Kỹ thuật chuyển gen cho động vật

Chia sẻ: Tranhoai Nam | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:36

Thêm vào BST

Báo xấu

510
lượt xem 173
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật chuyển gen cho động vật

Kü thuËt chuyÓn gen cho ®éng vËt I. Kh¸I NIÖM VÒ chuyÓn gen Cho ®éng vËt 1.1. §Þnh nghÜa Kü thuËt chuyÓn gen l kü thuËt ®−a mét hay nhiÒu gen l¹ ® ®−îc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tæ hîp v o tÕ b o chñ cña ®éng vËt l m cho gen l¹ cã thÓ tån t¹i ë d¹ng plasmit t¸i tæ hîp hoÆc g¾n v o bé gen tÕ b o chñ. Trong tÕ b o chñ, c¸c gen n y ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein ®Æc tr−ng dÉn tíi viÖc xuÊt hiÖn c¸c ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ chuyÓn gen. ®èi víi c¸c thÓ nh©n chuÈn, viÖc chuyÓn gen ®−îc xem l th nh c«ng khi gen chuyÓn v o ®−îc tæ hîp v o genom cña tÕ b o chñ, ®Æc tÝnh cña gen chuyÓn n¹p ®−îc duy tr× æn ®inh qua c¸c thÕ hÖ con ch¸u 1
1.2.L−îc sö ph¸t triÓn 1977 Gurdon chuyÓn ARNm v ADN v o ph«i Xenopus (Õch) v quan s¸t thÊy sù biÓu hiÖn chøc n¨ng cña chóng 1980 Brinster v cs nhËn ®−îc kÕt qu¶ t−¬ng tù ë chuét 1981 Wagner v cs ®· cÊy chuyÓn th nh c«ng gen β-globulin cña thá v o ph«i chuét Tõ 1985 nhiÒu t¸c gi¶ th nh c«ng trong t¹o thá, cõu, lîn, bß… chuyÓn gen v c¸c vËt nu«i chuyÓn gen t¨ng tr−ëng nhanh ®−îc øng dông m¹nh mÏ trong n«ng nghiÖp 1.3. môc ®Ých chuyÓn gen • ChuyÓn gen v o c¸c dßng tÕ b o ®éng vËt nu«i cÊy ®Ó s¶n xuÊt protein in t¸i tæ hîp • T¹o vËt nu«i chuyÓn gen víi ®Æc tÝnh c¶i tiÕn míi vÒ c¸c s¶n phÈm s÷a, thÞt, l«ng… • BiÕn vËt nu«i th nh bioreacter s¶n xuÊt protein t¸i tæ hîp • T¹o vËt nu«i chuyÓn gen “knock out” l m m« h×nh nghiªn cøu vÒ y sinh häc c¸c bÖnh di truyÒn • ChuyÓn gen liÖu ph¸p nh»m ch÷a trÞ c¸c bÖnh di truyÒn (cña ng−êi) 2
1.4. §èi t−îng chuyÓn gen HÇu hÕt c¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen ®−îc ph¸t triÓn trªn m« h×nh chuét v sau ®ã chóng ®−îc øng dông trªn gia sóc, gia cÇm ViÖc chuyÓn gen th−êng ®−îc thao t¸c trªn: - TÕ b o trøng ® thô tinh - TÕ b o tinh trïng - M« ph«i ë giai ®o¹n sím - TÕ b o gèc ph«i II.C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo tÕ bµo ®éng vËt Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp : -ChuyÓn gen nhê phèt ph¸t canxi -ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn -ChuyÓn gen nhê vi tiªm -ChuyÓn gen nhê liposom Ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen gi¸n tiÕp : ChuyÓn gen nhê virus 3
