh trùng ở gia súc, gia cầm

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH KÝ SINH TRÙNG Ở GIA SÚC, GIA CẦM Như chúng ta đã biết, bệnh ký sinh trùng ở gia súc, gia cầm chia làm 3 nhóm lớn: nhóm bệnh giun sán, nhóm bệnh do động vật tiết túc ký sinh và nhóm bệnh do động vật đơn bào ký sinh. Trong phạm vi của giáo trình này, chúng tôi đề cập chủ yếu đến các phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán và bệnh đơn bào ký sinh ở gia súc, gia cầm vì sự phổ biến và vai trò gây bệnh quan trọng của giun sán và động vật đơn bào ký sinh. 1. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH GIUN, SÁN Có hai cách chẩn đoán bệnh giun, sán: chẩn đoán trên con vật sống và chẩn đoán trên con vật đã chết. 1.1 Phương pháp chẩn đoán trên con vật sống Chẩn đoán bệnh giun sán trên con vật sống bao gồm các phương pháp: chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán trong phòng thí nghiệm và chẩn đoán miễn dịch. 1.1.1 Chẩn đoán lâm sàng Một số bệnh giun, sán có những biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng và dễ nhận biết như: rối loạn hoạt động thần kinh (đi vòng quanh, co giật trong bệnh ấu sán ở não dê, cừu ); ỉa phân trắng trong bệnh giun đũa bê, nghé... .. Tuy nhiên, đa số các bệnh giun sán thường không có những biểu hiện đặc trưng và khó phân biệt như: rối loạn tiêu hoá, ăn uống kém, thể trạng gầy, da khô, lông xù... . Vì vậy, không thể chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán chính xác mà cần phải có những phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm. 1.1.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm Mục đích của phương pháp này là tìm giun, sán trưởng thành, trứng hoặc ấu trùng giun, sán ở trong phân bằng các nghiên cứu định tính và định lượng. * Kỹ thuật lấy phân để xét nghiệm: Trong đất hoặc trên nền chuồng có chứa số lượng lớn trứng và ấu trùng giun tròn sông tự do. Khi gia súc, gia cầm thải phân, trứng và ấu trùng giun tròn sống tự do có thể dính vào phân, gây khó khăn cho việc xét nghiệm chẩn đoán. Vì vậy, cần lấy phân trực tiếp qua hậu môn con vật. Phân của mỗi con vật để riêng vào túi ngon sạch, mỗi mẫu khoảng 20 30 gam, có nhãn ghi số thứ tự mẫu, tuổi, tính biệt, khối lượng con vật, địa điểm thu thập mẫu. Mẫu phân phải đưa về phòng thí nghiệm hoặc cơ sở nghiên cứu để xét nghiệm ngay (vì trứng nhiều loài giun tròn ở nhiệt độ 20 30 C hoặc cao 0 hơn, chỉ sau 16 18 giờ sẽ nở ra ấu trùng nên việc xét nghiệm chẩn đoán khó khăn 1
hơn. Mặt khác, trong thời gian này, ấu trùng giun phổi Dictyocaulus cũng lột xác lần thứ nhất và trở nên ít hoạt động hơn, nên sẽ gặp khó khăn khi phân ly ấu trùng bằng phương pháp Baerman). Nếu mẫu phân chưa xét nghiệm được ngay thì cần bảo quản ở nhiệt độ dưới 10 C, thời gian bảo quản không quá 3 ngày. 0 1.1.2.1. Nghiên cứu định tính Là phương pháp xác định có hoặc không có các loài giun sán ký sinh ở gia súc, gia cầm, tức là tìm giun sán trưởng thành hoặc đất sán dây, trứng hoặc ấu trùng giun sán trong phân. Đây là phương pháp thông dụng để đánh giá tình hình nhiễm giun sán ở các đàn gia súc, gia cầm. * Phương pháp tìm giun sán trưởng thành Để tìm giun sán trưởng thành hoặc các đốt sán dây được thải ra theo phân (đặc biệt là khi tẩy giun sán thăm dò), có thể dùng que bới phân và quan sát bằng mắt thường hoặc quan sát kỹ hậu môn của từng con vật (có thể phát hiện cả đoạn sán dây lủng lẳng ở hậu môn dê, chó, gà). Thường thu gom toàn bộ phân của mỗi con vật vào chậu rồi hoà tan trong nước, để lắng, gạn nhiều lần cho đến khi cặn lắng trong thì gạn nước đi để tìm giun sán trong cặn. * Phương pháp tìm trứng giun sán Có nhiều phương pháp tìm trứng giun sán, nhưng đạt hiệu quả cao và đơn giản, dễ làm là: phương pháp phù nổi Fullebom (1927), phương pháp Darling, phương pháp Cherbovick và phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943). Phương pháp Fullebom: là một trong các phương pháp phù nổi dễ làm và rẻ tiền. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng dung dịch muối ăn (Nacl) bão hoà có tỷ trọng d = 1,18, lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán, làm cho trứng giun sán nổi lên bề mặt dung dịch. Phương pháp Fullebom phát hiện khá tốt trứng giun tròn, trứng sán lá cơ quan sinh sản gia cầm và Oocyst cầu trùng. Dung dịch nước muối bão hoà pha bằng cách: cho tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu hoặc nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy cho đến khi muối không hoà tan được nữa (thường dùng 380 400 gam muối tinh thể không ngậm nước, hoặc 450 gam muối tinh thể ngậm nước). Để nguội, được dung dịch muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán. Phương pháp Darling: là phương pháp phù nổi có độ chính xác rất cao, tuy dụng cụ và thao tác có phức tạp hơn so với phương pháp Fullebom. Trong phương pháp Darling, dung dịch nước muối bão hoà (Nacl) vẫn được sử dụng làm dung dịch xét nghiệm chẩn đoán, song cần có máy ly tâm để thực hiện phương pháp này. Sau hai lần ly tâm, trứng giun sán, Oocyst cầu trùng dễ dàng nổi lên bề mặt dung dịch nước 2
