Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen aCGH trong phân tích bất thường nhiễm sắc thể

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ngày nay, kỹ thuật lai so sánh hệ gen (aCGH) đã trở thành một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự mất cân bằng bộ gen với độ phân giải cao hơn nhiều (vài trăm base pair) so với phân tích nhiễm sắc thể đồ truyền thống. Bài viết trình bày việc hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen trong phân tích bất thường nhiễm sắc thể từ mẫu máu và mẫu dịch ối.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen aCGH trong phân tích bất thường nhiễm sắc thể

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 HOÀN THIỆN KỸ THUẬT LAI SO SÁNH HỆ GEN aCGH TRONG PHÂN TÍCH BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Vũ Thị Hà1.2, Hoàng Thị Hải1, Hà Phương Nhung1, Luyện Thị Thanh Nga1, Đoàn Thị Kim Phượng1,2 TÓM TẮT17 SUMMARY Ngày nay, kỹ thuật lai so sánh hệ gen (aCGH) THE COMPLETION OF đã trở thành một công cụ hữu hiệu để phát hiện MICROARRAY-BASED sự mất cân bằng bộ gen với độ phân giải cao hơn COMPARATIVE GENOMIC nhiều (vài trăm base pair) so với phân tích nhiễm HYBRIDIZATION (aCGH) IN DETECTION OF CHOROMOSOMAL sắc thể đồ truyền thống. Mục tiêu: hoàn thiện kỹ ABNORMALITES thuật lai so sánh hệ gen trong phân tích bất Recently, the Microarray-based Comparative thường nhiễm sắc thể từ mẫu máu và mẫu dịch Genomic Hybridization (aCGH) technique has ối. Đối tượng và phương pháp: 24 mẫu máu become an effective tool for detecting genomic ngoại vi và 24 mẫu dịch ối được tách chiết DNA mutation with higher resolution (several hundred và tiến hành kỹ thuật lai so sánh hệ gen tại Trung base pairs) than karyotyping. Objectives: The tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà aim of our study was to complete the aCGH Nội. Kết quả: 24/24 (100%) mẫu máu và 22/24 technique in chromosome abnormal analysis (91,7%) mẫu dịch ối đạt nồng độ chuẩn, 2/24 from blood and amniotic fluid samples. (8,3%) có nồng độ dưới chuẩn, nhưng lượng Methods: 24 samples from peripheral blood and DNA tổng số vẫn đủ để thực hiện quy trình kỹ 24 samples from amniotic fluid were DNA thuật. 100% mẫu đều phân tích được kết quả với extracted and conducted to aCGH technique at tỷ lệ phát hiện bất thường nhiễm sắc thể là Genetic consulting Center, Hanoi Medical 29,2%. Kết luận: Hoàn thiện thành công quy Hospital University. Results: 24/24 (100%) trình kỹ thuật của aCGH với nhiều giai đoạn blood samples and 22/24 (91,7%) amniotic fluid khác nhau, mỗi giai đoạn đều có các tiêu chuẩn samples had DNA concentration in standard để đối chứng, đảm bảo cho quy trình được thành ranges, 2/24 (8.3%) had sub-standard công và kết quả phân tích được rõ ràng và cho concentrations, but the total amount of DNA was phép phát hiện bất thường nhiễm sắc thể với tỷ lệ still sufficient to process. 100% samples could be cao hơn so với phương pháp karyotyping. analysis, and showed 29,2% chromosome Từ khóa: lai so sánh hệ gen, nhiễm sắc thể abnormality. Conclusions: aCGH has many đồ, bất thường nhiễm sắc thể. different stages, each stage has standards to control, to ensure that the process is successful 1 Bệnh viện ĐH Y Hà Nội, and the analysis results are clearly identified and 2 Trường ĐH Y Hà Nội could detect chromosomal abnormalities at a Chịu trách nhiệm chính: Đoàn Thị Kim Phượng higher ratio than the karyotyping. Email: doankimphuong@hmu.edu.vn Key words: Comparative Genomic Ngày nhận bài: 1.10.2020 Hybridization, karyotyping, chromosome Ngày phản biện khoa học: 16.10.2020 Ngày duyệt bài: 19.11.2020 abnormality. 127
