Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:130

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án trình bày các nội dung chính sau: Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam; Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐÀO THỊ THANH XUÂN NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đào Thị Thanh Xuân NGHIÊN CỨU CELLULASE TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. LÊ THANH HÀ 2. PGS.TS. PHÍ QUYẾT TIẾN Hà Nội – 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Đào Thị Thanh Xuân Tập thể GVHD 1. PGS.TS Lê Thanh Hà 2. PGS.TS Phí Quyết Tiến
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học là PGS. TS Lê Thanh Hà và PGS.TS. Phí Quyết Tiến đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm -Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như bạn bè, đồng nghiệp tại bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Viện Công nghệ Hóa Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong các kết quả nghiên cứu về phân tích gen Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn các anh chị, em trong phòng Đào tạo Sau đại học của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và giúp đỡ trong công việc tại phòng để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thực hành thí nghiệm - Trường đại học Vinh, Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng các em sinh viên đã giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Đào Thị Thanh Xuân
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt tƣơng đƣơng BgIB Beta-glucosidase B Beta-glucosidase B BgIF Beta-glucosidase F Beta-glucosidase F BgIG Beta-glucosidase G Beta-glucosidase G Blast Basic Local Alignment Search Tool Công cụ so sánh mức tương đồng về trình tự nucleotide/axit amin Bp Base pair Cặp base BSA Bovine serum Albumin Albumin huyết thanh bò CBD Carbohydrate binding domain Vùng liên kết carbohydrate CD Catalytic domain Vùng xúc tác cDNA Complementary DNA DNA được tổng hợp từ khuôn mRNA nhờ enzym phiên mã ngược Cel12A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 12 family 12 Cel45A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 45 family 45 Cel48A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 48 family 48 Cel5A Endoglucanase glycoside hydrolase Endoglucanase thuộc họ 5A family 5 CBHI Cellobiohydrolase I Cellobiohydrolase thuộc họ I CBHII Cellobiohydrolase II Cellobiohydrolase thuộc họ II CMC Carboxymetyl cellulose Cơ chất Carboxymetyl cellulose COG/KOG Clusters/Eukaryotic of Orthologous Cơ sở dữ liệu protein của Group VSV nhân sơ/nhân chuẩn dCTP 2´-deoxycytidine 5´-triphosphate 2´-deoxycytidine 5´- triphosphate dATP 2´-deoxyadenosine 5´-triphosphate 2´-deoxyadenosine 5´-
triphosphate dGTP 2´-deoxyguanosine 5´-triphosphate 2´-deoxyguanosine 5´- triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamin tetra acetic acid Axit Ethylene diamin tetra acetic Tween 80 Polysorbate 80 CAZy Carbohydrate Active Enzyme BGs β- glucosidase EG Endoglucanase FPU Filter paper αA α- Amylase GHs Glycoside hydrolase PLs Polysaccharide lyase CEs Carbohydrate esterase AAs Enzym hoạt hóa bổ trợ GT Glycosyl transferase
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 4 1.1 Cellulase .............................................................................................................. 4 1.1.1.Phân loại cellulase ............................................................................................ 4 1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase ................................................................................ 6 1.1.3. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn ............................................................... 7 1.1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy ............................................................... 7 1.1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ................................................................ 9 1.1.4. Đặc tính của enzyme cellulase từ vi khuẩn .................................................... 10 1.1.4.1. pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của enzym ...................................................... 11 1.1.4.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất phụ gia đến hoạt độ enzym . .12 1.2. Tổng quan về mối ............................................................................................. 13 1.2.1. Phân loại Mối ................................................................................................. 13 1.2.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối .......................................................................... 14 1.2.3 Vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối ................................................................. 16 1.3. Ứng dụng của cellulase trong xử lý lignocellulose ........................................... 19 1.3.1. Thành phần của lignocelluloses...................................................................... 19 1.3.2. Hệ enzym phân giải Lignocellulose ............................................................... 21 1.3.3. Sự phối hợp tác động giữa các enzym ............................................................ 