Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 1 - Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giáo trình Vi sinh đại cương cung cấp cho người học những kiến thức như: Các yêu cầu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật; Môi trường nuôi cấy và các nguồn vi sinh vật; Quan sát vi sinh vật; Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi khuẩn thuần khiết; các phương pháp nhuộm vi khuẩn;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung phần 1 giáo trình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Vi sinh đại cương (Nghề: Bảo vệ thực vật - Cao đẳng): Phần 1 - Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp

UỶ BAN NHÂN DÂN TỈNH ĐỒNG THÁP TRƯỜNG CAO ĐẲNG CỘNG ĐỒNG ĐỒNG THÁP GIÁO TRÌNH MÔN HỌC: VINH SINH ĐẠI CƯƠNG NGÀNH, NGHỀ: BẢO VỆ THỰC VẬT TRÌNH ĐỘ: CAO ĐẲNG (Ban hành kèm theo Quyết định Số:…./QĐ-CĐCĐ-ĐT ngày… tháng… năm 2017 của Hiệu trưởng Trường Cao đẳng Cộng đồng Đồng Tháp) Đồng Tháp, năm 2017
TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN Tài liệu này thuộc loại sách giáo trình nên các nguồn thông tin có thể được phép dùng nguyên bản hoặc trích dùng cho các mục đích về đào tạo và tham khảo. Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc hoặc sử dụng với mục đích kinh doanh thiếu lành mạnh sẽ bị nghiêm cấm. ii
LỜI GIỚI THIỆU Xuất phát từ nhu cầu thực tế của môn học vi sinh đại cương, chúng tôi biên soạn bài giảng này, với mong muốn giúp cho các đối tượng sinh viên cao đẳng năm thứ hai Khoa nông nghiệp thủy sản thực hành được một số kỹ thuật cơ bản về vi sinh học để hiểu sâu những nội dung đã được học trong phần lý thuyết. Lần đầu tiên biên soạn bài giảng thực hành phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhà trường, phù hợp với yêu cầu thực tế và phù hợp với trình độ của sinh viên, chúng tôi không sao tránh khỏi những thiếu sót, do đó nhóm tác giả rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành của các chuyên gia và của sinh viên, để lần tái bản sau sẽ sửa chữa bổ sung nội dung theo hướng cập nhật hóa, hiện đại hóa và thực tiễn tại Việt Nam. Đây là cuốn giáo trình được biên soạn công phu, nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy chúng tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của đồng nghiệp và các độc giả. Xin chân thành cảm ơn. Đồng Tháp, ngày 26 tháng 5 năm 2017 Chủ biên Tăng Thị Thanh Hương ii
MỤC LỤC Trang Bài 1. Các yêu cầu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật .................................................................................................................... 1 Bài 2. Môi trường nuôi cấy và các nguồn vi sinh vật ............................................... 9 Bài 3. Quan sát vi sinh vật ..................................................................................... 16 Bài 4. Kỹ thuật gieo cấy và phân lập vi khuẩn thuần khiết ..................................... 20 Bài 5. các phương pháp nhuộm vi khuẩn .............................................................. 28 Bài 6. Phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật ............................................. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................43 ii