muối bão hoà. Đồng thời, tiêu bản làm từ phương pháp Darling được loại bỏ cặn tốt hơn nên "sạch" hơn, dễ phát hiện trứng giun sán hơn, đặc biệt là dễ phát hiện Oocyst cầu trùng hơn so với tiêu bản làm từ phương pháp Fullebom. Phương pháp Cherbovick: là phương pháp có độ chính xác cao trong xét nghiệm trứng giun sán. Cách tiến hành phương pháp Cherbovick cũng gồm hai lần ly tâm như phương pháp Darling, song tuỳ mục đích chẩn đoán mà có thể dùng dung dịch bão hoà khác nhau (dung dịch ma giê sunfat bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà). Phương pháp gạn rửa sa lắng (còn gọi là phương pháp lắng cặn trứng giun sán): nguyên tắc của phương pháp này là dùng nước lã sạch tách trứng giun sán ra khỏi phân. Trứng giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước lã sẽ chìm xuống, có thể thu nhận để quan sát chẩn đoán dưới kính hiển vi. Phương pháp gạn rửa sa lắng có thể phát hiện khá tốt trứng sán lá gan, trứng sán lá dạ cỏ, trứng sán lá ruột lợn, đốt sán dây. Nếu để lắng cặn 30 60 phút có thể phát hiện trứng giun đũa và một số trứng giun tròn có kích thước lớn khác. Chú ý, khi xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào tử nang của nấm, trứng của các loài tiết túc có thể có trong phân, cũng như phải phân biệt đặc điểm hình thái của từng loại trứng (hình 36, 37, 38, 39, 40). Trứng giun sán thường có 2 hoặc 4 lớp vỏ, nhẵn hoặc lồi lõm, trong trứng có phôi bào hoặc ấu trùng. Hình 36. Những vật không phải trứng giun sán 1 . Tế bào thực vật; 2. Lông thực vật 3. Xơ thực vật; 4. Tế bào xoắn thực vật 5. Bào tử nấm; 6. Hạt phấn hoa 7. Giọt mỡ 3
1. Fasciola hepatica 2. ParBmphistomum cervi 3. Thysaniezia ovilla 4. Moniezia expansa 5. M. benedeni 6. Dicrocoelium 7. Strongyloides papillosus 8. Gongylonema pulchrum 9. Tnchuns globulosa 10. Fascio/a gigantica 11. Nematodirus spathiger 12. Gaigeria pachyscelis 13. Tnchostrongylus sp. 14. Skrjabinema ovis 15. AvitellinB centnpunctata 16. Chbertia ovina 17. Haemochus contortus 18. Bunostomum trigonocephalum 19. Oesophagostomum columbianum 20. Cotylophoron cotylophorum 21. Fascioloides magna 22. Ostertagia circumcinata 23. Cooperia sp. 24. Neoascaris vitulorum Hình 37. Trứng giun sán ký sinh ở gia súc nhai lại 1. Parascans equorum 2. Strongylus spp. 3. Trichonema spp. 4. Triodontophorus tenuicollis 5. Anoplocephala spp. 6. Gastrodiscus aegyptiacus 7. Strongyloides westen 8. Dictyocaulus amneldi 9. Oxyuris equi 10. Paranoplocephala mamillana 11. Habronema spp. 12. Fasciola hepatica Hình 38. Trứng giun sán ký sinh ở ngựa 4
1. Ascaris suum 2. Fasciola hepatica 3. Paragonimus sp. 4. Ascarops strongylina 5. Stephanurus dentatus 6. Trichocephalus suis 7. Metastrongylus sp. 8. Oesophagostomum detatum 9 Hyostrongylus rubidus 10. Physocephalus sexalatus 11. Brachylaemus sp. 12. Macracanthor hynchus birundi neceus 13. Globocephalus sp. 14. Schistosoma suis Hình 39. Trứng giun sán ký sinh ở lợn 1. Ascandia gam 2. Heterakis gallinarum 3. Subulura brumpti 4. Prosthogonimus sp. 5. Strongyloides avium 6. Tetrameres ameriacana 7. Acuaria spiralis 8. Acuaria bamulosa 9. Gongylonema ingluvicola 10. Syngamus trachea 11. Hartertia gallinarum 12. Oxyspirura mansoni 13. Capillana annulata 14. Capillaria retusa 1 5. Capillaria columbae 16. Capillaria 1ongico1lis Hình 40. Trứng giun sán ký sinh ở gia cầm * Phương pháp tìm ấu trùng giun sán Một số loài giun tròn (ví dụ, các loài thuộc giống giun tròn Dictyocaulus), sản phẩm thải ra theo phân ký chủ không phải là trứng mà là ấu trùng. Hoặc, các giun tròn thuộc họ Trychostrongylidae đẻ trứng có hình thái và kích thước tương đối giống nhau, nếu chỉ căn cứ vào trứng thì việc chẩn đoán phân biệt giống hoặc loài rất khó khăn. Trứng của những giun tròn này lại có đặc điểm là nở thành ấu trùng khi tồn tại và phát tán ở ngoại cảnh. Lợi dụng đặc điểm này mà ta có thể nuôi để trứng nở thành ấu trùng, rồi căn cứ vào hình thái của ấu trùng cảm nhiễm để chẩn đoán bệnh. Có những phương pháp phân ly ấu trùng sau: Phương pháp Baerman Phương pháp Baerman chủ yếu dựa trên nguyên tắc là, ấu trùng di chuyển ra khỏi 5