II.1.C¸c ph−¬ng ph¸p ChuyÓn gen trùc tiÕp 1.ChuyÓn gen nhê phosphat canxi Kü thuËt phosphat canxi ®Ó ®−a gen v o tÕ b o ®éng vËt cã vó lÇn ®Çu ®−îc Graham v Vander Eb ®Ò xuÊt n¨m 1973 v cho ®Õn nay vÉn ®−îc ¸p dông réng r·i. Kü thuËt n y cã thÓ sö dông ®Ó ®−a DNA v o tÕ b o ®éng vËt cã vó víi môc ®Ých c¸c test thÓ hiÖn chuyÓn n¹p hay biÕn n¹p l©u d i. 1.ChuyÓn gen nhê phosphat canxi Nguyªn t¾c: • C¸c DNA ngo¹i lai ®−îc trén víi CaCl2 sau ®ã ®−îc chuyÓn v o mét dung dÞch chøa ion phosphat. Mét phøc hîp ®ång ng−ng kÕt (coprecipitate) gi÷a canxi phosphat v DNA sÏ ®−îc h×nh th nh. • Phøc hîp n y sÏ ®−îc c¸c tÕ b o ®éng vËt cã vó tiÕp nhËn khi nu«i cÊy th«ng qua thùc b o , kÕt qu¶ l cã thÓ t¹o tÕ b o chuyÓn gen víi sù thÓ hiÖn gen ngo¹i lai trong tÕ b o. • C¸c DNA chuyÓn n¹p mang mét gen chØ thÞ chän läc (nh− gen aminoglycoside phosphotransferase) ®Ó gióp cho viÖc thanh läc c¸c tÕ b o kh«ng tiÕp nhËn DNA. 4
5
2.ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn Nguyªn t¾c: • Khi trong ®iÖn tr−êng cã mét mËt ®é tÕ b o cao v t¹o ra mét xung ®iÖn (®iÖn thÕ cao trong mét thêi gian rÊt ng¾n), lóc ®ã trªn m ng tÕ b o xuÊt hiÖn c¸c lç nhá. • Qua c¸c lç n y, DNA cã thÓ ®i s©u v o trong tÕ b o v ë mét sè tÕ b o chóng cã thÓ t−¬ng t¸c víi genome cña tÕ b o t¹o tÕ b o chuyÓn gen. 2.ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn (tiÕp) • M¸y t¹o xung ®iÖn th−êng ®−îc thiÕt lËp mét c«ng suÊt æn ®Þnh v c¶ thêi gian g©y xung æn ®Þnh víi c¸c ®iÖn thÕ biÕn ®æi tõ 500-1500 v/cm. • §èi víi hÇu hÕt tÕ b o, sù thiÕt lËp nh− vËy ®¶m b¶o 20-50% sè tÕ b o cßn sèng sau khi thùc nghiÖm chuyÓn DNA. • Qu¸ tr×nh chuyÓn gen nhê xung ®iÖn ®−îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é phßng cßn c¸c tÕ b o ®−îc gi÷ liªn tôc trong ®¸ ®Ó kÐo d i thêi gian më lç c¸c tÕ b o. 6
7
M¸y t¹o xung ®iÖn 8
2.ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn (tiÕp) Chó ý • C¸c DNA ®· ®−îc duçi th¼ng cho hiÖu qu¶ chuyÓn gen cao h¬n c¸c DNA ë d¹ng siªu xo¾n, do ë d¹ng th¼ng chóng dÔ t−¬ng t¸c h¬n v o bé genome cña tÕ b o ®Ých. • §Ó chuyÓn gen b»ng kÜ thuËt n y cÇn sö dông huyÒn phï tÕ b o ®¬n, tr¸nh sö dông c¸c tÕ b o dÝnh l¹i víi nhau v× c¸c khèi tÕ b o n y hay dÝnh v o th nh b×nh l m gi¶m hiÖu qu¶ chuyÓn n¹p. • Nãi chung, ®Ó chuyÓn gen b»ng ph−¬ng ph¸p n y cÇn sö dông nhiÒu DNA còng nh− tÕ b o h¬n so víi ph−¬ng ph¸p ho¸ häc. • Mçi lo¹i tÕ b o cã c¸c th«ng sè kü thuËt tèi −u kh¸c nhau khi sö dông kÜ thuËt n y. 3.ChuyÓn gen nhê vi tiªm Nguyªn t¾c: • Tiªm trùc tiÕp ADN ngo¹i lai v o nh©n tÕ b o ®éng vËt nhê dông cô vi tiªm víi kim tiªm rÊt m¶nh. • Ph−¬ng ph¸p n y cho kÕt qu¶ rÊt cao nh−ng sè l−îng tÕ b o ®−îc xö lý nhá do ph¶i thao t¸c trªn tõng tÕ b o. • Ph−¬ng ph¸p n y th−êng dïng ®Ó ®−a ADN v o hîp tö hoÆc c¸c tÕ b o ph«i sím. • ViÖc chuyÓn gen v o tÕ b o ®éng vËt tèt nhÊt l chuyÓn v o mét trong nh÷ng nh©n con cña trøng ® thô tinh tr−íc khi c¸c nh©n con kÕt hîp víi nhau ®Ó t¹o ra hîp tö l−ìng béi. • B»ng c¸ch chuyÓn gen v o giai ®o¹n tiÒn nh©n, gen chuyÓn v o sÏ ®−îc truyÒn cho c¸c thÕ hÖ ph«i tiÕp theo v cã thÓ di truyÒn cho con ch¸u. 9