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN I. ĐẶT VẤN ĐỀ được một số các biến thể di truyền, hay tính Bất thường nhiễm sắc thể (NST) là những đa hình về kiểu gen cho người bệnh mang rối loạn về cấu trúc hoặc số lượng của một bất thường bẩm sinh nhưng chỉ hạn chế một hay nhiều NST có thể xảy ra trên NST số gen xác định trước. Kỹ thuật lai so sánh thường hay NST giới tính hoặc cả hai. Nhiều hệ gen - Array Comparative Genomic bất thường NST để lại hậu quả nặng nề như Hybridization (aCGH) đã khắc phục được sẩy thai, thai lưu, tử vong sơ sinh hoặc gây ra nhược điểm này của các phương pháp trên. các bệnh lý di truyền [1]. Tuy nhiên cũng có Vì vậy, kỹ thuật lai so sánh hệ gen (aCGH) những bất thường NST không biểu hiện triệu đã trở thành một công cụ hữu hiệu để phát chứng lâm sàng nhưng lại truyền cho các thế hiện sự mất cân bằng bộ gen với độ phân giải hệ sau NST bất thường đó và có biểu hiện cao hơn nhiều (vài trăm base pair) so với kiểu hình ở thế hệ sau. phân tích nhiễm sắc thể đồ [4]. Việc xác định các bất thường di truyền Trên thế giới, kỹ thuật aCGH đã và đang liên quan đến nhiều trường hợp bệnh lý là rất được áp dụng rộng rãi. Năm 2012, một cần thiết để bác sĩ có thể tư vấn di truyền cho nghiên cứu phối hợp nhiều trung tâm chăm bệnh nhân hay gia đình bệnh nhân, cũng như sóc sức khỏe sinh sản tại Mỹ đã báo cáo rằng hỗ trợ tinh thần để giảm thiểu gánh nặng về aCGH đã phát hiện thêm 6% các thai nhi mặt tâm lý và có những can thiệp về mặt y tế được chẩn đoán trước sinh có bất thường di kịp thời, hiệu quả. Để đáp ứng nhu cầu này, truyền mà karyotyping không phát hiện các kỹ thuật phát hiện bất thường di truyền được; khả năng phát hiện bất thường dị bội không ngừng phát triển để có thể phát hiện nhiễm sắc thể của aCGH là tương đương với các bất thường với độ phân giải ngày càng karyotyping [5]. Nghiên cứu của Marketa W. cao. và cộng sự năm 2019 cho thấy aCGH phát Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (Microarray- hiện 5,9% đột biến trên trẻ chậm PTTTVĐ based Comparative Genomic Hybridization mà có karyotype bình thường [6]. Ngày nay, (aCGH)) là một kỹ thuật di truyền tế báo - cộng đồng khoa học ngày càng thảo luận phân tử, cho phép phát hiện số lượng các bản nhiều về dự kiến trong tương lai gần, aCGH sao của các biến thể di truyền trong mẫu có khả năng sẽ thay thế karyotype trong chẩn DNA bệnh nhân mà không cần nuôi cấy tế đoán bất thường di truyền ở mức độ tế bào. bào. Nguyên lý của kỹ thuật này là lai so Nghiên cứu của Kan và cộng sự năm 2014 sánh hai mẫu DNA từ mẫu của bệnh nhân và tại Hongkong đã khuyến cáo dùng aCGH mẫu chứng để phát hiện sự khác biệt về mức như một xét nghiệm ưu tiên thay thế độ tăng hoặc giảm của toàn bộ bộ nhiễm sắc karyotyping vì hiệu quả chẩn đoán và các ưu thể. Việc chẩn đoán bất thường nhiễm sắc điểm của aCGH [7]. thể vẫn được thực hiện thường quy bằng Ở Việt Nam, áp dụng kỹ thuật aCGH cho phương pháp phân tích nhiễm sắc thể chẩn đoán di truyền vẫn còn khá mới mẻ, kỹ (karyotyping). Tuy nhiên, xét nghiệm này thuật này đòi hỏi thực hiện quy trình phức chỉ có thể phát hiện được các bất thường cấu tạp, nghiêm ngặt, đòi hỏi nhân lực được đào trúc nhiễm sắc thể lớn từ 5 Mb trở lên [1], tạo chuyên sâu trong phân tích, giải thích và [2], [3]. Ngoài ra, các kỹ thuật di truyền phân tư vấn kết quả di truyền. Cùng với công cuộc tử khác như PCR, RT-PCR có thể xác định triển khai áp dụng các kỹ thuật mới để nâng 128