22 1.3.4. Ứng dụng cellulase trong quá trình thủy phân lignocellulose ........................ 24 1.4. Ứng dụng giải trình tự genome phát hiện tiềm năng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong phân giải lignocellulose ................................................................... 26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................. 28 2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 28 2.1.1. Mẫu mối .......................................................................................................... 28 2.1.2. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................ 28 2.2. Thiết bị và hóa chất ........................................................................................... 29 2.2.1 Thiết bị ............................................................................................................. 29 2.2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 29
2.3. Các môi trường nuôi cấy ................................................................................... 30 2.3.1. Môi trường làm giàu vi khuẩn sinh cellulase ................................................. 30 2.3.2. Môi trường giữ giống, nhân giống và phân lập .............................................. 30 2.3.3. Môi trường sinh tổng hợp enzym ................................................................... 30 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 30 2.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp cellulase ............ 31 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối ............................................... 31 2.4.1.2. Xác định định tính khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập .................................................................................................................................. 32 2.4.1.3. Xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh của vi khuẩn sinh cellulase ................. 33 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp cellulase .................................................................................................................... 33 2.4.2.1. Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng vi khuẩn tuyển chọn ....................................................................................... 33 2.4.2.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật đến sinh tổng hợp enzym ................ 33 2.4.2.2. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận .............................................................. 33 2.4.2.6. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy ........................ 33 2.4.2.7. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm tối ưu môi trường sinh tổng hợp CMCase cho Bacillus subtilis G4 sử dụng phần mềm Design Expert 7.1 ............... 34 2.4.3. Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Bacillus subtilis G4 ................................................................................................................. 35 2.4.3.1. Thu nhân chế phẩm cellulase từ vi khuẩn ................................................... 35 2.4.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase thu nhận. ................................................ 35 2.4.4. Khảo sát khả năng thủy phân rơm sử dụng cellulase thu nhận từ vi khuẩn ... 36 2.4.4.1. Phương pháp tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose..................................... 36 2.4.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất đường hóa lignocellulose của rơm sử dụng cellulase từ Cellulosimicrobium cellulans MP1 ... 36 2.4.5. Phương pháp định tên vi khuẩn thông qua giải trình tự 16S rDNA ............... 37 2.4.6. Phương pháp giải trình tự hệ genom của Cellulosimicrobium cellulans MP1 và dự đoán gen chức năng ........................................................................................ 38 2.4.6.1. Tách chiết DNA hệ gen của vi khuẩn .......................................................... 38 2.4.6.2 Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina .............................................................................................................. 38 2.4.6.3. Lắp ráp de novo hệ gen và đánh giá chất lượng lắp ráp .............................. 39 2.4.6.4. Dự đoán gen và chú giải hệ gen .................................................................. 39 2.5. Các phương pháp phân tich ............................................................................... 40