3.chuyÓn gen b»ng vi tiªm (tiÕp) C¸c b−íc tiÕn h nh: • ThiÕt kÕ cÊu tróc gen chuyÓn • G©y siªu b i no n ë con c¸i, thu nhËn hîp tö sau khi giao phèi • ChuÈn bÞ dung dÞch ADN cho vi tiªm • ChuÈn bÞ tÕ b o hîp tö • Vi tiªm ADN v o tiÒn nh©n • ChuyÓn ph«i vi tiªm v o c¬ thÓ nhËn • KiÓm tra gen chuyÓn ë con non. Lai t¹o ®Ó cñng cè di truyÒn 10
ThiÕt bÞ chuyÓn gen b»ng vi tiªm 11
4.ChuyÓn gen nhê Liposom 4.1.Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen liposom • Ph−¬ng ph¸p dùa trªn sù t−¬ng t¸c ion cña DNA v thÓ liposome t¹o ra mét thÓ phøc hîp, phøc hîp n y cã thÓ phãng thÝch c¸c DNA chøc n¨ng v o tÕ b o nu«i cÊy • Liposom cÊu t¹o tõ c¸c líp m ng lipid t¹o d¹ng tói, bªn trong chøa n−íc, kÝch th−íc kho¶ng 10 nm ®Õn 1000 nm. Liposom th−êng cã mét líp lipid mang ®iÖn tÝch d−¬ng (lipofecamin) v c¸c ph©n tö lipid trung tÝnh nªn liposom cã ®iÖn tÝch d−¬ng (+) v× vËy nã cã thÓ kÕt hîp víi c¸c ph©n tö, hoÆc c¸c chÊt mang ®iÖn tÝch ©m (-) t¹o th nh phøc hîp æn ®Þnh. • ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt l t¹o c¸c phøc hîp liposom - DNA. Ph©n tö DNA cã ®iÖn tÝch ©m (-) cã thÓ kÕt hîp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hîp æn ®Þnh, ®−îc sö dông l m vect¬ chuyÓn gen. 12
S¬ ®å cÊu tróc v ho¹t ®éng cña vec t¬ liposom 13
4.ChuyÓn gen nhê Liposom (tiÕp) 4.2.C¬ chÕ ho¹t ®éng cña vect¬ liposom • Vect¬ liposom cã kh¶ n¨ng tiÕp xóc víi m ng tÕ b o cña c¸c tÕ b o ®Ých v chui qua m ng tÕ b o, khi ®ã líp c¸c ph©n tö lipid bÞ ph©n huû l m cho c¸c gen môc tiªu ®−îc ®−a v o trong tÕ b o. • Gen môc tiªu cã thÓ ®−îc ®−a v o trong nh©n, tån t¹i trong nh©n nh− nh÷ng ®¬n vÞ gen ®éc lËp. Trong nh©n c¸c gen môc tiªu cã thÓ cã qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp l m cho gen n y ®−îc g¾n v o bé gen cña tÕ b o chñ t¹o tÕ b o ®−îc chuyÓn gen. ii.2. chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê virus Nguyªn lý chung Khi x©m nhiÔm v o tÕ b o, virus cã kh¶ n¨ng chuyÓn bé gen cña nã v o tÕ b o chñ. Mét sè nhãm virus cã thÓ g¾n bé gen hoÆc mét sè gen cña chóng v o bé gen tÕ b o chñ, t¹o th nh mét thÓ thèng nhÊt. C¸c gen virus g¾n víi bé gen cña tÕ b o chñ cã thÓ tån t¹i l©u d i cïng víi qu¸ tr×nh ph©n chia cña tÕ b o chñ, t¹o nªn c¸c provirus. 14