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 cao hiệu quả chẩn đoán bất thường di truyền tĩnh mạch hoặc từ mẫu dịch ối được tách ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài này chiết bằng bộ kit Qiagen. với mục tiêu nghiên cứu: 2.2.2. Kỹ thuật lai tín hiệu huỳnh quang: Hoàn thiện kỹ thuật lai so sánh hệ gen DNA đạt tiêu chuẩn về nồng độ và độ tinh trong phân tích bất thường nhiễm sắc thể từ sạch sẽ được tiến hành phân đoạn bằng bộ mẫu máu và mẫu dịch ối. enzym cắt tạo thư viện các đoạn DNA kích thước từ 200-500 bp (tên bộ kit), Sau đó II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU đánh dấu huỳnh quang lên DNA (màu huỳnh 2.1. Đối tượng nghiên cứu quang Cy3 lai với mẫu chứng, Cy5 lai với + Được chia làm 2 nhóm mẫu bệnh). Mẫu sau đánh dấu huỳnh quang - Nhóm I: từ 24 mẫu máu ngoại vi, được được tinh sạch và đưa vào buồng lai của thu thập từ bệnh nhân có 1 hoặc phối hợp các Agilent 8x60K CGH. Kết quả lai được scan đặc điểm sau: chậm phát triển tâm thần, và phân tích bằng phần mềm của chậm phát triển thể chất, bất thường hình thái Cytogenomic của Agilent. bẩm sinh,đã phát hiện bất thường trên NST 2.3. Đạo đức nghiên cứu đồ... Các dị tật đều được khẳng định bởi các Các số liệu và thông tin nghiên cứu là bác sĩ lâm sàng. chính xác, trung thực, khách quan và được - Nhóm II: từ 24 mẫu dịch ối, được thu chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Bệnh nhân thập từ thai phụ có chỉ định chọc ối do thai hoặc người giám hộ hoàn toàn tự nguyện có bất thường hình thái như bất thường hệ tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân và tim mạch, tiết niệu, tiêu hóa, não… người nhà bệnh nhân sẽ được thông báo về + Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2019 kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác đến tháng 9/2020. sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ + Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm tư vấn điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ di truyền, Bệnh viện ĐH Y Hà Nội. được đảm bảo bí mật và chỉ phục vụ công tác 2.2. Phương pháp nghiên cứu nghiên cứu. Phương pháp mô tả cắt ngang 2.2.1. Tách chiết DNA: DNA từ mẫu máu III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả tách chiết DNA Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch DNA của 24 mẫu máu Nồng độ DNA Nồng độ DNA OD 260/230nm OD 260/280nm >20ng/ul 1,8 1,8-2,0 n 24 0 25 25 % 100% 0 100% 100% TB 72,7±40,2 0 1,84±0,07 1,88±0,08 Nhận xét: Kết quả tách chiết bằng bộ kít Qiagen cho nồng độ DNA >20 ng/µl ở tất cả các mẫu; và 100% độ tinh sạch DNA đối với RNA, protein và các chất dư thừa đều đạt chuẩn 129
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN >1,8. Nồng độ DNA thấp nhất là 27,5 ng/ul, cao nhất là 202,5 ng/ul phù hợp với yêu cầu của kĩ thuật aCGH cần nồng độ DNA tối thiểu là 20 ng/ul. Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và độ DNA của 24 mẫu dịch ối Nồng độ DNA Nồng độ DNA OD 260/230nm OD 260/280nm >20ng/ul 1,8 1,8-2,0 n 22 2 25 25 % 91,7% 8,3% 100% 100% TB 30,7±15,2 15,7±2,2 1,87±0,06 1,86±0,04 Nhận xét: Kết quả tách chiết bằng bộ kít Qiagen có 22 mẫu đạt nồng độ DNA >20 ng/µl (91,7%) và 2 mẫu có nồng độ 1,8. 3.2. Hình ảnh phân đoạn DNA bằng enzyme giới hạn Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm phân đoạn DNA bằng điện di trên gel agarose 0,8% Thang DNA của hãng Norgen Biotek Corporation, Canada : Thang DNA với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ S1 đến S8 là các mẫu nghiên cứu. Các giếng từ R1 đến R8 là các mẫu chứng lần lượt tương ứng với S1-S8. Nhận xét: Các band của thang DNA chuẩn đều xuất hiện rõ nét. Các mẫu nghiên cứu từ S1 đến mẫu số S8 và các mẫu chứng từ R1 đến mẫu số R8 đều cho thấy kích thước sản phẩm cắt của các mẫu tập trung ở khoảng từ 200 bp đến 500 bp là kích thước đạt yêu cầu để thực hiện tiếp các bước đánh dấu. Bảng 3.3. Bảng đánh giá chất lượng gắn huỳnh quang Nồng độ DNA được Nồng độ huỳnh Hoạt tính Sản lượng gắn huỳnh quang quang được gắn đặc hiệu đánh dấu (μg) (ng/μl) (pmol/μl) (pmol/μg) Giá trị TB±SD 320,4 ± 30,1 19,2 ± 2,2 3,5 ± 0,3 43 ± 1,3 130