phân vào trong nước và lắng xuống đáy. Dùng phễu có đường kính 5 10 cm, cuối phễu lắp một ống cao su dài 10 15 cm, cuối ống cao su lắp ống nghiệm. Đặt lưới thép hoặc vải màn lên miệng phễu, cho đầy nước ấm 37 380C, trên lưới thép đặt 10 15 gam phân (nếu là phân viên của dê, cừu thì 8 12 viên). Để yên 30 phút 1 giờ, rồi lấy cặn ở ống nghiệm quan sát dưới kính hiển vi để tìm ấu trùng. Cần chú ý rằng, ở nhiệt độ 20 300C, Sau 18 24 giờ, trứng một số giun tròn thuộc bộ Strongylata (như Oesophagostomum) sẽ nở ra ấu trùng, khó phân biệt với ấu trùng Dictyocaulus. Vì vậy, tốt nhất là xét nghiệm ngay, không để phân qua đêm. Hiện nay, ở Việt Nam có thể thay thế phương pháp Baemlan bằng phương pháp của Essen và Donalson có cải tiến phương pháp Thanh Châu, dựa theo nguyên tắc của phương pháp Baerman, nhưng phương pháp này đơn giản, nhanh hơn và có hiệu 6
quả cao (Nguyễn Vũ Thanh và Nguyễn Ngọc Châu, 1993). Phương pháp Vaida Phương pháp Vaida đơn giản hơn so với phương pháp Baemlan, thường dùng để tìm ấu trùng trong phân gia súc có dạng viên như phân dê, cừu. Đặt 4 5 viên phân vào đĩa petri và cho vào một ít nước ấm. Sau 15 30 phút vớt các viên phân bỏ đi, còn nước ở hộp lồng đem quan sát dưới kính lúp hoặc kính hiển vi tìm ấu trùng. Phương pháp này áp dụng dễ hơn đối với dê, cừu nhưng hiệu quả thấp hơn phương pháp Baerman. Trong đường tiêu hoá của gia súc nhai lại có nhiều loài giun tròn thuộc bộ Strongylida ký sinh, trứng của chúng có hình thái gần giống nhau, khi nở thành ấu trùng cũng khó phân biệt loài này với loài khác. Tuy nhiên, các dạng ấu trùng cảm nhiễm thuộc bộ Strongylida khác nhau bởi số lượng và hình dạng tế bào ruột, kích thước của ấu trùng và phần mút đuôi của chúng. Ví dụ, có thể phân biệt một số ấu trùng cảm nhiễm thuộc bộ Strongylida như sau (hình 42) Ấu trùng giun tròn Dictyocaulus: mút đuôi hình nón, ruột chứa đầy các hạt màu sáng. Ấu trùng giun tròn Haemonchus: mút đuôi không có gai, thực quản dài khoảng 1/5 chiều dài cơ thể. Ấu trùng giun tròn Trichostrongylus: mút đuôi có gai, thực quản dài khoảng 1/4 chiều dài cơ thể. Ấu trùng giun tròn Oesophagostomum: có 20 32 tế bào ruột, mút đuôi vuốt dài. Ấu trùng giun tròn Bunostomum: ruột là một ống dài không phân chia thành những tế bào riêng biệt. 7
Hình 42. Các dạng ấu trùng cảm nhiễm của bộ Strongylida 1 Haemonchus contortus; 2 Cooperia; 3 Trichostrongylus; 4 Ostertagia; 5 Chabertia; 6 Oesophagostomum columbianum; 7 O. venulosum; 8 Bunostomum; 9 Nematodirus (theo Poliakov, 1953). 1.1. 2.2. Nghiên cứu định lượng Để đếm số lượng trứng và ấu trùng giun sán trong phân, có thể dùng các phương pháp sau: * Phương pháp đếm trứng Stoll Cho 5 gam phân vào trong một ống có vạch đo, cho dung dịch NaOH 0,1N tới vạch 75 ml. Khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh cho tan phân rồi dừng lại đột ngột, dùng pipet lấy ra 0,05 ml nước phân loãng cho lên phiến kính, đậy lá kính và quan sát dưới kính hiển vi. Số trứng đếm được nhân với 32 sẽ cho biết số trứng trong 1 gam phân. Tốt nhất nên làm vài lần để lấy số trung bình. Có thể dùng phương pháp phù nổi và gạn rửa sa lắng để đánh giá hiệu quả của thuốc sau khi tẩy giun sán mà không nhất thiết phải dùng phương pháp Stoll. Trong trường hợp này phải lấy số lượng phân như nhau, các dụng cụ phải cùng kích thước, dung dịch dùng xét nghiệm phải như nhau. So sánh số trứng trong một giọt váng bề mặt hoặc trong thị trường kính hiển vi (Nguyễn Thị Lê và cs, 1996). 8
* Phương pháp đếm trứng Mc. Master (hình 43) Phương pháp này dùng để xác định số lượng trứng giun tròn, trứng sán dây và Oocyst cầu trùng trong 1 gam phân bằng buồng đếm Mc. Master. Cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan phân. Lọc qua lưới thép vào một cốc khác và khuấy đều. Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút dung dịch phân nhỏ đầy cả hai buồng đếm Mc. Master (mỗi buồng đếm có dung tích 0,5 ml). Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0). 9