ii.2. chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê virus (tiÕp) Khi trong c¬ thÓ hay tõ ngo i m«i tr−êng cã mét t¸c nh©n n o ®ã kh«ng b×nh th−êng t¸c ®éng v o provirus, l m cho bé gen virus t¸ch khái bé gen tÕ b o chñ, thùc hiÖn qu¸ tr×nh t¸i b¶n gen virus v c¸c th nh phÇn cña virus trong tÕ b o chñ. Qu¸ tr×nh l¾p ghÐp c¸c th nh phÇn cña virus t¹o nªn c¸c virion, c¸c virion ho¹t ®éng t¹o nªn v« sè virus míi ph¸ vì tÕ b o chñ, tiÕp tôc x©m nhiÔm c¸c tÕ b o kh¸c • Chu tr×nh l©y nhiÔm cña virus 15
ii.2. chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê virus (tiÕp) Trªn c¬ së hiÓu biÕt ®Æc ®iÓm v c¬ chÕ x©m nhiÔm cña virus v o tÕ b o chñ, con ng−êi ® t×m ra c¸c biÖn ph¸p lo¹i bá hoÆc g©y bÊt ho¹t c¸c gen cã h¹i cña virus, nh−ng vÉn gi÷ l¹i c¸c gen virus gióp cho sù x©m nhiÔm v g¾n gen v o bé gen cña tÕ b o, t¹o nªn c¸c vect¬ chuyÓn gen. Vect¬ chuyÓn gen h×nh th nh tõ nh÷ng virus biÕn ®æi gen nh− trªn ®−îc gäi l vect¬ chuyÓn gen cã b¶n chÊt virus. Trong c¸c vect¬ n y, gen ngo¹i lai cÇn chuyÓn n¹p ®−îc thay thÕ v o vÞ trÝ mét sè gen cña virus, nh−ng vÉn ®¶m b¶o ®Ó virus cã kh¶ n¨ng x©m nhiÔm v chuyÓn gen v o tÕ b o, hoÆc g¾n gen ngo¹i lai víi bé gen cña tÕ b o ®Ých nh»m thùc hiÖn chøc n¨ng chuyÓn gen. ii.2. chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê virus (tiÕp) Vect¬ virus gåm mét sè lo¹i chñ yÕu: +Vect¬ retrovirus (ARN) +Vect¬ adenovirus (ADN sîi kÐp) +Vect¬ adeno-associated virus (ADN sîi ®¬n) + Vect¬ herpes simplex virus (ADN sîi kÐp) + Vect¬ baculovirus (ADN vßng kÐp) ... 16
1.chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus 1.1. §Æc ®iÓm cÊu t¹o v di truyÒn cña retrovirus • Retrovirus l lo¹i virus RNA cã kh¶ n¨ng x©m nhiÔm tÕ b o chñ cao v cã kh¶ n¨ng g¾n bé gen virus víi bé gen tÕ b o chñ. §ã l c¬ së thuËn lîi ®Ó thiÕt kÕ c¸c vect¬ chuyÓn gen hiÖu qu¶. • CÊu tróc retrovirus gåm: PhÇn vá cã 3 líp:líp vá ngo i cïng l glycoprotein, tiÕp ®Õn líp vá kÐp lipid, líp trong cïng l vá capsid. Bªn trong líp vá capsid l phÇn lâi RNA gåm 2 sîi ®ång d¹ng v c¸c lo¹i enzym cña virus: Enzym phiªn m· ng−îc (reverse transcriptase) gióp virus chuyÓn bé gen RNA sang d¹ng cDNA m¹ch kÐp. Enzym c i xen (integrase) gióp cho qu¸ tr×nh c i xen bé gen cña virus víi bé gen cña tÕ b o chñ ë nh÷ng ®iÓm t−¬ng ®ång. • Retrovirus life cycle 17