2.5.1. Xác định hoạt độ các enzym ........................................................................... 40 2.5.2. Xác định hàm lượng protein ........................................................................... 43 2.5.3. Xác định độ ẩm nguyên liệu ........................................................................... 43 2.5.4. Xác định hàm lượng cellulose ........................................................................ 44 2.5.5. Xác định hàm lượng lignin ............................................................................. 44 2.5.6. Phương pháp xác định lượng đường trong mẫu thủy phân bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) .................................. 46 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 47 3.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột mối và tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase cao 47 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng lựa chọn ........ 51 3.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh lý, sinh hóa ............................................ 51 3.2.2. Định tên các vi khuẩn ruột mối ...................................................................... 54 3.3. Nghiên cứu thu nhận cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis G4....................... 56 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase ..................................................................................................... 56 3.3.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase ............................................. 56 3.3.1.2 Ảnh hưởng của các thông số lên men đến hoạt độ CMCase ........................ 57 3.3.1.3. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp cellulase .. 59 3.3.3. Thu nhận cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 và xác định đặc tính của chế phẩm……. ................................................................................................................ 62 3.3.3.1. Thu nhận chế phẩm cellulase kỹ thuật từ B. subtilis G4 ............................. 62 3.3.3.2. Đặc tính của chế phẩm cellulase từ vi khuẩn B. subtilis G4 ....................... 63 3.3.4. Khảo sát khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn G4 đối với các vật liệu giàu cellulose. ........................................................................................................... 66 3.4. Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn Cellulosimicrobium MP1 ............................ 67 3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ MP1 .................................................................................................................................. 67 3.4.1.1. Lựa chọn môi trường sinh tổng hợp cellulase ............................................. 67 3.4.1.2. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật nuôi cấy tới sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn MP1............................................................................................................ 68 3.4.2. Ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp CMCase ...... 70 3.4.2.1. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ ............................................................. 70 3.4.2.2. Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon ........................................................ 71 3.4.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusae ........ 71 3.4.2. Xác đl "_Toc77151043" ợng bột đậu tương tới quá trình sinh cellusaeC...... 72 3.4.2.1. Thu nhận chế phẩm cellulase bằng kết tủa bởi ethanol ............................... 72
3.4.2.2. Xác định đặc tính chế phẩm cellulase thu từ Cellulosimicrobium sp. MP1 .......................................................................................................................... 73 3.5. So sánh giữa B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1 .......................... 75 3.5. Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của chủng C. cellulans MP1 ............................................................................................ 76 3.5.1. Trình tự gen và một số đặc điểm khái quát của chủng C. cellulans MP1 ...... 76 3.5.2. Các cụm gen và chức năng gen của chủng MP1 ............................................ 77 3.5.3. So sánh COG toàn bộ genome và các enzyme liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate ........................................................................................................... 78 3.5.4. Khai thác các enzyme thủy phân sinh khối thực vật từ nguồn gen của chủng C. cellulans MP1...................................................................................................... .80 3.6. Khảo sát khả năng thủy phân cellulose của rơm sử dụng cellulase thu nhận từ MP1….. .................................................................................................................... 83 3.6.1. Xác định thành phần nguyên liệu rơm ........................................................... 83 3.6.2. Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất quá trình thủy phân ............. 83 3.6.3. Ảnh hưởng các yếu tố tới hiệu suất thủy phân bởi enzym ............................. 84 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 90 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ...... 99 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 90100