Trong thực tế, để dễ phát hiện và dễ đếm trứng, có thể cải tiến như sau: + Bước l: cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã sạch (khoảng 100 150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô. Nước lọc để lắng trong 1 2 giờ, gạn bỏ nước, giữ lại cặn. + Bước 2: cho 56 mi dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan cặn. Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút hút 1 mi dung dịch phân nhỏ đầy 2 buồng đếm Mc. Master. Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x l0). Đếm toàn bộ số trứng trong những ô của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức sau: (Tổng số trứng ở hai buồng đếm là số trứng có trong lưu dung dịch phân). Theo Jorgen Han sen và Buôn Peny (1994), mức độ nhiễm một số loài giun tròn căn cứ vào số trứng/1 gam phân dê như sau: Giun tròn Mức độ nhiễm (số trứng/gam phân) Nhẹ Trung bình Nặng Nhiễm hỗn hợp có Haemonchus 80 800 800 1 .200 Trên 1.200 Nhiễm hỗn hợp không Haemonchus có 300 800 800 1 .000 Trên 1 .000 Haemonchus 100 2.000 2.000 7.000 Trên 7.000 Trichostrongylus 1 00 500 500 2.000 Trên 2.000 oesophagostomum 1 00 800 800 1 .600 Trên 1.600 1. 1. 3. Phương pháp chẩn đoán bệnh giun sán bằng miễn dịch Các bệnh giun sán cũng thể hiện mức độ miễn dịch nhiều ít khác nhau giống như nguyên lý miễn dịch của các bệnh truyền nhiễm. Vì vậy, có thể chẩn đoán bệnh giun sán bằng miễn dịch. Hiện nay đã có nhiều phương pháp như: phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phương pháp miễn dịch men ELISA... Tuy nhiên, do khó khăn về phương tiện và việc chế kháng nguyên chuẩn, nên các phương pháp này còn ít được sử dụng trong thú y ở nước ta. 1.2. Phương pháp chẩn đoán trên con vật chết 1.2.1. Các phương pháp mổ khám giun sán Những phương pháp này chủ yếu là tìm giun sán và ấu trùng giun sán ở các cơ quan nội tạng khi mổ khám xác con vật đã chết. ưu điểm của phương pháp mổ khám là
10
biết được chính xác thành phần loài giun sán ký sinh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ. Tuỳ theo mục đích mổ khám mà có ba phương pháp: phương pháp mổ khám toàn diện, phương pháp mổ khám giun sán ở một cơ quan, phương pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin K. I. (1928). Mổ khám toàn diện là phương pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ chức của cơ thể gia súc, gia cầm (phát hiện giun, sán ở xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn bộ hệ tiêu hoá, kể cả gan, tuỵ; hệ hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; các tổ chức dưới da). Mổ khám không toàn diện là phương pháp mổ khám một loài giun sán nào đó trong cơ thể gia súc, gia cầm. Ví dụ, để phát hiện sán lá dạ cỏ phải mổ khám các túi dạ dày của loài nhai lại, ruột non, ruột già, gan, mật, xoang bụng, thận... (bởi vì sán lá dạ cỏ non có thể có mặt ở nhiều nơi khác nhau trong cơ thể). Mổ khám giun sán ở một cơ quan là phương pháp phát hiện tất cả các loài giun, sán ký sinh ở một cơ quan nào đó của cơ thể. Ví dụ, mổ khám giun, sán ở cơ quan tiêu hoá. 1.2.2. Phương pháp kiểm tra thịt và nội tạng để phát hiện giun sán Trong thịt gia súc có thể có giun sán ký sinh, ví dụ: Cysticercus sp. (ấu trùng sán dây Taenia sp.), ấu trùng giun bao (Trichinella spiralis). * Kiểm tra tươi Mục đích: tìm Cysticercus sp. trong tổ chức cơ. Để tìm các dạng ký sinh trùng này, có thể dùng dao sắc cắt ngang các bắp thịt vai, mông, đùi, lưỡi, vừa cắt vừa quan sát bề mặt các nhát cắt. Ấu trùng Cysticercus sp. của sán dây Taenia sp. có dạng hạt gạo, dài khoảng 0,5 mm hoặc hơn, màu trắng đục. Các dạng ấu trùng nói trên đều phát hiện bằng mắt thường một cách dễ dàng khi xem tươi tổ chức cơ. * Kiểm tra tổ chức cơ bằng phương pháp ép cơ, tiêu cơ Mục đích: tìm ấu trùng giun bao Trichinetla spiralis Thường lấy cơ chân hoành cách mô để làm 2 phương pháp: ép cơ và tiêu cơ (vì cơ ở vị trí này thường có nhiều ấu trùng giun bao). Thực hiện phương pháp ép cơ trên dụng cụ ép cơ chuyên dụng. Còn phương pháp tiêu cơ được thực hiện với dung dịch tiêu cơ. Kết quả là: trên tiêu bản ép cơ, nếu có thì thấy ấu trùng giun bao trong các kén có hình xoắn ốc. Trong dung dịch tiêu cơ, khi cơ đã bị tiêu hết, sẽ chỉ còn các nang kén chứa ấu trùng giun bao. * Kiểm tra nội tạng 11