ψ S¬ ®å cÊu tróc cña Retrovirus • Bé gen retrovirus gåm hai sîi RNA cã cÊu tróc v kÝch tr−íc gièng nhau (7 kb - 11 kb). Mçi sîi RNA chøa 3 nhãm gen chñ yÕu: gag, pol, env. Cô thÓ: -Gen gag m ho¸ protein lâi trong th nh phÇn cÊu tróc h¹t virion -Gen pol m ho¸ enzyme phiªn m ng−îc v c¸c enzyme cÇn thiÕt cho ho¹t ®éng cña virus -Gen env m ho¸ protein trong cÊu tróc c¸c líp vá cña virus. • Hai ®Çu mçi sîi RNA cã mét tr×nh tù lÆp d i tËn cïng - LTR (long terminal repeats) mang mét sè tr×nh tù cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen cña virus v mét tr×nh tù ®Æc hiÖu gióp cho qu¸ tr×nh g¾n bé gen cña virus víi bé gen cña tÕ b o chñ. • T¹i ®Çu 5’-LTR cã mét tr×nh tù gióp qu¸ tr×nh ®ãng gãi bé gen cña virus gäi l tr×nh tù ψ (psi) 18
1.1.chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus (tiÕp) 1.2.Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ retrovirus ThiÕt kÕ vect¬ retrovirus l mét qu¸ tr×nh phøc t¹p, gåm nhiÒu giai ®o¹n kh¸c nhau: Lo¹i bá c¸c gen chñ yÕu cña virus gag, pol, env v thay thÕ b»ng gen cÇn chuyÓn n¹p (gen môc tiªu) t¹o th nh vect¬ bé gen (vector genome). Xö lý c¾t riªng c¸c gen gag, pol v env cña retrovirus nh−ng vÉn ®¶m b¶o chøc n¨ng c¸c gen. §−a vect¬ bé gen cïng víi c¸c gen gag, pol v env ® xö lý cña virus v o mét tÕ b o ®Æc hiÖu l tÕ b o ®ãng gãi. Trong tÕ b o ®ãng gãi, c¸c gen virus ho¹t ®éng tæng hîp c¸c th nh phÇn vá cña virus, c¸c th nh phÇn vá n y kÕt hîp víi vect¬ mang gen môc tiªu h×nh th nh nªn vect¬ retrovirus. Retrovirus vector Retrovirus Packing Kit Ampho ,Company :Takara Mirus Bio, Price$252.00 • This kit is designed to obtain transient high-titer recombinant retrovirus particles by co- • transfection of retrovirus vector plasmid with target gene and two unique vectors for packaging, using calcium phosphate method. This kit contains a gag-pol expression vector and an amphotropic env expression vector. The recombinant virus obtained using this kit are able to infect most mammalian cells. 19
1.chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus (tiÕp) 1.3.C¬ chÕ ho¹t ®éng cña vect¬ retrovirus • Vect¬ retrovirus ®−îc ®−a ®Õn c¸c tÕ b o ®Ých b»ng nhiÒu kü thuËt kh¸c nhau. Khi tiÕp cËn tÕ b o ®Ých ë nh÷ng thô thÓ (receiptor), vect¬ retrovirus ®−îc ®−a v o bªn trong tÕ b o. Trong tÕ b o chÊt cña tÕ b o ®Ých c¸c th nh phÇn vá cña vect¬ bÞ ph©n huû, phÇn lâi RNA ®−îc gi¶i phãng. • Enzym phiªn m· ng−îc cña virus xóc t¸c qu¸ tr×nh chuyÓn RNA sîi ®¬n th nh cDNA sîi kÐp. cDNA qua lç m ng nh©n v o trong nh©n tÕ b o ®Ých, nhê enzym c i xencña virus l m cho cDNA m¹ch kÐp ®−îc g¾n xen v o bé gen ë nh÷ng ®iÓm t−¬ng ®ång. Gen môc tiªu còng ®ång thêi ®−îc g¾n v o bé gen cña tÕ b o ®Ých, phiªn m· v dÞch m· t¹o nªn c¸c protein s¶n phÈm cña gen môc tiªu trong tÕ b o ®Ých. TÕ b o ®ãng gãi TÕ b o ®Ých S¬ ®å ho¹t ®éng cña vec t¬ retrovirus 20