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 Nhận xét: Nồng độ DNA được gắn huỳnh quang là 320,4 ± 30,1 ng/μl, nồng độ huỳnh quang được gắn là 19,2 ± 2,2 pmol/μl, từ đó chúng tôi tính toán được sản lượng đánh dấu (Yield) và hoạt tính đặc hiệu (Specific Activity) của từng loại huỳnh quang lần lượt là 3,5 ± 0,3 μg, 43 ± 1,3 pmol/μg tương ứng với khuyến cáo khi sản lượng đánh dấu từ 3-6 μg thì hoạt tính đặc hiệu từ 15-50 pmol/μg, từ đó chúng tôi lựa chọn mẫu bệnh và mẫu chứng phù hợp để tiến hành lai. Hình 3.2. Hình ảnh quét slide bằng phần mềm Agilent SureScan Microarray Scanner Hình 3.3. Hình ảnh tín hiệu lai của 1 array được phóng đại lên 20x Nhận xét: Hình ảnh thu được sau khi quét slide bằng phần mềm Agilent SureScan Microarray Scanner, 1 slide gồm 8 array có tín hiệu rõ nét, viền gọn gàng, phổ màu tín hiệu đồng đều, các tín hiệu huỳnh quang nền yếu hoặc không xuất hiện, đảm bảo việc lai đã không bị tạp nhiễm và các chất huỳnh quang dư thừa đã được rửa sạch. 131
CHUYÊN ĐỀ SÀNG LỌC VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN 3.3. Phân tích kết quả bất thường nhiễm sắc thể Bảng 3.4. Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể được phát hiện bằng kỹ thuật aCGH Kết quả aCGH Kết quả nhiễm sắc thể n % n % Bất thường 14 29,2 6 12,5 Bình thường 34 70,8 42 87,5 Tổng 48 100 48 100 Nhận xét: Trong 48 mẫu nghiên cứu, kỹ thuật aCGH phát hiện 14 mẫu bất thường (29,2%), NST đồ phát hiện 6 mẫu bất thường (12,5%). IV. BÀN LUẬN màu huỳnh quang được lựa chọn giữa mẫu Kỹ thuật lai so sánh hệ gen thực hiện với bệnh và mẫu chứng phù hợp để tiến hành lai quy trình phức tạp, nghiêm ngặt; giá thành chúng với nhau, sao cho mẫu bệnh và mẫu cao; đòi hỏi nhân lực được đào tạo chuyên chứng có giá trị sản lượng đánh dấu và hoạt môn sâu trong phân tích, giải thích và tư vấn tính đặc hiệu càng tương thích thì khả năng kết quả, vì vậy để hạn chế sai sót tối đa trong lai thành công càng cao. Bên cạnh đó, các quá trình thực hiện thì sau mỗi bước đều cần thông số độ áp lưới, độ nhiễu và cường độ có tiêu chuẩn để kiểm chứng chất lượng tín hiệu lai của từng kênh màu đều nằm trong trước khi chuyển sang bước tiếp theo. giới hạn yêu cầu. Với bộ kiểm soát chất Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả 24 lượng của kỹ thuật aCGH gồm nhiều thông mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi bằng số như phân tích ở trên đã đảm bảo cho sự bộ kít Qiagen cho nồng độ DNA tối thiểu là thành công và tin cậy của kết quả xét 27,5 ng/ul với độ tinh sạch từ 1,8 - 2,0. Đây nghiệm. Ở mỗi giai đoạn kỹ thuật đều có là nồng độ đạt tiêu chuẩn > 20 ng/ul, đảm thông số kiểm soát chất lượng tương ứng bảo lượng DNA tổng số trong khoảng 200 - giúp cho việc phát hiện lỗi kỹ thuật kịp thời, 500ng để thực hiện phản ứng cắt đoạn DNA. tránh lãng phí hóa chất và nguyên liệu xét Tuy nhiên, với 24 mẫu tách chiết từ dịch ối, nghiệm ở các giai đoạn tiếp theo [8]. chỉ có 22 mẫu đạt nồng độ chuẩn trên 20 Trong nghiên cứu của chúng tôi, nhiễm ng/ul, còn 2 mẫu thấp hơn 20 ng/ul, chúng sắc thể đồ phát hiện 12,5% bất thường, trong tôi đã tiến hành cô DNA bằng phương pháp khi đó aCGH phát hiện được 29,2%. Như cồn thông thường, và thu được nồng độ cao