KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

221
lượt xem 46
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học, trong đó có ngành chăn nuôi. Việc áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng hiệu quả của việc cải thiện giống vật nuôi. Một vấn đề đặt ra cho những kỹ thuật gen này là khả năng tách chiết DNA từ nhiều nguồn mẫu khác nhau để đảm bảo độ tinh sạch và giữ nguyên cấu trúc DNA. Tách chiết DNA từ máu, thịt, cơ… rõ ràng không phức tạp và dễ thành công....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP: XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN THỊ NHA TRANG KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
LỜI CẢM ƠN Kính dâng Bố và Mẹ, ngƣời đã sinh thành, dạy dỗ và luôn động viên con để có đƣợc kết quả hôm nay. Cảm ơn Anh hai đã hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn gia đình thân yêu của tôi! iii
LỜI CẢM ƠN Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Xin cảm ơn KS. Lê Thị Thu Hà cùng các anh chị trong phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ trong thời gian làm quen với thao tác phòng thí nghiệm và trong quá trình làm đề tài. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ NHA TRANG iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” đƣợc tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Hƣớng dẫn đề tài: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong các thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có đƣợc mẫu lông hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất cần thiết trong những trƣờng hợp này. Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (nhƣ máu, da, cơ…) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tƣơng tự lông nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, từ nhiều vị trí trên sợi lông và xác định sự xuất hiện của gen halothane, đề tài đƣợc tiến hành trên lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84. 2. DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR. v
3. Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ CTAB 0,2%. 4. Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75) và vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông. vi
MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ..................................................................................................................... iii Tóm tắt khóa luận ............................................................................................................v Mục lục ......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ...............................................................................................x Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi Danh sách các hình và biểu đồ ..................................................................................... xii PHẦN I. MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................................2 1.2.1. Mục tiêu .............................................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu ..............................................................................................................2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3 2.1. Cấu trúc của lông ......................................................................................................3 2.1.1. Cấu trúc tổng quan .............................................................................................3 2.1.2. Cấu trúc của melanin .........................................................................................4 2.1.3. Cấu trúc của keratin ...........................................................................................4 2.1.4. Các liên kết trong lông ......................................................................................5 2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A ...............................................................................5 2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin ...................................................................6 2.1.4.3. Liên kết hydrogen .....................................................................................6 2.1.4.4. Liên kết muối ............................................................................................6 2.1.4.5. Liên kết cystine .........................................................................................6 2.1.4.6. Liên kết đƣờng ..........................................................................................6 2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo ..........................................................................6 2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ...............................................................7 2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài .................................7 vii
2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc ..................................9 2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ...........................................................10 2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR ............................................................................10 2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR .............................................10 2.4. Gen halothane .........................................................................................................11 2.4.1. Khái quát về gen halothane .............................................................................11 2.4.2. Ảnh hƣởng của gen halothane .........................................................................12 2.4.2.1. Ảnh hƣởng của gen halothane đến năng suất sinh sản ...........................12 2.4.2.2. Ảnh hƣởng của gen halothane đến sinh trƣởng và phẩm chất thịt .........13 2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane............................................................13 2.5.1. Nguyên tắc xác định gen halothane .................................................................13 2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở nƣớc ngoài ...................................14 2.5.3. Những công trình nghiên cứu halothane trong nƣớc .......................................14 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................16 3.1. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................16 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành..............................................................................16 3.3. Vật liệu ...................................................................................................................16 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA ............................................................................16 3.3.2. Đoạn mồi ......................................................................................................... 16 3.3.3. Hóa chất ...........................................................................................................16 3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài .............................................................. 17 3.3.4.1. Dụng cụ...................................................................................................17 3.3.4.2. Thiết bị .................................................................................................... 17 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ...........................................................................................18 3.4.1. Lấy và trữ mẫu .................................................................................................18 3.4.2. Tách chiết DNA ...............................................................................................19 3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo ........................................19 3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo 20 3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế .............................................................. 21 viii