GIÁO TRÌNH MÔN HỌC Tên môn học: VI SINH ĐẠI CƯƠNG Mã môn học: CNN221 Vị trí, tính chất, ý nghĩa và vai trò của mô đun: - Vị trí: Vi sinh đại cương là môn học kỹ năng chuyên ngành bắt buộc, được bố trí sau khi người học đã học xong chương trình các môn học chung và các môn học cơ sở. - Tính chất: đây là một trong những môn học kỹ năng quan trọng, giúp sinh viên hiểu về các hoạt động Vi sinh đại cươngvà các kỹ năng cần thiết trong hoạt động khuyến nông. Ý nghĩa và vai trò: Giáo trình này cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản nhất về nông Khuyến nông, kỹ thuật tổ chức và quản lý các chương trình Vi sinh đại cương nhằm giúp sinh viên sau khi ra trường có thể nắm được các kỹ năng cần thiết để xây dựng và quản lý chương trình Vi sinh đại cươngmột cách hiệu quả nhất Mục tiêu của mô đun: - Về kiến thức: + Hiểu được Vi sinh đại cươngl à gì, các hoạt động của vi sinh đại cương + Biết được phương pháp tiếp xúc với nông dân như thế nào để nông dân có cảm tình và đạt hiệu quả cao trong công việc + Biết các nguyên tắc thuyết phục nông dân hành động và biết cách tổ chức những buổi tập huấn, hội họp + Nắm bắt được các cách thiết kế bài giảng, áp phích, bảng lật, tờ bướm. - Về kỹ năng: + Thực hiện các nguyên tắc để lấy thiện cảm với nông dân + Xây dựng được bài thuyế trình và thực hiện thuyết trình trước nông dân đạt hiệu quả tốt + Thực hiện tổ chức những buổi hội thảo, tập huấn cho nông dân + Thiết kế được các bảng lật, bài báo cáo sinh động, dễ hiểu. - Về năng lực tự chủ và trách nhiệm: + Rèn luyện tính cẩn thận, ham học hỏi. i
+ Làm việc độc lập hoặc làm việc theo nhóm, giải quyết công việc, vấn đề phức tạp trong điều kiện làm việc thay đổi, chịu trách nhiệm cá nhân và trách nhiệm đối với nhóm. Nội dung của mô đun: Thời gian (giờ) Thực Số Tên bài, mục Tổng Lý hành, thí TT nghiệm, Kiểm tra số thuyết thảo luận, bài tập Chương 1: Các yêu câu cơ bản và cách sử dụng các thiết bị 1 1 1 trong phòng thí nghiệm vi sinh vật Chương 2: Môi Trường Nuôi 2 Cấy và Các Nguồn Vi Sinh 1 1 Vật 3 Chương 3: Quan Sát Vinh Vật 2 2 Chương 4: Kỹ Thuật Gieo Và 4 Phân Lập Vị Khuẩn Thuần 12 4 8 Khiết 5 Kiểm tra 1 1 Chương 5: Phương Pháp 6 15 3 12 Nhuộm Vi Khuẩn Chương 6: Phương pháp Điếm 7 11 3 8 Số Lượng Tế bào Vi Sinh Vật 8 Ôn thi 1 1 9 Thi/kiểm tra kết thúc môn học 1 1 Cộng 45 14 28 3 ii
Chương 1 CÁC YÊU CẦU CƠ BẢN VÀ CÁCH SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT Vi sinh vật được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, vì vậy khi nuôi cấy một loại vi sinh vật nào đó để phục vụ cho nghiên cứu thì rất dễ bị tạp nhiễm, do đó khi xây dựng phòng thí nghiệm cần chú ý địa điểm, vị trí, hướng gió và cách phân bổ từng khu vực trong phòng làm việc để bố trí các dụng cụ, thiết bị nhằm tránh tạp nhiễm khi nuôi cấy. Thiết bị cơ bản nhất để quan sát vi sinh vật là kính hiển vi, bởi vì kích thứơc tế bào vi sinh vật rất nhỏ, mắt thường không thể thấy được. Muốn quan sát hình thái, cấu tạo… của vi sinh vật ta phải sử dụng nó. Kính hiển vi là dụng cụ quang học giúp phóng đại mẫu vật lên gấp nhiều lần và chúng ta có thể quan sát ảnh của chúng được rõ. 1.1 Mục đích-yêu cầu - Giúp sinh viên biết những quy tắc an toàn vi sinh vật trong phòng thí nghiệm - Biết sát trùng dụng cụ thực hành và phòng thí nghiệm vi sinh - Biết cấu tạo và cách sử dụng các thiết bị trong phòng thí nghiệm, đặc biệt là cách bảo quản kính hiển vi. 1.2 Dụng cụ và thiết bị - Tủ cấy vi sinh vật - Tủ ủ ấm - Tủ khử trùng nhiệt khô - Nồi khử trùng nhiệt ướt (Autoclave) - Các dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, ống đong, đủa thủy tinh, đĩa đồng hồ, que trang… - Kính hiển vi quang học (Olympus) - Nhiệt kế, pH kế - Máy lắc (Vortex) - Dầu cèdre 1.3 Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm 1. Các yêu cầu về phòng kiểm nghiệm 1
- Phòng kiểm nghiệm phải được xây dựng nơi cao ráo, tháng mát, tránh nơi cộng cộng. Trong phòng phải phân biệt thành từng khu vực riêng biệt như: thu và lưu mẫu, rửa dụng cụ, khử trùng dụng cụ, bảo quản hóa chất, nuôi cấy mẫu… - Cửa luôn đóng để làm giảm thiểu sự dịch chuyển không khí, ngăn ngừa bụi làm giảm ngoại nhiễm. - Máy điều hòa không khí để kiểm soát độ ẩm, nhiệt độ - Khử trùng phòng bằng formol 37% 2. Các quy tắc an toàn trong phòng kiểm nghiệm vi sinh Cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm: - Không ăn uống, hút thuốc trong phòng - Mặc áo blouse, mang găng tay và mang khẩu trang trong thời gian làm việc với vi sinh vật - Khử trùng mặt bàn bằng cồn 70oC lau bằng giấy thấm và khử trùng tay bằng cồn 70oC hoặc dung dịch diệt khuẩn khác. - Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người cấy lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm, bình nuôi cấy. - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng, (không hút bằng miệng) - Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng nhiễm vi sinh vật và hấp khử trùng trước khi bỏ vào các bãi rác. - Gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp đĩa petri. - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt đầu que cấy châm vào ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. - Rửa dụng cụ bằng xà bông nước để khử trùng. - Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm. 1.4 Một số thiết bị thƣờng dùng 1. Tủ cấy vi sinh vật a. Công dụng: tủ cấy là thiết bị bảo đảm ở buồng cấy không có vi sinh vật, ta có thể dùng môi trường vô trùng và mẫu vật định cấy đưa vào để nhân giống hoặc cấy chuyền (trong điều kiện vô trùng) 2
b. Cấu tạo: tủ cấy 1 người hoặc tủ cấy 2 người được che kín bên trên nóc, phía trong có cấu tạo gồm: - Quạt gió và lưới lọc bên trên, khi mở điện quạt gió luôn thổi ra làm cho không khí bên ngoài không tràn vào được, hệ thống lưới lọc ngăn cản bụi bẩn - Hệ thống đèn cực tím để khử trùng mặt bàn và buồng cấy - Đèn chiếu sáng để tạo đủ ánh sáng cho buồng cấy - Công tắc ở bên phải tủ cấy c. Cách sử dụng Tủ cấy luôn đặt ở vị trí tránh gió lùa, hạn chế người qua lại, thường ở phòng kín. Trước khi sử dụng phải khử trùng tủ bằng cách dùng bình xịt tay có chứa cồn 70oC để xịt xung quanh bên trong, ngoài cánh tủ và bàn cấy rồi dùng giấy thấm lau khô. Mở điện, đèn cực tím, đèn chiếu sáng và đóng kín cửa tủ, đèn cực tím bật lên, đèn chiếu sáng tự động tắt, sau 30 phút khử trùng, mới có thể đưa mẫu vật vào cấy. Khi mở cửa tủ, đèn cực tím tự động tắt và đèn chiếu sáng sẽ bật lên, lúc đó buồng cấy đã sẵn sàng cấy. Sau khi sử dụng xong, ta tắt tất cả các đèn và tủ rồi đóng kín cửa để hạn chế vi sinh vật lạ 2. Tủ ủ (incubator) a. Công