Chủ yếu là kiểm tra tươi để phát hiện ấu trùng Cysticercl/s tenllicollis ký sinh trên bề mặt gan, lách, màng treo ruột, màng mỡ chài... . của gia súc. Ấu trùng Cysticercus tenuicollis có dạng bọc to nhỏ không đều, trong bọc có nhiều nước và một đầu sán dây dính ở màng trong của bọc. Có thể phát hiện Cys. tenuicollis dễ dàng khi xem tươi bằng mắt thường. 2. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐƠN BÀO KÝ SINH Đơn bào (Protozoa) ký sinh gồm rất nhiều giống loài khác nhau, ký sinh ở những vị trí khác nhau trong cơ thể: amip, cầu trùng, trùng lông, trùng roi ký sinh ở đường ruột; nhục bào tử trùng ký sinh trong cơ; các đơn bào ký sinh trong máu... Có nhiều biện pháp chẩn đoán bệnh đơn bào ký sinh. Các phương pháp thường dùng gồm: 2.1. Phương pháp xét nghiệm phân Đối với động vật lớn như trâu, bò, ngựa thì trực tiếp dùng tay lấy phân từ trực tràng con vật. Đối với dê, cừu, chó có thể dùng tay kích thích vào hậu môn hoặc dùng Syringne (không có kim) bơm vào hậu môn 2 3 mm glyxerin để kích thích thải phân. Lấy khay hứng phân rồi cho vào lọ thuỷ tinh hoặc hộp nhựa có nắp đậy kín, đưa về phòng thí nghiệm để xét nghiệm ngay trong ngày. 2.1.1. Phương pháp xét nghiệm cầu trùng ký sinh (Eimeria sp., Isospora sp... .) Các loài cầu trùng giống Eimeria, Isospora, Criptosporidia ký sinh ở trong đường tiêu hoá trâu, bò, dê, cừu, lợn, gà... . Sản phẩm của quá trình sinh sản vô tính và hữu tính xen kẽ trong các tế bào biểu mô ruột được gia súc, gia cầm bài xuất ra ngoài theo phân, được gọi là nang trứng hay noãn nang (Oocyst). Số lượng Oocyst trong phân có thể lên tới hàng trăm nghìn/1 gam phân. Để chẩn đoán bệnh cầu trùng, cần dựa vào những triệu chứng lâm sàng của con vật bệnh và các đặc điểm dịch tễ học. Nhưng nhất thiết phải tìm thấy căn bệnh mới có kết luận chính xác. Có thể tìm cầu trùng bằng phương pháp xem tươi (phương pháp trực tiếp). Phương pháp này dễ làm và dụng cụ rất đơn giản nhưng độ chính xác thấp, phải làm 8 10 tiêu bản/mẫu phân mới có thể thấy Oocyst cầu trùng. Oocyst cầu trùng có tỷ trọng nhỏ (d
Muốn xác định cường độ nhiễm cầu trùng của gia súc, gia cầm có thể ứng dụng phương pháp đếm trứng giun sán của Stoll hoặc đếm số lượng Oocystlgam phân bằng buồng đếm Mc. Master. 2.1.2. Phương pháp xét nghiệm Amip (Entamoeba sp.) Amip gây bệnh lỵ là đơn bào ký sinh ở ruột già (đại tràng), thuộc giống Entamoeba, họ Amoebidae, bộ Amoebida, lớp giả túc trùng Rhizopoda Von Siebold, 1845. Chúng là những đơn bào mà cơ thể là một khối chất nhầy, tạo giả túc (chân giả) để di động và sinh sản bằng hình thức phân đôi. Trong phân, amip có thể ở dạng amip lớn hoạt động, dạng amip nhỏ hoạt động hoặc chuyển thành bào nang (kén). Vì vậy, để phát hiện chúng cần phải có các phương pháp khác nhau. * Phương pháp xét nghiệm amip lớn và amip nhỏ hoạt động Dạng này thấy trong bệnh lỵ đang tiến triển. Phải xét nghiệm phân mới, không lẫn nước tiểu mới có thể thấy amip vận động. Nếu để ở điều kiện lạnh amip sẽ chết ngay nên khó phát hiện dưới kính hiển vi. Trường hợp xét nghiệm ở xa nên mang kính hiển vi đến xem tại chỗ, hoặc lấy phân cho vào lọ kín, bên ngoài quấn vải thấm nước nóng 37(lc đưa về xét nghiệm ở phòng thí nghiệm. Lấy chỗ phân có lẫn chất nhầy, lẫn máu để xét nghiệm trước khi dùng thuốc điều trị cho gia súc. Dùng tăm bông lấy chất nhầy trong phân, phết lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi ngay. Có thể xem tươi trực tiếp hoặc nhỏ một giọt Biểu metylen 1% nhuộm màu và xem sự vận động của amip. Bằng phương pháp này có thể thấy hai loài amip ký sinh trong ruột: Entamoeba histolytica, Entamoeba coli. Trong đó, loài E. histolytica là nguyên nhân gây bệnh lỵ amip. Khi bệnh lỵ đang tiến triển có thể thấy loài này ở hai dạng: Dạng amip lớn hoạt động: kích thước khoảng 20 40 μm, cơ thể không có màng nguyên sinh chất (vỏ) nên hình thái thay đổi (trong 1 giây có thể di chuyển được một đoạn dài 50 em). Nguyên sinh chất chia làm hai lớp: lớp ngoài và lớp trong. Lớp nguyên sinh chất bên trong có cấu trúc hạt và các không bào, trong không bào có 1 40 hồng cầu. Nhân có kích thước 4 7 μm, là tổ chức hình lưới có trung thể ở giữa và hạt nhiễm sắc ở bên ngoài nối tiếp nhau thành chuỗi, tạo thành hình dáng tương tự như hình bánh xe. Dạng amip nhỏ hoạt động: kích thước khoảng 15 25 μm hoặc nhỏ hơn, hoạt động yếu hơn loại amip trên, 2 lớp nguyên sinh chất không phân biệt được rõ, không bào không có hồng cầu, nhân có nhiễm sắc ở vùng ngoại vi dày đặc hơn, tạo ra hình thể vành. Trong giai đoạn chưa gây bệnh, amip từ dạng hào nang chuyển sang dạng amip nhỏ hoạt động rồi sinh sản hoặc ngược lại. Chu kỳ này có thể tiếp tục mãi mãi ở người và súc vật mang amip nhưng hoàn toàn không phát bệnh, hoặc chỉ xảy ra sau đợt bệnh 13