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc tính enzym cellulase và Xylanase từ C.cellulans ........................... 11 Bảng 1.2 Tính bền nhiệt của cellulase và xylanase từ C.cellulans. ......................... 12 Bảng 1.3 Tính bền pH của cellulose và xylanase từ C.cellulans. ............................ 12 Bảng 1.4. Tổng kết một số loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase đã được phân lập từ ruột các loài mối . ..................................................................................................... 18 Bảng 2.1. Thông tin các mẫu mối............................................................................. 28 Bảng 2.2. Giá trị mã hóa và thực nghiệm Design-Expert 7.1 .................................. 34 Bảng 3.1. Thống kê kết quả phân lập vi khuẩn từ ruột mối ..................................... 47 Bảng 3.2 Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các môi trường làm giàu .................................................................................................................................. 48 Bảng 3.3 Các chủng có tỷ lệ (D/d) cao được chọn lựa ............................................. 49 Bảng 3.4 Hoạt độ cellulase và xylanase của các chủng vi khuẩn lựa chọn.............. 50 Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái, sinh lý của 11 chủng vi khuẩn tuyển chọn .............. 52 Bảng 3.6 Kết quả định tên các chủng vi khuẩn lựa chọn từ ruột mối ...................... 54 Bảng 3.7 Phân tích hồi quy (ANOVA) kết quả thí nghiệm ..................................... 60 Bảng 3.8 Kết tủa cellulase bằng ammonium sulfate bão hòa ................................... 62 Bảng 3.9 Kết tủa cellulase bằng acetone .................................................................. 63 Bảng 3.10 Kết quả thủy phân lignocelluloses sử dụng enzym từ vi khuẩn G4 ....... 66 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh enzym .............. 68 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng N tới khả năng sinh enzym của chủng MP1 .......................................................................................................................... 70 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon tới khả năng sinh enzym chủng MP1 ................................................................................................................ 71 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ bột đậu tương tới khả năng sinh enzym của chủng MP1 ................................................................................................................ 71 Bảng 3.15 Kết tủa enzym thô sử dụng cồn tuyệt đối với các nồng độ khác nhau .................................................................................. Error! Bookmark not defined. Bảng 3.16. So sánh giữa enzym từ B. subtilis G4 và Cellulosimicrobium sp. MP1…… .................................................................................................................. 75 Bảng 3.17 Danh mục các cellulase và hemicellulase dự đoán biểu hiện trên genome of C. cellulans MP1 .................................................................................................. 81 Bảng 3.18 Một số thành phần hóa học của rơm trước và sau tiền xử lý bằng kiềm(% chất khô nguyên liệu) ............................................................................................... 83 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của tiền xử lý cơ chất tới hiệu suất đường hóa .................... 84 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất đường hóa .................................. 84 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất đường hóa ................................... 85 Bảng 3.22 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/lỏng tới hiệu suất đường hóa ................... 85 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ enzym tới hiệu suất đường hóa ...................... 86
Bảng 3.24 Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất đường hóa ........................................... 86 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2] .......................................... 5 Hình 1.2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] ....................................... 6 Hình 1.3. Hệ vi sinh vật trong ruột mối [39] 16 Hình 1.4 Phân bố các họ vi khuẩn trong ruột mối và côn trùng [41]. ................... 18 Hình 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử cellulose [9] ......................................... 20 Hình 1.6.Cấu trúc hóa học phân tử cellulose [9] ...................................................... 20 Hình 1.7 Công thức hóa học của hemicellulose [29] .............................................. 21 Hình 1.8 Các đơn phân của lignin ........................................................................... 21 Hình 1.9 Hoạt động của các enzym hemicellulose [51] .......................................... 22 Hình 1.10 Hoạt động của các enzym cellulose [51]] .............................................. 23 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu trong luận án ................................................................ 30 Hình 2.2 Các bước phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối [25] .................... 32 Hình 3.1. Hình ảnh mẫu mối thu thập ..................................................................... 47 Hình 3.2 Hoạt độ enzym các chủng vi khuẩn từ ruột mối ....................................... 