dụng Tủ ủ là thiết bị tạo nhiệt độ cần thiết để nuôi cấy vi sinh vật, nhiệt độ có thể thay đổi từ 25 – 60oC b. Cấu tạo: tủ ủ có cấu tạo đơn giản, gồm có vỏ và điện trở - Vỏ tủ ủ cấu tạo gồm 2 lớp, ở giữa có đệm một lớp cách nhiệt - Điện trở để cung cấp nhiệt làm nóng bầu không khí trong tủ và có một bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự động (rờ le) để giữ nhiệt độ cố định theo yêu cầu thí nghiệm. c. Cách sử dụng Bật công tắt, xoay nút điều chỉnh nhiệt độ mong muốn, theo dõi nhiệt độ trên nhiệt kế cho đến khi ổn định theo nhiệt độ đã điều chỉnh. 3. Tủ khử trùng nhiệt khô (dry-air sterilizer) a. Công dụng 3
Tủ khử trùng nhiệt khô dùng để khử trùng các vật dụng không bị nhiệt độ phá hủy như thủy tinh, kim loại. Nhiệt khô có thể thay đổi từ 70-200oC. b. Cấu tạo Tủ khử trùng nhiệt khô có cấu tạo giống như tủ ủ nhưng cấu tạo 2 lớp vỏ chắc chắn hơn, điện trở có công suất cao để đưa nhiệt độ lên cao. c. Cách sử dụng Sau khi rửa sạch dụng cụ cần khử trùng nhiệt khô, để khô, gói lại bằng giấy không thấm nước, cho vào tủ. Mở điện, xoay nút điều chỉnh nhiệt độ và theo dỏi nhiệt kế đến khi nhiệt độ đạt mức mong muốn, bắt đầu tính giờ khử trùng. Thời gian khử trùng thay đổi từ 1-3 giờ (tùy theo số lượng và kích thước của vật dụng cần khử trùng) tính từ khi nhiệt độ lên đến 170oC. Khi đã đủ thời gian khử trùng cần thiết, tắt điện và chờ nhiệt độ hạ xuống từ từ đến 40oC - 45oC thì mở tủ lấy vật dụng khử trùng ra. 4. Nồi khử trùng nhiệt ƣớt (autoclave) a. Công dụng Nồi khử trùng nhiệt ướt là thiết bị dùng hơi nước ở nhiệt độ cao (121oC) bằng cách nâng áp suất trong nồi lên (1kgf/cm2) để khử trùng các vật dụng hoặc môi trường để nuôi cấy vi sinh vật. b. Cấu tạo Nồi khử trùng nhiệt ướt được cấu tạo bằng kim loại, chắc chắn, dầy, có 2 lớp vỏ và có khả năng chịu được áp suất cao. Khí trong nồi là buồng khử trùng (nơi chứa các vật dụng cần khử trùng), buồng khử trùng có lắp van thoát không khí, áp kế, nhiệt kế để đo áp suất, nhiệt độ hơi nước và van bảo hiểm để xì hơi khi áp suất vượt quá mức an toàn và đảm bảo nồi không bị nổ. Nước cất hoặc được đổ vào bên dưới nồi, hơi nước từ khoang chứa được cung cấp cho buồng khử trùng. Phía trên nồi khử trùng có 1 nắp nặng được khóa chắc chắn bằng các nút vặn khít với buồng khử trùng bằng vòng đệm cao su . c. Cách sử dụng Cho vật dụng cần khử trùng vào buồng khử trùng, đổ nước sạch hoặc (nước cất 1 lần) vào khoang chứa nước, đậy nắp khoang chứa nước rồi cho các vật dụng cần khử trùng vào và đậy nắp nồi, khóa kín để không cho không khí hay hơi nước thoát ra ngoài. Mở điện, điện trở bên dưới nồi sẽ cung cấp nhiệt làm sôi nước trong khoang chứa tạo ra hơi nước làm cho áp suất trong khoang tăng lên. 4
Điều chỉnh Autoclave bằng cách chỉnh nhiệt độ đến 1210C, khi nhiệt độ tăng 100oC, nước bốc hơi, hơi nước bị giữ trong điều kiện kín sẽ tăng áp suất và nhiệt độ tiếp tục tăng đến khi đạt nhiệt độ 121 oC thì lúc đó cũng đạt áp suất tương ứng 1kgf/cm2 , sau cùng điều chỉnh đồng hồ chỉ thời gian khử trùng. Khi áp suất tăng lên 1kgf/cm2 trong buồng khử trùng, thời gian khử trùng sẽ được tính. Thời gian khử trùng lâu hay mau tùy loại vật dụng khử trùng. Nồi khử trùng tự động tắt và xả hơi tùy theo thời gian điều chỉnh. Sau khi khử