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................21 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả.............................................................................. 22 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose .............................................................................22 3.4.5.2. Đọc kết quả ............................................................................................22 3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 22 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................23 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K .......................................................23 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT....................................................................26 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB .................................................................27 4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo .................29 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................30 5.1. Kết luận...................................................................................................................30 5.2. Đề nghị ...................................................................................................................30 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................31 ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cs cộng sự DNA deoxyribonucleic acid OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide PCR polymerase chain reaction PSE Pale, soft, exudative Taq Thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit international UV ultra violet W wave KAP keratin associated proteins HP halothane positive HN halothane negative x
DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông .............................................................................3 Bảng 3.4. Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane ......................................21 Bảng 3.5. Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane .........................................22 Bảng 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K ...............23 Bảng 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT............................24 Bảng 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB .........................25 Bảng 4.4a. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông heo ..................26 Bảng 4.4b. Kết quả PCR ứng với các vị trí lông heo ....................................................27 xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 3.4. Phân chia các vị trí lấy mẫu trên sợi lông heo ...............................................18 Hình 4.1. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ proteinase K ..................................24 Hình 4.2. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ DTT ..............................................25 Hình 4.3. Kết quả PCR mẫu gốc lông ở 3 nồng độ CTAB ..........................................26 Hình 4.4a. Kết quả PCR vị trí gốc lông ........................................................................28 Hình 4.4b. Kết quả PCR vị trí thân lông .......................................................................28 Hình 4.4c. Kết quả PCR vị trí cả sợi lông .....................................................................29 Biểu đồ 4.1. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ proteinase K ...........23 Biểu đồ 4.2. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ DTT .......................24 Biểu đồ 4.3. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các nồng độ CTAB.....................25 Biểu đồ 4.4. Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ứng với các vị trí của lông .......................27 xii
1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học, trong đó có ngành chăn nuôi. Việc áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng hiệu quả của việc cải thiện giống vật nuôi. Một vấn đề đặt ra cho những kỹ thuật gen này là khả năng tách chiết DNA từ nhiều nguồn mẫu khác nhau để đảm bảo độ tinh sạch và giữ nguyên cấu trúc DNA. Tách chiết DNA từ máu, thịt, cơ… rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các loại mẫu này thƣờng đƣợc dùng trong hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nguồn mẫu khác nhƣ lông, da, xƣơng, móng… cũng cần đƣợc quan tâm. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là nó có lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó, hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo ra sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh và có thể đƣợc thƣơng mại hóa. Sự phát triển của ngành chăn nuôi hiện nay đặt ra những vấn đề nóng bỏng và cấp bách. Đó là ảnh hƣởng của điều kiện nuôi lên năng suất vật nuôi, chất lƣợng sản phẩm chăn nuôi, nhu cầu ngày càng tăng của con ngƣời, vấn đề lợi nhuận… Để đáp ứng yêu cầu trên, các biện pháp chọn lọc và phối giống đã không ngừng đƣợc áp dụng. Tuy nhiên, trong quá trình chọn lọc, một tình trạng cần quan tâm đó là hội chứng nhạy cảm với stress. Hội chứng này đƣợc điều khiển bởi gen halothane, chi phối nhiều tính trạng về tăng trƣởng, phẩm chất quầy thịt, năng suất sinh sản… đã gây nhiều thiệt hại cho nhà chăn nuôi. Heo nhạy cảm stress có ƣu điểm là tỷ lệ nạc cao, mỡ lƣng thấp, hệ số chuyển biến thức ăn tốt nhƣng có nhƣợc điểm là khả năng sinh sản kém, tỷ lệ thịt PSE cao và tỷ lệ chết sau vận chuyển cao. Nhƣ vậy, một gen chi phối nhiều tính trạng, vừa có lợi vừa không có lợi. Tùy mục đích sử dụng mà ngƣời ta sẽ loại bỏ hay giữ lại
2 gen này. Cho nên, việc phát hiện sớm, nhanh chóng, chính xác gen halothane ở thú trƣớc khi đƣa vào sử dụng là rất cần thiết. Đƣợc sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM và sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Trần Thị Dân và KS. Nguyễn Văn Út, tôi đã tiến hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo”. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông heo. - Tìm ra vị trí tốt nhất trên sợi lông heo để ly trích DNA. 1.2.2. Yêu cầu - Khảo sát nồng độ các hoá chất để cải tiến quy trình ly trích DNA từ lông heo. - Kiểm tra hiệu quả quy trình ly trích thông qua đo OD và phản ứng PCR. - Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của sợi lông heo.