51 Hình 3.3 Hoạt độ CMCase của chủng B. subtlis G4 trên các môi trường nuôi cấy. 56 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các thông số nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của B. subtilis G4. Tỷ lệ giống (A), tốc độ lắc (B), Nhiệt độ (C) và pH môi trường (D). .............. 57 Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp CMCase từ vi khuẩn G4 .................................................................................................................. 58 Hình 3.6 . Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A), nito (B) và bột đậu tương lên hoạt độ CMCase của B. subtilis G4 ..................................................................................... 59 Hình 3.7 Bề mặt đáp ứng của quá trình sinh tổng hợp CMCase từ Bacillus G4 cho thấy sự tương tác giữa (a) Hàm lượng bột đậu tương và tinh bột . (b) Hàm lượng Casein và Tinh bột. (c) Hàm lượng bột đậu tương và casein. ................................. 61 Hình 3.8 Zymogram (A) và vòng thủy phân (B) trên môi trường cám (1) và môi trường tinh bột (3) ................................................................................................... 62 Hình 3.9. Kết quả xác định hoạt độ CMCase và mật độ tế bào trên môi trườngtrước và sau tối ưu ............................................................................................................. 62 Hình 3.10 Nhiệt độ tối ưu của CMCase thu nhận từ G4 ......................................... 64 Hình 3.11 Độ bền của enzym bởi nhiệt độ ............................................................. 64 Hình 3.12. pH tối ưu cho hoạt dộ CMCase của chế phẩm cellulase từ B. subtilis G4 ……. ......................................................................................................................... 65 Hình 3.13. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ Bacillus G4 .............................. 65 Hình 3.14: Kết quả phân tích sản phẩm thủy phân bằng HPLC ............................ 67 Hình 3.15 Ảnh hưởng các thông số kỹ thuật tới sinh tổng hợp enzym từ MP1 ...... 69
Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ CMCase của Cellulosimicrobium sp MP1 .................................................................................... 70 Hình 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme CMCase từ MP1 ............. 73 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính CMCase từ MP1 ...................... 74 Hình 3.19. Độ bền pH của chế phẩm cellulase từ MP1 .......................................... 74 Hình 3.20. Độ bền nhiệt chế phẩm cellulase từ MP1 .............................................. 75 Hình 3.21. Thử nghiệm phân giải giấy lọc của MP1 và G4 .................................. 76 Hình 3.22 Sơ đồ genom của C.cellulans MP1 ......................................................... 77 Hình 3.23 Phân loại chức năng gen ......................................................................... 78 Hình 3.25 So sánh genom của MP1 với các chủng C.cellulans .............................. 80 Hình 3.26. Sản phẩm thủy phân rơm sử dụng cellulase từ MP1 bằng HPLC ......... 87
MỞ ĐẦU Cellulose là thành phần chính của sinh khối thực vật, là nguyên liệu sinh học dồi dào nhất trên trái đất. Không những thế vật liệu cellulose và hemicellulose còn là phụ phấm, phế thải của ngành nông nghiệp và nhiều ngành nghề khác. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu cellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người. Việc xử lý nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm làm nguyên liệu sản xuất trong các lĩnh vực khác như công nghiệp giấy, sản xuất ethanol, sản xuất thức ăn gia súc và đặc biệt sản xuất nhiên liệu sinh học đã và đang là tiềm năng vô cùng to lớn. Ngày nay để thủy phân lignocellulose hiệu quả, thân thiện với môi trường, các nhà khoa học đang hướng đến đó là sử dụng hệ enzym thủy phân lignocellulose. Hệ enzym này có thể được thiết kế bằng cách tổ hợp các loại enzym trong hệ enzym thủy phân lignocellulose từ các nguồn vi sinh vật khác nhau hoặc khai thác từ một chủng vi sinh vật nhưng có hệ enzym phong phú có khả năng thủy phân hiệu quả lignocellulose. Mối đóng vai trò quan trọng trong việc sử dụng và khoáng hóa các polymer sinh học như gỗ, rơm rạ, bã mía, giấy và các vật liệu cellulose khác. Hệ vi sinh vật trong ruột mối có ý nghĩa quyết định trong quá trình phân giải cellulose. Có rất nhiều vi khuẩn phân giải cellulose đã được phân lập và đã được định tên từ nhiều loài mối khác nhau. Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả. Tuy nhiên, việc phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose với mục đích khai thác chủng vi sinh vật phân lập từ ruột mối trong phân giải lignocellulose cũng như khai thác hệ gen của chúng chưa được nghiên cứu. Chính vì lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu cellulase từ vi khuẩn ruột mối phân lập ở Việt Nam” Với mục đích phân lập, tuyển chọn và đánh giá được đa dạng vi khuẩn phân giải cellulase từ ruột mối. Đồng thời thông qua giải trình và phân tích hệ gen vi khuẩn để đánh giá tiềm năng phân giải các vật liệu cellulose của vi khuẩn ruột mối. 1