trùng xong, phải đợi cho áp suất trong buồng khử trùng xuống đến 0 mới mở nắp nồi lấy vật dụng ra. 4. Kính hiển vi quang học a. Cấu tạo: kính hiển vi quang học gồm 2 bộ thấu kính: vật kính và thị kính, sử dụng ánh sáng thấy được như một nguồn sáng. Một dãy thấu kính tập trung rõ ràng vào một hình ảnh sẽ được phóng đại lên nhiều lần. Sự phóng đại này sẽ đạt được khi các tia sáng từ một nguồn sáng đi qua một kính hội tụ để hướng ánh sáng đi qua mẫu vật. Sau đó, các tia sáng sẽ đi qua vật kính, là một thấu kính gần mẫu vật nhất. Hình ảnh của mẫu vật sẽ được phóng đại thêm một lần nữa bởi thị kính. Độ phóng đại toàn phần của một mẫu vật được tính bằng cách nhân độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính. Đa số kính hiển vi quang học dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh đều có nhiều vật kính, đó là các vật kính 10x, 40x, 100x. Phần lớn các thị kính đều có độ phóng đại 10x. Nhân độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính, ta sẽ có độ phóng đại toàn phần là 100x, 400x, 1000x. Một vài loại kính có thể đạt được độ phóng đại 2000x với vật kính dầu. Độ phân giải là khả năng của các thấu kính có thể phân biệt được các chi tiết hay cấu trúc rất nhỏ của mẫu vật. Đây chính là khả năng của các thấu kính có thể phân biệt được hai điểm cách nhau một khoảng cách nhất định. b. Công dụng: quan sát được những mẫu vật rất nhỏ cũng như một vài chi tiết cấu trúc của chúng. c. Cách sử dụng kính Cách tìm vi trường: nghĩa là sau khi điều chỉnh ta có thể tìm thấy hình ảnh của mẫu vật cần quan sát dưới kính hiển vi. Cần thực hiện các bước sau: Đặt miếng lame có mang mẫu vật lên giá để kính 5
Xoay vật kính 10x và 40x đúng nấc rồi điều chỉnh vật kính để nhìn thấy được mẫu vật. Sau đó nhỏ giọt dầu lên tiêu bản và xoay vật kính về đúng nấc 100x Nhẹ nhàng hạ vật kính xuống sao cho vật kính xuống sát tiêu bản và nhúng vào trong giọt dầu. Trong suốt quá trình này, mắt không nhìn vào thị kính mà phải nhìn ngang từ bên ngoài vào khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản để tránh hạ vật kính xuống quá thấp làm vỡ tiêu bản. Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp. Để quan sát vi khuẩn trên một mẫu vật đã nhuộm, chúng ta cần điều chỉnh ánh sáng tăng dần theo độ phóng đại của vật kính 10x
Dùng giấy lau kính đặc biệt lau sạch dầu ở vật kính dầu Chú ý: xoay vật kính 10x vào nấc và điều chỉnh cho tới khi vật kính này xuống mức thấp nhất (vị trí nghỉ) - Điều chỉnh các ốc chỉnh biên độ về vị trí giữa - Lau sạch bụi phấn, giá để kính và đế kính - Cầm kính hiển vi bằng 2 tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ bệ kính, và đem cất vào đúng vị trí trong phòng kính. Đậy bao dậy kính lại 5. Các dụng cụ bằng thủy tinh - Ống nghiệm có nắp đậy bằng bông không thấm nước hoặc bằng nút nhựa, nhôm hay Inox. - Đĩa Petri bằng thủy tinh - Các dụng cụ khác: cốc thủy tinh, bình cầu đáy bằng và tròn, bình tam giác, các loại ống đong, ống hút. * Tất cả dụng cụ cần phải được rửa sạch, tráng qua nước cất và khử trùng ở nhiệt khô hoặc nhiệt ướt (tùy loại). 6. Nhiệt kế: Các nhiệt kế chuẩn nên dùng loại chia độ đến 0,1oC, đo được từ 0oC-100oC 7. pH kế: Sử dụng máy đo pH để xác định pH của môi trường nuôi cấy hoặc các dung dịch hóa chất. 8. Tủ lạnh hoặc tủ trữ mẫu vật: sử dụng tủ có nhiệt độ từ 4-10oC để lưu giữ mẫu và một số hóa chất, môi trường nuôi cấy. 1.5 . Thực hành 1. Sinh viên quan sát và tập sử dụng: kính hiển vi, tủ ủ ấm, tủ khử trùng nhiệt khô, nồi khử trùng nhiệt ướt, tủ cấy vi sinh. 2. Rửa và khử trùng các dụng cụ thủy tinh bằng tủ khử trùng nhiệt khô 7