3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu trúc của lông 2.1.1. Cấu trúc tổng quan Lông gồm 3 lớp chính: lớp tủy ở trung tâm, lớp vỏ ở giữa và lớp sừng bao bên ngoài. Mỗi lớp gồm những tế bào đƣợc phân hóa từ tế bào mầm trong nang lông. Mỗi lớp của lông đƣợc mô tả theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Đặc điểm các lớp của lông Đặc điểm Lớp tuỷ Lớp vỏ Lớp sừng Trọng lƣợng (so với
4 sulfur (KAP). Có 2 loại protein keratin biểu hiện ở thú: loại 1 chứa chuỗi polypeptide axit và loại 2 chứa chuỗi polypeptide bazơ. 2.1.2. Cấu trúc của melanin Có 2 loại melanin: melanin nâu đen gọi là eumelanin; melanin đỏ vàng gọi là pheomelanin. Melanin đƣợc tổng hợp từ tyrosine. Eumelanin từ lâu đƣợc nghĩ gồm các polymer nhƣ 5,6–dihydroxyindol acid (DHI) và 5,6–dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) liên kết chéo với nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây về đặc tính dẫn điện của melanin chỉ ra rằng melanin có thể gồm nhiều oligomer cơ bản bám dính theo một vài cơ chế nào đó. Vì vậy, cấu trúc phân tử tự nhiên chính xác của melanin vẫn còn là chủ đề đang đƣợc nghiên cứu. Eumelanin đƣợc tìm thấy ở da, tóc. Đối với ngƣời, eumelanin nhiều ở ngƣời có màu da tối, màu tóc vàng, xám, đen và nâu. Có 2 loại eumelanin, đƣợc phân biệt bởi một đoạn trên mạch polymer của chúng. Đó là eumelanin đen và eumelanin nâu. Một lƣợng nhỏ eumelanin đen cùng với sự vắng mặt của những hạt sắc tố khác sẽ tạo thành màu tóc xám. Một lƣợng nhỏ eumelanin nâu cùng với sự vắng mặt của những hạt sắc tố khác sẽ tạo thành màu tóc vàng. Pheomelanin cũng đƣợc tìm thấy ở da và tóc. Pheomelanin có nhiều ở ngƣời có màu da sáng và màu tóc đỏ. Pheomelanin cũng có thể trở thành tác nhân gây ung thƣ khi chịu tác động của tia UV. Về mặt hoá học, pheomelanin khác eumelanin ở cấu trúc oligomer kết hợp với L-cysteine. Dƣới kính hiển vi, melanin có màu nâu, không khúc xạ và có lớp hạt với rất nhiều hạt nhỏ đƣờng kính < 800 nm. Hỗn hợp loãng kali permanganate (KMnO4) là một phƣơng pháp tẩy trắng melanin có hiệu quả. 2.1.3. Cấu trúc của keratin Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xƣơng sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi protein dài hình thành theo cấu trúc xoắn alpha bậc hai. Ba trong số những protein xoắn alpha xoắn quanh một sợi khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Một sợi
5 fibrin đƣợc tạo từ bảy tiền fibrin. Sau đó, hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein dạng keo để hình thành nên sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này đƣợc gắn vào tế bào lông chết. Keratin là một họ protein cấu trúc sợi, dai và không hoà tan. Keratin ở dạng cấu trúc cứng nhƣng không bị khoáng hoá, đƣợc tìm thấy ở bò sát, chim, lƣỡng cƣ và động vật có vú. Keratin cạnh tranh tính bền sinh học với chitin. Có nhiều loại keratin, đôi khi chỉ trong một động vật nhƣ α-keratin, ß-keratin. Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratin trở nên rắn chắc phụ thuộc vào sự tập hợp cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của những mạch polypeptide thành phần). Sự phối hợp của các cấu trúc α–helix, ß-sheet và cầu nối disulfide sẽ quyết định cấu tạo của những protein chức năng, một vài trong số đó điều khiển tính không hoà tan. Xét về thành phần hóa học, keratin chứa một tỷ lệ cao glycine và một tỷ lệ tƣơng đối cao alanine. Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các phân tử, keratin còn có một lƣợng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, đƣợc liên kết với nhau bởi những cầu nối disulfide. Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử nhƣ urea có thể hòa tan keratin. Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của động vật có vú. Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông. Trong trƣờng hợp cấu hình ß-sheet, keratin đƣợc liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc và chắc chắn. Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi trung gian xoắn. 2.1.4. Các liên kết trong lông 2.1.4.1. Cấu trúc cuộn xoắn A Trong cấu tạo của lông có 3 chuỗi xoắn α bện với nhau tạo thành dạng protofibril. Đây là cấu trúc sợi đầu tiên của lông. Chín protofibril đƣợc bó trong một vòng tạo thành microfibril. Những microfibril này đƣợc gắn vào một chất nền protein
6 vô tổ chức amphorous chứa nhiều lƣu huỳnh. Hàng trăm microfibril đƣợc gắn vào nhau tạo thành một bó sợi không đều nhau gọi là macrofibril. Những macrofibril này tập trung thành từng nhóm tạo nên lớp vỏ của lông. Những tế bào chết xung quanh cấu trúc này tạo nên lớp sừng của lông. Ở phần trung tâm của lông có ống tủy là hệ thống lƣu trữ và bài tiết các chất cặn bã, những kim loại nặng do cơ thể loại thải ra và chúng đƣợc bài tiết qua các ống. 2.1.4.2 Liên kết trong protein keratin Cấu hình đầu tiên của lông đƣợc thiết lập trong không gian là bởi những liên kết đƣợc tìm thấy trong lớp vỏ của lông. Nhƣ chúng ta đã thấy ở phần trƣớc, keratin bắt đầu với xoắn alpha tạo nên protofibril, microfibril, macrofibril và sau đó tạo nên lớp vỏ. Những liên kết trong lông đƣợc nằm trong phạm vi một hay nhiều xoắn alpha. 2.1.4.3. Liên kết hydrogen Liên kết này nằm giữa những cuộn tròn của xoắn alpha và có vai trò làm cho lông có khả năng duỗi ra rồi trở lại trạng thái cũ (tính đàn hồi). Liên kết hydrogen cho phép chúng ta tạm thời thay đổi hình dạng của lông với sự trợ giúp của nƣớc. Những liên kết này khi bị điện phân sẽ dễ dàng bị bẻ gãy và sữa đổi. Liên kết hydrogen đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông (có một vài tranh luận cho rằng nó đóng vai trò trong 99,9% tính đàn hồi của lông). 2.1.4.4. Liên kết muối Liên kết muối là một dạng liên kết ion (điều khiển sự điện phân) bởi electron chuyển từ nhóm amino bazơ (amino acid với nhóm –COO) sang nhóm amino axit (amino acid với nhóm –NH3+). Điều này xảy ra ở vị trí song song với đƣờng trục của đƣờng xoắn luân phiên. Liên kết muối đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông. 2.1.4.5. Liên kết cystine Liên kết cystine đƣợc biết là liên kết disulfide, liên kết sulfur, liên kết -S đƣợc tạo ra bởi những liên kết chéo giữa các cystine của chuỗi polypeptide. Liên kết này thẳng góc với trục lông và nằm giữa những mạch polypeptide. Do vị trí của nó trong
7 lông, liên kết cystine giữ vai trò trong tính dai của lông và chống lại sự mài mòn lông. Liên kết này cho phép nếp tóc uốn giữ đƣợc lâu. 2.1.4.6. Liên kết đƣờng Liên kết đƣờng nằm giữa amino acid có nhóm –OH và nhóm amino axit. Liên kết này thẳng góc với trục lông. Do vị trí của nó, liên kết đƣờng đóng vai trò trong tính dai nhƣng không giữ vai trò trong tính bền (5%). Sự ẩm ƣớt ở lông là do một loại sản phẩm phụ của loại liên kết này. 2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông Chu kỳ phát triển của lông chia làm 3 pha: pha anagen (pha phát triển), pha catagen (pha chuyển