phát ở thể cấp tính. Khi gặp những điều kiện đặc biệt, amip dạng nhỏ hoạt động, ăn hồng cầu và trở thành amip dạng lớn hoạt động và gây bệnh, chu kỳ trở thành chu kỳ gây bệnh. Khi điều kiện sống thay đổi, amip dạng lớn hoạt động không nua hồng cầu nữa và chuyển thành amip dạng nhỏ hoạt động, rồi chuyển thành bào nang (kén amip) (Nguyễn Thế Khánh, Nguyễn Tử Dương, 2001). * Phương pháp xét nghiệm thể bào nang (kén amip) Trong thời kỳ xen kẽ giữa hai đợt tiến triển của bệnh, phân không có amip mà chỉ có thể bào nang (kén). Trong thời kỳ bệnh tiến triển, cũng có thể bào nang lẫn với amip. Thể bào nang sống rất dai dẳng, tồn tại lâu trong đại tràng, lẫn với phân. Thể bào nang còn có trong phân một số người và chó khoẻ chưa mắc bệnh. Thể bào nang xuất hiện trong phân thất thường, cần xét nghiệm lại nhiều lần. Phân xét nghiệm phải chọn chỗ có lẫn chất nhầy. Trường hợp chưa xét nghiệm được ngay thì cho phân vào lọ, cho vào 5 ml formol 5% để bảo tồn bào nang. Có thể xét nghiệm phân trực tiếp (xem tươi) hoặc nhuộm lugol. Cần phân biệt kén của loài Entamoeba histolytica với loài Entamoeba coli theo bảng sau: Bảng 5. Phân biệt kén loài Entamoeba histolytica với loài Entamoeba coli Entamoeba histolytica Phân biệt Entamoeba coli Dạng lớn Dạng nhỏ Kích thước 20 40 μm 15 20 μm 15 20 μm Lớp NSC ngoài Rõ Không rõ Không rõ Lớp NSC trong Thường có hầu cầu Không có hồng cầu Không có hồng Chân giả Nhiều Ít Í t Hoạt động Mạnh Yếu Yếu Nhân Xem tươi khó thấy Xem tươi dễ thấy Xem tươi dễ thấy Ghi chú: NSC nguyên sinh chất Đôi khi xét nghiệm không thấy kén, người ta đã thụt thuốc tẩy nhẹ để xuất hiện nhiều kén trong phân hơn. Tuy nhiên, cần thận trọng để tránh gây nên những cơn tiến triển cF~p tính của bệnh, làm cho cơ thể bị yếu đi và tạo ra những thay đổi ở đại tràng, làm cho kén trở lại dạng amip gây bệnh. * Phương pháp truyền amip cho động vật thí nghiệm Nếu xét nghiệm cho kết quả nghi ngờ, người ta truyền vào hậu môn mèo con khoảng 10 mi phân có dịch nhầy vào máu của súc vật bệnh. Nếu mèo mắc bệnh lỵ amip, phân có những amip loài Entamoeba histolytica, mổ khám thấy đại tràng của mèo có những thương tổn do amip gây ra thì có thể kết luận chắc chắn là súc vật bị 14
bệnh lỵ amip. * Phương pháp miễn dịch huỳnh quang Goldman (1953 1954) đã dùng kháng thể huỳnh quang để phân biệt hai loài amip trên. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang hiện đang được sử dụng nhiều để đánh dấu kháng thể. Khi hiệu giá kháng thể đạt từ 1/100 trở lên mới được coi là dương tính (Nguyễn Thế Khánh và Nguyễn Tử Dương, 2001). 2.1.3. Phương pháp xét nghiệm trùng roi (Tnchomonas sp.) Trùng roi là những động vật đơn bào có roi ở đầu hoặc đuôi và di chuyển được . Các ký sinh trùng này di chuyển rất nhanh nên khi xem tươi trực tiếp cần cố định chúng bằng formol hay nhuộm Luôm, có thể thấy cả thể bào nang của trùng roi. Các loài trùng roi thường thấy ở đường ruột gia súc là: Trichomonas intestinalis: dài 10 15 cm, rộng 7 10 cm, có 3 5 roi, trong đó có 1 roi đi về phía sau tạo thành một vòng vây rõ. Ít khi thấy thể bào nang của loại này. Loài trùng roi này thường không gây bệnh, nhưng cũng có thể gây viêm ruột, ỉa chảy ở súc vật non. Giardia intestinalis: dài 10 20 cm, rộng 7 10 μm, hình đối xứng, có 2 nhân trông như 2 mắt kính và 8 roi đi về phía sau. Chúng ký sinh ở tá tràng, đôi khi ở manh tràng và túi mật. Thể bào nang theo phân ra ngoài và là nguồn lây nhiễm cho súc vật. Bào nang có hình bầu dục, dài 10 13 cm, rộng 8 9 cm, thường có hai nhân. Ký sinh trùng này gây viêm ruột mãn tính, có thể gây viêm túi mật, viêm gan. 2.1.4. Phương pháp làm phong phú đơn bào và xác định cường bộ cảm nhiễm đơn bào (dùng để phát hiện cầu trùng, trùng roi, trùng lông, kén amip trong phân) * Phương pháp làm phong phú đơn bào Các phương pháp dựa trên nguyên lý: dùng dung dịch có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của đơn bào để làm cho đơn bào nổi lên bề mặt dung dịch, đều gọi là phương pháp làm phong phú đơn bào. Phương pháp làm phong phú đơn bào gồm có: phương pháp Fullebom; phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm nổi Darling; phương pháp vừa lắng cặn, vừa làm nổi Cherbovick; phương pháp Theater… Dung dịch được dùng làm phong phú đơn bào, ngoài dung dịch NaCl bão hoà, có thể dùng dung dịch MgSO4 bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà, dung dịch glyxerin 50%, dung dịch đường saccaroza 50%... Các dung dịch làm phong phú trứng được dùng để phát hiện đơn bào trong phân như: cầu trùng (Eimeria sp., Isospora sp., Cryptosporidia sp.), trùng roi (Trichomonas 15