CÂU HỎI 1. Hãy sắp xếp những dụng cụ sau đây, loại nào khử trùng nhiệt ướt, loại nào khử trùng nhiệt khô: bình tam giác, đủa thủy tinh, môi trường nuôi cấy, quả bóp cao su, nước cất, đầu col của micropipette ? 2. Làm thế nào để khử trùng phòng nuôi cấy vi sinh ? 3. Khi phân lập nấm thì sử dụng loại kim cấy nào để đạt hiệu quả cao? 4. Vai trò của dầu cèdre khi sử dụng vật kính nhúng dầu 100x ? 5. Cách lau vật kính nhúng dầu sau khi sử dụng? 6. Nếu là môi trường lỏng, thì phải khử trùng bằng thiết bị nào cho thích hợp? tại sao? 8
Chương 2 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC NGUỒN VI SINH VẬT 2.1. Mục đích - yêu cầu - Giúp sinh viên nắm vững phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật . - Phân biệt một số môi trường cơ bản và mục đích sử dụng của các môi trường này. - Sinh viên biết cách nhận biết một số dạng khuẩn lạc. 2.2. Vật liệu và thiết bị 1. Dụng cụ thủy tinh: mỗi nhóm sinh viên cần: - 3 bình tam giác 250 ml, hoặc 3 chai thủy tinh có nắp - 2 đủa thủy tinh - 1 vải lược - 13 đĩa pétri đã khử trùng - 1 kim cấy, - 1 Đèn cồn 2. Vật liệu, hóa chất - Khoai tây 30g - agar 3g - glucose 3g - 1 bình xịt chứa cồn 70oC - Môi trường tryptone soya agar (TSA) - Hoặc môi trường Nutrient agar (NA) 3. Công thức môi trƣờng a. Môi trƣờng bán tổng hợp: Khoai tây 20% , Agar 2%, Glucose 2%, Thêm nước cất cho đủ thể tích (ml) b. Môi trƣờng tổng hợp: pha theo công thức ghi trên nhãn 9
2.3. Phƣơng pháp 1. Chuẩn bị dụng cụ thủy tinh - Dụng cụ bằng thủy tinh mới mua về cần phải ngâm với nước xà bông 24 giờ và rửa sạch, nếu dụng cụ cũ thì chỉ cần rửa sạch và tráng lại bằng nước cất rồi làm khô, bao gói kín, kỷ càng để tránh nhiễm trùng trở lại sau khi đã khử trùng. Chai lọ, ống nghiệm bằng thủy tinh phải sạch, được đậy bằng nút bông không thấm nước ; pipette thủy tinh được đút nút bằng một ít bông không thấm nước, sạch ở phía đầu dùng để hút và được quấn kín lại bằng giấy. Đĩa Petri được gói thành từng chồng 4-5 cái. Các dụng cụ khác bằng kim loại (dao mỗ, kẹp…) bằng gốm sứ (chày cối…) cũng phải được bao gói kín trước khi cho vào sấy tiệt trùng. - ống nghiệm phải có nắp đậy, nếu không có nút phải làm nút bằng bông gòn không thấm nước và có nắp giấy bên ngoài. 2. Khử trùng: là một trong những biện pháp cần thiết và quan trọng nhất trong thực nghiệm vi sinh vật học. Nếu khử trùng không được thực hiện một cách triệt để sẽ làm sai lệch kết quả thí nghiệm, kết quả chẩn đoán… do bị lẫn tạp khuẩn có sẵn trong môi trường. Các dụng cụ bằng thủy tinh, kim loại thường áp dụng phương pháp khử trùng bằng nhiệt độ khô. Đối với môi trường dinh dưỡng người ta sử dụng phương pháp hấp ướt bằng nồi hấp tiệt trùng (autoclave). a. Khử trùng bằng tủ sấy: đây là phương pháp cơ bản được dùng để khử trùng các dụng cụ thủy tinh, kim loại trong phòng thí nghiệm vi sinh vật. Nhiệt độ và thời gian tương ứng cho việc khử trùng dụng cụ bằng không khí nóng được qui định như sau: - Khử trùng ở nhiệt độ 150oC  thời gian sấy 2 giờ liên tục - Khử trùng ở nhiệt độ 160oC  thời gian sấy 1-1 giờ 30 phút liên tục - Khử trùng ở nhiệt độ 170oC  thời gian sấy 30 phút - 1giờ liên tục Chú ý: thời gian sấy theo qui định chỉ được tính khi nhiệt kế của tủ sấy đạt đến nhiệt độ tương ứng Các dụng cụ đã khử trùng xong phải được bảo quản ở chỗ kín, tránh bụi bẫn và chỉ được mở bao giấy ngay trước khi sử dụng chúng. Thời gian bảo quản các dụng 10