tiếp) và pha telogen (pha nghỉ). Stenn và Paus (2001; dẫn liệu từ McNevin và cs, 2005) thêm vào pha thứ tƣ là exogen (pha rụng), cho phép nhìn thấy việc điều khiển di truyền bên trong nang lông. Pha anagen là pha dài nhất trong chu kỳ phát triển lông ở ngƣời, từ 2-4 năm. Xấp xỉ 75-95% tất cả nang lông trên bề mặt da ngƣời là ở pha anagen. Pha catagen (2-3 tuần) đƣợc đánh dấu bởi sự kết thúc của quá trình phân bào nguyên nhiễm ở tế bào mầm nang lông. Trong pha telogen (3 tháng) chƣơng trình chết của tế bào (apotosis) dẫn đến sự keratin hóa protein và sự hoại tử. Pha telogen có thể đƣợc kích động bởi tác động của các proteinase lên hành lông còn sống. Ngay khi lông thoát ra khỏi nang lông, những tế bào bị mất nƣớc, protein bị keratin hóa và liên kết chéo qua các cầu nối cystine disulfide. Lông bị keratin hóa chứa thấp hơn 10% nƣớc. Quá trình keratin hóa gây ra sự thoái hóa tế bào và tiếp theo đó là sự mất DNA nhân ở lớp vỏ. Sử dụng nucleotide đánh dấu phóng xạ, Downes và cs (1966) chỉ ra rằng sự phân rã DNA xảy ra trong suốt quá trình keratin hóa. Chƣơng trình chết của tế bào (apotosis) đƣợc mô tả bởi sự biến mất của những bào quan trong tế bào, và sự bẻ gãy những mạch đôi của DNA nhân bởi các deoxyribonuclease đặc biệt ở vùng liên kết giữa các nucleosome. Dạng tác động này của nuclease đƣa đến kết quả là tạo ra các đoạn DNA
8 cs (1992) nhận thấy rằng DNA ly trích từ móng tay - một loại mô bị keratin hóa tƣơng tự lông, gồm những đoạn nhỏ hơn DNA ly trích từ máu. Đáng chú ý hơn, họ thấy rằng lƣợng DNA từ móng để phản ứng PCR thành công thì thấp hơn lƣợng DNA từ máu, điều này đƣa ra giả thuyết rằng móng chứa ít yếu tố ức chế PCR (hemoglobin trong máu đƣợc biết là một yếu tố ức chế). 2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông 2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài Việc sử dụng DNA từ nguồn lông không còn là mới lạ đối với các nƣớc tiên tiến có ngành công nghệ sinh học phát triển. Có rất nhiều công trình nghiên cứu về khảo cổ, về khoa học hình sự, về y học,… sử dụng nguồn DNA tách chiết từ mẫu lông hay tóc. Có thể kể một số nghiên cứu tiêu biểu nhƣ dƣới đây. Baumgartner (1979) tiến hành thí nghiệm trên mẫu lông thú và xác định đƣợc khả năng lạm dụng thuốc của thú. Mặt khác, từ phân tích mẫu lông đã xác định đƣợc hàm lƣợng heroin trong cơ thể. Kalbe và cs (1988) đã phân lập DNA dài 20.000 bp từ thân tóc và chỉ ra rằng nó tập trung hầu hết ở các tế bào lớp sừng bên ngoài thân tóc. Ông đã báo cáo năng suất ly trích DNA của 1 g lông là từ 20 ng -> 2 µg (0,02 - 2 ng/mg). Schreiber và cs (1988) nhận ra rằng việc rửa SDS lặp lại nhiều lần làm giảm năng suất DNA thu hồi từ thân lông. Ông đã thu đƣợc 1µg DNA từ 200 mg lông (5 ng/mg). Nozawa và cs (1999) ly trích DNA từ thân tóc với phƣơng pháp kết tủa bằng CTAB. Sau đó, vùng đặc biệt của gen HLA-DQA1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp semi-nested PCR. Sản phẩm khuếch đại đƣợc tạo dòng và giải trình tự. Trình tự di truyền của HLA-DQA1 đƣợc xác định bằng cách so sánh trình tự với trình tự đã đƣợc biết trƣớc của mỗi allele. Tất cả kiểu gen của HLA-DQA1 đƣợc phân loại thành công với mẫu thân tóc lấy từ 6 ngƣời khác nhau. Heywood và cs (2003) đo đƣợc 1 ng DNA/ml thân tóc sau quá trình ly trích hữu cơ. DNA hiện diện ở cả phần gốc tóc (trung bình là 1,3 0,8 ng/ml) và phần ngọn tóc (trung bình là 0,3 0,6 ng/ml). Nhuộm huỳnh quang đã khám phá ra rằng DNA tóc