Mục tiêu của đề tài - Phân lập và đánh giá được sự đa dạng của vi khuẩn sinh cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam - Giải trình tự và phân tích hệ gen vi khuẩn làm cơ sở đánh giá tiềm năng phân giải cellulase của vi khuẩn ruột mối phân lập được 1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn phân lập từ ruột mối ở Việt Nam 2. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh cellulase từ ruột mối (2) Định tên một số vi khuẩn phân lập được từ ruột mối (3) Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase từ hai vi khuẩn lựa chọn (4) Thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn lựa chọn và xác định đặc tính CMCase của chế phẩm (5) Xác định đặc tính di truyền và các gen mã hóa enzym thủy phân cellulose của một chủng vi khuẩn (6) Sử dụng dịch enzym thô từ hai vi khuẩn lựa chọn để thủy phân vật liệu giàu cellulose 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Luận án đã cung cấp số liệu về việc phân lập một số chủng vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối Việt Nam. (2) Đã khảo sát được các điều kiện thu nhận cellulase từ 2 chủng vi khuẩn từ ruột mối (3) Lần đầu tiên giải trình tự toàn bộ hệ gen của chủng vi khuẩn từ ruột mối Cellulosimicrobium cellulans và phân tích chi tiết các gen liên quan đến phân giải lignocellulose từ đó đánh giá được tiềm năng của chủng. (4) Bước đầu khảo sát được khả năng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn ruột mối trên lignocellulose của rơm Ý nghĩa thực tiễn (1) Góp phần đánh giá sự đa dạng của hệ vi khuẩn sinh cellulase từ ruột mối cũng như áp dụng phân tích hệ gen trong khai thác tiềm năng phân giải lignocellulose của vi khuẩn ruột mối (2) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo khoa học đáng tin cậy và có giá trị, là tài liệu phục vụ cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học và cho cả sản xuất sau này. 2
Đóng góp mới của đề tài - Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phân lập và thu nhận cellulase từ vi khuẩn ruột mối. - Là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn Cellulosimicrobium cellulans MP1 phân lập từ ruột mối để phân tích tiềm năng sinh cellulase và hemicellulase của chủng, thông qua đó dự đoán tiềm năng ứng dụng của chủng trong phân hủy lignocellulose 3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1 Cellulase 1.1.1. Phân loại cellulase Cellulase là một phức hệ enzym thủy phân cellulose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4 glucoside hay phá vỡ liên kết hydro trong phân tử cellulose. Cellulase có thể được chia thành 3 enzym chính dựa trên cơ chế hoạt động, trình tự axit amin và cấu trúc của chúng Endo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.4) Exo-(1,4)-β-D-glucanase (EC 3.2.1.91) β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase (EC 3.2.1.4) còn có tên gọi khác nhau là Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4-glucanase, β-1,4-Endoglucan hydrolase, cellulase A, cellulosin AP, celludextrinase, carboxymethylcellulase…cơ chế hoạt động của enzym này là tấn công cellulose một cách ngẫu nhiên tại các vị trí bên trong phân tử cellulose và phân cắt chuỗi polysaccharid bằng việc chèn các phân tử nước vào giữa các liên kết β-1,4 glucosid. Kết quả tạo ra các chuỗi glucan có độ dài khác nhau. Enzym này có thể thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của các cơ chất cellulose, lignin và các β-D-glucan của ngũ cốc [1]. Exoglucanase (EC 3.2.1.91) enzym này còn có tên gọi khác như Exo-β-1,4- glucanase, cellobiohydrolase, Exo-cellobiohydrolase, Exo- β-1,4-glucan cellobiohydrolase, cellobiose, C1 cellulase… bắt đầu bằng việc tấn công vào đầu khử hoặc không khử của chuỗi polysacharid và giải phóng các β-cellobiose. Exoglucanse có thể hoạt động lên các cellulose dạng tinh thể, lên lớp vỏ bên ngoài chuỗi cellulose của cấu trúc tinh thể. Đặc điểm hình học có ý nghĩa nhất của phần xúc tác của CBHs là cấu trúc hình ống được tạo ra hai lớp bề mặt. Cấu trúc hình ống này có thể toàn bộ hoặc một phần của trung tâm hoạt động. Dạng hình ống của trung tâm hoạt động có thể là hình dáng duy nhất của exoglucanase. CBHs là exoglucanse thường gặp nhất. Các CBHs khác nhau được sinh tổng hợp bởi các vi khuẩn hoặc nấm mốc với các trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 5,6,7,9,48 và 74. CBHs nấm mốc thuộc họ 6, 7 và 48, CBHs vi khuẩn hiếu khí thuộc họ 6 và 48, CBHs của vi khuẩn kỵ khí thuộc họ 9 và họ 48 [1]. β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có tên gọi khác như β-1,4-glucosidase hoạt động đặc biệt lên các cellobiose disaccharid tạo ra sản phẩm cuối glucose. Enzym này thủy phân gốc β-D-glucosid không khử ở đầu tận cùng để giái phóng glucose. β-D- glucosidase (BGs) là enzym thủy phân các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. Hoạt tính của BGs lên các cellulose không hòa tan là không đáng kể, chúng chủ yếu 4