cụ đã khử trùng không nên quá một tuần, sau thời hạn này các dụng cụ dù đã khử trùng nhưng nếu chưa được sử dụng thì vẫn phải khử trùng lại rồi mới sử dụng được. b. Khử trùng môi trƣờng dinh dƣỡng bằng Autoclave (nồi hấp tiệt trùng) Phương pháp này dựa trên tác dụng phối hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất của hơi nước để đảm bảo cho việc khử trùng được thực hiện tốt. - Thời gian hấp tương ứng phải được tính từ lúc nhiệt độ và áp suất trên đồng hồ đo chỉ đúng các giá trị qui định tương ứng. - Phương pháp khử trùng bằng autoclave dựa trên tác dụng phối hợp của nhiệt độ và áp suất hơi nước, do đó cần phải loại hết không khí có sẵn trong nồi hấp thì việc khử trùng mới đạt kết quả tốt. Để loại bỏ hết không khí trong nồi thì khi nồi hấp bắt đầu hoạt động, các van xả của nồi phải ở vị trí mở để khi nước trong nồi sôi lên, hơi nước sẽ đẩy không khí trong nồi ra ngoài và chiếm chỗ của không khí. Thời gian từ lúc tháy có hơi nước xì ra ở van đến lúc van được đóng lại là khoảng 10-15 phút. Cần kiểm tra mực nước trong nồi cho đủ trước khi đậy nấp kín: mực nước trong nồi phải ở mức qui định, nếu không sẽ không đảm bảo được áp suất hơi nước, việc khử trùng sẽ không đạt được kết quả tốt. - Môi trường sau khi khử trùng không được sử dụng ngay để nuôi cấy vi sinh vật mà phải được kiểm tra tình trạng vô trùng bằng cách để ở nhiệt độ phòng 1-2 ngày. Sau thời gian này nếu không có tạp khuẩn mọc trên môi trường thì mới được sử dụng. Những môi trường chưa dùng đến phải được bảo quản trong tủ lạnh và ghi rõ tên của từng loại môi trường. Bảng 1. Áp suất, nhiệt độ, thời gian hấp tƣơng ứng trong khử trùng nhiệt ƣớt Áp suất hơi Nhiệt độ (oC) Môi trƣờng đƣợc hấp Thời gian nƣớc (atm) tƣơng ứng hấp (phút) 0,5 112 Sữa, dịch tự phân nấm men 15-20 0,8 117 Sữa, chứa đường glucose 15-20 1,0 121 Dùng nuôi cấy vi sinh vật dị 15-20 dưỡng 1,5 127 Đồ hộp 30 2. Môi trƣờng nuôi cấy 11
Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp thức ăn cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Tùy theo loại vi sinh vật mà công thức môi trường nuôi cấy thay đổi. 2.4. Các loại môi trƣờng nuôi cấy 1. Phân loại môi trƣờng c. Phân theo trạng thái vật lý: agar được sử dụng để làm chất chống đở trong môi trường nuôi cấy. Tùy nồng độ agar thêm vào môi trường mà ta chia làm 3 loại môi trường nuôi cấy: - Môi trường lỏng là dung dịch chứa thức ăn hòa tan trong nước (0% agar). - Môi trường bán đặc là môi trường lỏng có thêm 0,5% agar. - Môi trường đặc có 2% agar. b. Phân loại theo nguồn gốc vật liệu - Môi trường tự nhiên: gồm các chất dinh dưỡng có nguồn gốc từ thiên nhiên như khoai tây, đậu, thịt… trong đó các thành phần hóa học không chính xác và không ổn định. - Môi trường tổng hợp (nhân tạo) có thành phần hóa