sp) kén amip. * Phương pháp xác định cường độ cảm nhiễm đơn bào Xác định cường độ cảm nhiễm đơn bào bằng cách đếm số lượng đơn bào theo phương pháp đếm trung giun sán của Stoll hoặc đếm trên buồng đếm Mc. Master, từ đó tính ra số lượng đơn bào trong 1 gam phân. 2.2. Phương pháp kiểm tra thịt Trong thịt gia súc có thể có ký sinh trùng đơn bào ký sinh, ví dụ: Sarcocystis sp. (bào tử trùng ở thịt). * Kiểm tra tươi Để tìm Sarcocystis sp., có thể dùng dao sắc cắt ngang các bắp thịt vai, mông, đùi, lưỡi, vừa cắt vừa quan sát bề mặt các nhát cắt. Sarcocystis sp. trưởng thành là những nang kén có kích thước tương đối lớn, dài khoảng 1 chí hoặc hơn. Thể ký sinh trùng non có hình dạng một đám nguyên sinh chất nhỏ, có một nhân, dầy 10 20 μm, có vân, nằm trong một tế bào cơ bắp. Đám này lớn dần lên, kéo dài ra theo chiều của thớ thịt và trở thành dạng trưởng thành. Các dạng ký sinh trùng nói trên đều phát hiện bằng mắt thường một cách dễ dàng khi xem tươi tổ chức cơ. 2.3. Phương pháp kiểm tra máu Kiểm tra máu nhằm phát hiện các ký sinh trùng đường máu như: Trypanosoma sp., Piroplasma sp. (Babesia sp.). * Lấy máu để kiểm tra Đối với gia súc (trâu, bò, dê, ngựa, lợn), dùng kẻo vô trùng cắt nhẹ ở đầu tai hoặc dùng kim tiêm vô trùng chọc ngang một mạch máu nhỏ ở đầu tai sau khi đã cắt lông và sát trùng. Đối với những động vật thí nghiệm (chuột bạch, chuột lang) thì cố định đầu và nắm đuôi kẻo mạnh rồi cắt chóp đuôi. Đối với gia cầm và chim thì dùng kim đâm vào tĩnh mạch cánh để lấy máu. * Kiểm tra máu tươi Cho một giọt máu vào giữa phiến kính khô, trong và sạch, đặt một lá kính lên giọt máu sao cho giọt máu dàn mỏng ra (có thể nhỏ vào cạnh lá kính một giọt dung dịch natri citrat 2% để máu chậm đông, dễ kiểm tra hơn). Kiểm tra dưới kính hiển vi, độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40. Phương pháp kiểm tra máu tươi phát hiện được các loài tiên mao trùng còn sống (Trypanosoma sp.). * Kiểm tra tiêu bản máu nhuộm màu Phương pháp kiểm tra tiêu bản máu nhuộm màu là phương pháp thường dùng để 16
phát hiện hầu hết các loài ký sinh trùng ký sinh trong máu (kể cả các ký sinh trùng ký sinh trong huyết tương và hồng cầu). Kỹ thuật dàn máu trên phiến kính: chuẩn bị những phiến kính mới đã được tẩy mỡ bằng cách đã được rửa xà phòng thật sạch, ngâm vào cồn 960, trước khi dùng lưu khô bằng khăn mềm và không có xơ. Chọn những lá kính kích thước 2 x 2 cm, càng mỏng càng tốt, rìa thật phẳng và nhẵn. Đặt một giọt máu nhỏ lên một đầu phiến kính, cách bờ phiến kính khoảng lem. Đặt cạnh của một lá kính lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính. Khi giọt máu đã tràn ra khắp cạnh của lá kính thì đẩy lá kính về phía trước, làm cho máu được dàn thành một lớp mỏng và đều trên phiến kính (máu dàn theo lá kính chứ không phải bị lá kính đẩy đi). Cố định tiêu bản bằng cồn methanol. Để khô tiêu bản rồi nhuộm Giemsa từ 30 60 phút (dung dịch Giemsa được pha theo tỷ lệ: dung dịch Giemsa cơ bản 1 phần, nước cất trung tính 9 phần). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, vẩy và để khô. Kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu, độ phóng đại 10 x 90 hoặc 10 x 100 (có dầu Cedre dầu bạch dương). Phương pháp này phát hiện được các ký sinh trùng đường máu: Trypanosoma sp., Theileria sp., Babesia sp. (Piroplasma sp., Anaplasma sp.)... 2.4. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Khi gia súc nhiễm ký sinh trùng đường máu, nếu số lượng ký sinh trùng còn ít, xét nghiệm máu chưa tìm thấy ký sinh trùng thì có thể lấy máu của con vật nghi mắc bệnh tiêm truyền cho động vật mẫn cảm với loài ký sinh trùng ấy. Trong cơ thể động vật thí nghiệm, ký sinh trùng sẽ sinh sản rất nhanh, làm cho động vật thí nghiệm có biểu hiện lâm sàng, kiểm tra máu động vật thí nghiệm dễ tìm thấy ký sinh trùng hơn. Tuỳ theo loài ký sinh trùng mà động vật thí nghiệm có thể là chuột bạch, chuột lang, thỏ (đối với tiên mao trùng T. evansi), bê (đối với lê dạng trùng Piroplasma bigeminum) Các bước cần tiến hành gồm: chuẩn bị động vật mẫn cảm với ký sinh trùng định tiêm truyền, lấy máu con vật nghi mắc bệnh (sử dụng dung dịch nam citrat 2% để chống đông máu), tiêm truyền máu của con vật nghi mắc bệnh cho động vật thí nghiệm, truyền vào phúc mạc hoặc tĩnh mạch, theo dõi động vật thí nghiệm sau khi tiêm truyền (triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm máu động vật thí nghiệm tìm ký sinh trùng đường máu). 2.5. Các phương pháp chẩn đoán miễn dịch bệnh đơn bào đường máu * Phương pháp miễn dịch ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA dùng để phát hiện kháng nguyên (còn gọi là ELISA kháng nguyên) đã được Nantulya và Lindquist mô tả năm 1989. Các báo cáo về kết quả sử dụng phương pháp này cho thấy, kỹ thuật ELISA nhậy hơn so với các phương pháp giám định khác và rất đặc hiệu với các loài Trypanosoma sp.. 17
Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng đĩa nhựa được gắn kháng nguyên đã biết. Kháng thể nghi có trong huyết thanh con vật nghi mắc bệnh sẽ kết h ợp v ới kháng nguyên đã được gắn vào địa. Sau đó, một kháng thể kháng lại IgG của bò được gắn với men Peroxydase được nhỏ vào sẽ kết hợp với kháng thể nếu có trong huyết thanh cần xét nghiệm. Sự có mặt của men Peroxydase được phát hiện nhờ một cơ chất (Substrate) với sự xuất hiện mầu. Tuỳ theo chất làm hiện mầu (Chromogene) mà khi đọc kết quả sẽ sử dụng các kính đọc khác nhau. Phương pháp EusA gồm các bước sau: Bước 1 : gắn kháng nguyên vào đĩa nhựa, ủ đĩa ở 37 0C trong 2 giờ hoặc ủ qua đêm ở 40C. Bước 2: rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS (Phosphat Buffered Saline). Bước 3 : nhỏ huyết thanh nghi. Ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ Bước 4: rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS Bước 5: nhỏ IgG của thỏ hoặc dê kháng IgG của bò gắn với men Peroxydase. Ủ đĩa ở 370C trong 1 giờ. Bước 6: rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS. Bước 7: nhỏ cơ chất Bước 8: đọc kết quả bằng quang phổ kế (Spectrophotometer) Độ nhậy của phương pháp ELISA phát hiện kháng thể đạt đến 90 95% và được hầu hết các tác giả thừa nhận. * Các phương pháp huyết thanh học Một vài kỹ thuật phát hiện kháng thể đã được khảo nghiệm để chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng đường máu gây ra ở động vật, bao gồm: phương pháp ELISA trên địa nhựa (Luckins, 1977) và phương pháp ngưng kết trên cam (thường được gọi là phương pháp CARD TEST). Nhìn chung, các phương pháp này có độ nhậy cao nhưng tính đặc hiệu thấp Đôi khi các phương pháp này có phản ứng chéo nên không thể phân biệt các loài với nhau. Ngoài ra, phương pháp huyết thanh học có thể xác định được con vật mắc bệnh nhưng chưa chắc đã xác định được tình trạng bệnh lúc chẩn đoán (vì có thể lúc chẩn đoán thì con vật đã khỏi bệnh nhưng kháng thể vẫn còn trong huyết thanh). Trong các phương pháp huyết thanh để chẩn đoán bệnh đơn bào đường máu gây ra thì phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT: Indirect Fluorescent Antibody Test) được coi là phương pháp thích hợp nhất để phát hiện kháng thể đặc hiệu của loài (species/specific antibodyl. Phương pháp của Wilson (1969) đã được Katende và cs (1987) cải tiến bước chuẩn bị kháng nguyên, đó là cố định đơn bào tươi lên tiêu bản bằng hỗn hợp Aceton lạnh 80% và Fonnalin 0,25%. 18
Theo Plant và cs (1976), Well và cs (1982), các bước tiến hành như sau: Bước 1 : chuẩn bị tiêu bản dàn máu của con vật mắc bệnh ký sinh trùng đường máu nặng (hoặc tiêu bản từ huyễn dịch chứa ký sinh trùng). Để khô trong điều kiện nhiệt độ môi trường rồi cố định bằng cồn Aceton (hoặc hỗn hợp Aceton lạnh 80% và Formalin 0,25%), để trong 5 phút. Bước 2: dùng bút chì mỡ vẽ các vòng tròn có đường kính 5 mm ở các vùng khác nhau trong vùng dàn của tiêu bản. Bước 3: dùng pipet hút các huyết thanh nghi đã pha loãng 1/40 nhỏ riêng rẽ vào các vòng tròn vừa khoanh trên tiêu bản. Chú ý mỗi vòng tròn đều được phủ kín huyết thanh. Bước 4: ủ hỗn hợp kháng nguyên huyết thanh nghỉ 30 phút trong tủ ấm 370C. Bước 5: rửa tiêu bản 3 lần bằng dung dịch PBS, mỗi lần 5 phút ở 4 0C Có lắc nhẹ. Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng. Bước 6: nhỏ kháng thể IgG của thỏ hoặc dê kháng IgG của bò gắn với thuốc.nhuộm huỳnh quang nuorescent isothiocyanate. Bước 7: ủ và rửa tiêu bản như trên, tráng bằng nước cất. Để khô tiêu bản ở nhiệt độ phòng. Bước 8: gắn lamen với dung dịch PBS hoặc Glycerin và kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang. * Phương pháp phát hiện ADN của đơn bào bằng phản ứng PCR (Polymerase Châm Reaction). PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán một vài bệnh ký sinh trùng đường máu. Nguyên lý của phản ứng PCR là dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt ADN của ký sinh trùng đường máu ở động vật. Phương pháp PCR có độ nhậy và độ chính xác rất cao, song phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện dại và kỹ thuật cao. Hiện nay, phương pháp PCR mới được thử nghiệm ở một số phòng thí nghiệm hiện đại. 19