thủy phân cellobiose. Các BG khác nhau được thu nhận từ các vi khuẩn, nấm mốc, động vật và thực vật khác nhau với trung tâm xúc tác phụ thuộc vào họ 1,3 hoặc 9. Dựa trên các dữ liệu phân tích cấu trúc tương đồng, cấu trúc lập thể hóa học của họ 1 và 3 BGs thuộc loại duy trì, trong khi họ 9 thuộc loại đảo ngược. BGs có trung tâm hoạt động dạng túi, nơi chúng được liên kết với các đầu gluocse không khử và ghim các glucose từ cellobiose và cellodextrin [1]. Hình 1.1 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [2] Trong hầu hết các cách phân loại cơ bản thì thì cellulase thuộc nhóm enzym đơn chức năng được xác định đó là các cellobiohydrolase (CBHs, exo-β-(1,4)-d glucanases), endoglucanase (EGs, endo β-(1,4)-glucanase) và β-d-glucosidase. CBHs là enzym thủy phân cellulose từ đầu chuỗi, trong khi EGs là loại enzym thủy phân cellulose một cách ngẫu nhiên từ bên trong chuỗi. Cellobiase thủy phân các cellobiose, sản phẩm cuối cùng của CBHs là glucose do vậy mà ngăn cản được sản phẩm cuối kìm hãm enzym [3]. EGs có khả năng tạo ra các cellulose chuỗi ngắn hơn để thuận tiện cho quá trình thủy phân bởi enzym. Sự kết hợp hoạt tính của EG và CBHs giải phóng một lượng lớn các cellodextrin hòa tan và các cellobiose. β-d-glucosidase thủy phân các dimer glucose thành glucose . 5
Hình 1.2 Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulose [4] 1.1.2. Nguồn thu nhận cellulase Cellulase được sinh tổng hợp trong tự nhiên bởi một số loài vi sinh vật và cả một số động vật và côn trùng. Các vi sinh vật sinh cellulase có mặt ở nhiều nơi, những vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các polysacharid phức tạp thành các đường đơn giản mà chúng có thể đồng hóa được. Các vi sinh vật có khả năng sinh cellulase trong tự nhiên bao gồm cả xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn. Các vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose có cả vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, cả chủng ưa ấm và chịu nhiệt. Môi trường mà chúng có mặt rất đa dạng bao gồm cả những nơi có nhiệt độ, áp suất cao tới những nơi có pH khắc nghiệt [5]. Vi khuẩn sinh cellulase đã từng được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như dạ cỏ ở các động vật nhai lại (Hungater, 1957), đất (Black et al., 1985) phân (Madden, 1982), chất thải đô thị (Stutzenberger et al., 1970), nước cống (Muray et al., 1984), suối nước nóng (Sissons et al., 1987) [6] Côn trùng là động vật được quan tâm nhiều nhất về nhóm vi sinh vật cộng sinh trong đường ruột và sự đa dạng sinh học của chúng. Có khoảng hơn 20% côn trùng có liên quan tới vi sinh vật cộng sinh. Vai trò của các vi sinh vật cộng sinh này là khả năng sinh cellulase giúp cho các côn trùng có thể chuyển hóa các nguồn thức ăn có nguồn gốc là lignocellulose (Morrison et al,2009) [7]. Từ những năm 1992 Hethener và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn sinh cellulase từ ruột của mối ăn gỗ Nasutitermes lujae. Kết quả đã phân lập được chủng vi khuẩn yếm khí Clostridium termitidis sp đồng thời nghiên cứu quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng. Đến nay đã có rất nhiều vi khuẩn từ ruột mối được chứng minh có khả năng sinh cellulase như chủng MX5T được phân lập từ ruột mối Mastotermes ở Autrialia được xác định là có khả năng sinh cellulase và xylanase, với kỹ thuật định tên bằng 16S rDNA chủng MX5T được xác định là Cellulosimicrobium variable [8]. 6
Các chủng vi khuẩn hiếu và yếm khí có khả năng sinh cellulase cũng đã được phân lập từ mối Zootermopsis angusticollis được công bố bới Wenzel và cộng sự 2001 là các chủng thuộc chi Cellulomonas, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium [9]. Các vi khuẩn phân lập từ loài mối Heterotermes và Odontotermes được xác định là có tiềm năng sinh cellulase, kết quả định tên cho thấy các chủng phân lập được thuộc các chi Bacillus, Staphylococus và Enterobacter. Bacillus cereus được xác định là có tiềm năng sinh cellulase cao nhất với hoạt độ endoglucanase, FPase và β-glucosidase tương ứng là 5,06 U/mg; 2,52 U/mg và 6,01 U/mg sau khi đã tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo Chen và cộng sự [10]. 1.1.3. Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các thông số của môi trường nuôi cấy như nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng, tỷ lệ oxy, thời gian nuôi cấy, thành phần môi trường, pH của môi trường … 1.1.3.1 Sinh tổng hợp cellulase từ vi khuẩn Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym thường bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ quá cao gây ra sự biến tính enzym, các protein vận chuyển và các protein khác, màng tế bào bị tổn thương vì hai lớp lipid bị hòa tan [11]. Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ rất thấp, màng tế bào có thể bị kết đông, enzym ngừng hoạt động. Nói chung, nếu vượt quá nhiệt độ tối ưu của vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào đều bị ảnh hưởng. Do ảnh hưởng hai mặt, vừa có lợi vừa có hại của nhiệt độ đối với vi sinh vật mà có thể xác định các khoảng nhiệt độ cơ bản đối với sự sinh trưởng của vi sinh vât là nhiệt độ thấp nhất (minimum), nhiệt độ tối ưu (optimum) và nhiệt độ cao nhất (maximum) đối với sự sinh trưởng [12]. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng Micrococus sp là 37oC nhưng nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh cellulase là 27oC. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh cellulase là 30oC đối với các chủng Cellulomonas ASN2 đối với các chủng phân lập từ đất và khả năng sinh tổng giảm khi nhiệt độ lên 45oC (M. Irfan et al.,2012)[13] Với vi khuẩn phân lập từ ruột mối đã được báo cáo có nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh cellulase là 37oC (D.Submitted et al, 2013) [14] và (Apurv et al., 2014) [15]. 7