vậy, kỹ thuật aCGH giúp tăng khả năng phát hơn, đảm bảo đủ lượng DNA tổng số cho hiện bất thường di truyền thêm 16,7% so với phản ứng tiếp theo. Vì vậy ở các bước đánh kỹ thuật nhiễm sắc thể đồ truyền thống, tỉ lệ dấu huỳnh quang và lai với mẫu chứng, hai này cao hơn hẳn các nghiên cứu đã có như mẫu này vẫn đảm bảo đạt chuẩn kỹ thuật. nghiên cứu của Ronald J Wapner và cộng sự Sản phẩm phân đoạn DNA trong nghiên cứu năm 2012 [5], nghiên cứu của Anita SY Kan đều nằm trong dải ngưỡng tiêu chuẩn từ 200 và cộng sự năm 2014 cùng là 6% [7]. - 500 bp để có thể thực hiện phản ứng gắn Nguyên nhân gây ra sự khác biệt này giữa huỳnh quang và lai tiếp theo. các nghiên cứu là do trong tiêu chuẩn chọn Sản lượng đánh dấu (Yield) và hoạt tính mẫu nghiên cứu và cỡ mẫu. Nghiên cứu của đặc hiệu (Specific Activity) của từng loại chúng tôi có cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ và tập 132
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 497 - THÁNG 12 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2020 trung vào đối tượng có bất thường bẩm sinh, after array-CGH analysis-a cohort of 1000 chậm PTTT, chậm PTVĐ, là các đối tượng patients. Mol Cytogenet. có nguyên nhân bất thường di truyền cao, 3. Callaway J.L., Shaffer L.G., Chitty L.S. et hay các thai phụ có kết quả siêu âm thai bất al (2013). The clinical utility of microarray thường về hình thái... technologies applied to prenatal cytogenetics in the presence of a normal conventional V. KẾT LUẬN karyotype: a review of the literature. Prenat Trong 48 mẫu thu được kết quả aCGH, Diagn. nồng độ DNA tối thiểu là 20 ng/μl đảm bảo 4. Sagoo G.S., Butterworth A.S., Sanderson S., lượng DNA tổng số từ 200 - 500ng. Điện di Shaw-Smith C., Higgins J.P., Burton H. sản phẩm phân đoạn DNA có kích thước từ (2009). Array CGH in patients with learning 200-500 bp thì khả năng đánh dấu huỳnh disability (mental retardation) and congenital quang đạt yêu cầu. Sản lượng sau gắn huỳnh anomalies: updated systematic review and quang của 48 mẫu nghiên cứu từ 3-6 μg meta-analysis of 19 studies and 13,926 tương ứng với hoạt tính đặc hiệu từ 15-50 subjects. Genet Med. 11(3):139-46. pmol/μg. Như vậy quy trình kỹ thuật của 5. Wapner R.J., Martin C.L., Levy B. et al aCGH có nhiều giai đoạn khác nhau. Mỗi (2012). Chromosomal microarray versus giai đoạn đều có các tiêu chuẩn để đối karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J chứng, đảm bảo cho quy trình được thành Med. công và kết quả phân tích được rõ ràng. 6. Marketa Wayhelova et al (2019). The Kỹ thuật aCGH cho phép phát hiện bất clinical benefit of array-based comparative thường nhiễm sắc thể với tỷ lệ cao hơn so genomic hybridization for detection of copy với phương pháp karyotyping truyền thống. number variants in Czech children with Điều này khẳng định thêm ưu điểm vượt trội intellectual disability and developmental của kỹ thuật aCGH trong việc phát hiện bất delay, BMC Medical Genomics. 12:111 thường di truyền ở mức độ nhiễm sắc thể. 7. Kan Anita S. Y., Lau Elizabeth T., Tang W. F. et al (2014). Whole-genome array CGH TÀI LIỆU THAM KHẢO evaluation for replacing prenatal karyotyping 1. Redon R., Ishikawa S., Fitch K. R. et al in Hong Kong. PloS one. 9(2):e87988- (2006). Global variation in copy number in e87988. the human genome. Nature. 444(7118):444- 8. Bryan Ronald, J. deLeeuw Coe et al (2004). 54 SeeGH–a software tool for visualization of 2. Carreira I.M., Ferreira S.I., Matoso E. et al whole genome array comparative genomic (2015). Copy number variants prioritization hybridization data. BMC bioinformatics. 5(1):13 133