học xác định - Môi trường bán tổng hợp: môi trường tự nhiên có bổ sung thêm một số thành phần hóa học. c. Phân loại theo công dụng: là môi trường thích hợp cho từng loại vi sinh vật phát triển. Căn cứ theo công dụng ta có thể chia làm 3 loại môi trường: - Môi trường căn bản: là môi trường có thành phần thức ăn thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật. TD môi trường khoai tây agar (PDA). - Môi trường chọn lọc (riêng biệt): chỉ thích hợp cho 1 nhóm vsv nhất định. - Môi trường phân lập: là môi trường chỉ thích hợp cho từng loài vi sinh vật nhất định. 2. Cách pha chế các loại môi trƣờng (quy trình chung) - Pha chế: cân các nguyên liệu theo công thức đã cho, hòa tan vào thể tích nước qui định và khuấy đều. 12
- Đo pH: tùy loài vi sinh vật có thể điều chỉnh pH cho thích hợp (nếu cần). Điều chỉnh pH bằng dung dịch acid hay NaOH - Lọc và phân phối môi trường để giúp môi trường trong suốt, dễ quan sát. Nếu môi trường đặc thì cho 2% agar vào - Khử trùng bằng nhiệt ướt ở áp suất 1kgf/cm2 ~ 121oC trong 15-20 phút hoặc 1 giờ tùy loại môi trường - Bảo quản ở nhiệt độ thấp (4-5oC) 2.5. Thực hành 1. Điều chế môi trƣờng khoai tây, agar a. Gọt vỏ khoai tây, cân và xắt mỏng cho vào nồi và thêm nước cất. Đun sôi 15 phút, chắc lấy nước cốt khoai tây cho vào bình tam giác. b. Lọc môi trường qua vải lọc, thêm nước cất cho đủ thể tích rồi cân agar và glucose cho vào bình tam giác có nước cốt khoai tây, đun nhẹ cho tan agar, khi đun dùng đủa thủy tinh khuấy đều . c. Sau đó chiết môi trường vào ống nghiệm rồi khử trùng bằng nhiệt ướt ở 121 C ~ áp suất 1kgf/cm2 trong 15-20 phút. Nếu phân phối môi trường vào đĩa Petri thì o khử trùng xong mới phân phối môi trường vào đĩa petri (đã được khử trùng). 2. Pha chế môi trƣờng tổng hợp - Cân loại môi trường cần pha chế theo nồng độ qui định, cho vào bình tam giác - Thêm nước cất vào cho đúng thể tích, dùng đủa thủy tinh khuấy đều - Đun nhẹ cho các chất tan trong nước - Đưa vào nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121oC/15-20 phút - Khử trùng xong, phân phối môi trường vào đĩa petri trong điều kiện vô trùng 3. Lấy các nguồn vi sinh vật trong thiên nhiên a. Từ bàn tay: đóng cửa phòng, tắt quạt. Dùng cồn sát trùng 2 bàn tay và mặt bàn xung quanh chỗ cấy. Tay phải lấy 1 cây tăm có quấn bông gòn ở đầu (đã khử trùng) xoe ở cổ tay trái (nơi không sát trùng). Sau đó mở nhẹ nắp môi trường, tay phải cầm que tăm cấy lên đĩa môi trường theo đường chữ Z (không làm rách mặt agar). Đậy 13
nắp đĩa và đặt ngược đáy lên trên và cho vào tủ ủ ở 30-35oC. Quan sát kết quả sau 24 giờ b. Từ miệng: - Đóng cửa phòng, tắt quạt. Đốt đèn cồn, dùng cồn sát trùng tay và mặt bàn chung quanh chỗ cấy. - Dùng tăm có quấn gòn ở đầu (đã khử trùng) chạm nhẹ vào lưỡi, tay trái hé nhẹ đĩa petri rồi cấy lên mặt đĩa theo hình chữ Z. Đậy nắp đĩa và lật ngược đĩa petri, cho vào tủ ủ ở 30-35oC. - Quan sát kết quả sau 24 -48 giờ c. Từ không khí: - Khử trùng tay bằng cồn - Mở cửa phòng, mở quạt để xáo trộn không khí trong phòng - Mở nắp đĩa petri khoảng 5 phút để bào tử và vi sinh vật từ không khí rơi vào môi trường. - Đậy nắp đĩa và lật ngược đĩa petri cho vào tủ ủ ở 30-35oC. - Quan sát kết quả sau 24 giờ Hình 1. Đƣờng cấy hình chữ Z trên mặt môi trƣờng 14