Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:138

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên trình bày: Nghiên cứu tách chiết một số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm; Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của các cao chiết rễ Khổ sâm; Nghiên cứu khả năng kháng ung thư của cao chiết rễ Khổ sâm trên các dòng tế bào ung thư gan HepG2 ùng tế bào ung thư vú BT474.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO NGỌC MINH TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT CHỨA ALKALOID VÀ FLAVONOID CHIẾT TÁCH TỪ RỄ CÂY KHỔ SÂM (SOPHORA FLAVESCENS AIT.) TRỒNG TẠI TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Ngô Đại Nghiệp 2. GS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn Thành phố Hồ Chí Minh – 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận n n y l công tr nh nghi n cứu của tôi ƣ i s hƣ ng ẫn khoa học của PGS. TS. Ngô Đại Nghiệp v GS. TS. Ho ng Nghĩa Sơn. C c số liệu kết quả trong luận n l trung th c v m t phần đƣ c công ố trong c c tạp chí chuy n ngành. Những trích ẫn v t i liệu tham khảo trong luận n có nguồn gốc x c th c. Th nh phố Hồ Chí Minh ng y 05 tháng 5 năm 2022 T c giả luận n, Cao Ngọc Minh Trang
ii LỜI CẢM ƠN Lu h h h i i n Sinh học Nhi ới, Học vi n Khoa học và Công ngh - Vi H h họ g gh Vi N T g h ghi gi h hi gi ể hoàn thành lu n án này. Tôi xin trân trọng c ơ ới: - PGS. TS. Ng Đ i Nghi GS TS H g Nghĩ Sơ - h g g i Th h ớ g h họ g i và ọi i i n thu i h i g h i gi h hi n lu - PGS. TS. Nguyễn Thị Ph ơ g Th o, TS. Lê Thành Long và các ồng nghi p ó h ng góp ý quý báu cho tôi trong quá trình nghiên c u và hoàn thi n lu n án. - Học vi n Khoa học và Công ngh - Vi H h họ g gh Vi t Nam, h i n Sinh học Nhi ới, gi i ki n thu i h i g h họ ghi - DS. Nguyễn Tiến Hùng – Cty Cổ ph YD c phẩm Vimedimex 2, ThS. Nguyễn Huy Vỹ - Trung tâm Kiểm nghi h D ơ g, ThS Nguyễn Khắc M nh – Vi n Nhi ới M i T ng gi thu th p và hỗ tr phân tích m u trong quá trình th c hi tài. - Ban Giám hi u T g Đ i họ ă L g, Ban chủ nhi m khoa CNSH, Khoa Công ngh , Khoa Công ngh ng dụng và ồ g ghi ủ gh i i n thu i h i g h i gi ghi i h T i i g iế ơ ắ h ới gi h g i h và b n bè h h ng vi i g h họ ghi Tác giả Cao Ngọc Minh Trang
iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1.Tổng quan về th c vật học Khổ Sâm ....................................................................3 1.1.1. Vị trí phân loại ..................................................................................................3 1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái ...................................................................................3 1.1.3. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến ...............................................................4 1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................4 1.1.5. Tác dụng ƣ c lý của Khổ Sâm. .......................................................................7 1.2. Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa ..............................................................10 1.2.1. Gốc t do và stress oxy hóa ...........................................................................10 1.2.2. Chất kháng oxy hóa .........................................................................................12 1.2.3. Hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoid trong rễ cây Khổ sâm........................14 1.3. Tổng quan về hoạt tính kháng tế o ung thƣ: ...................................................15 1.3.1. Quá trình Apoptosis ........................................................................................15 1.3.2. Quá trình Necrosis...........................................................................................15 1.3.3. Hoạt tính kháng ung thƣ từ rễ Khổ sâm ..........................................................17 1.3.4. Dòng tế o ung thƣ gan .................................................................................18 1.3.5. Dòng tế bào ung thu vú ...................................................................................19
iv 1.4. Phƣơng ph p x c định matrine và oxymatrine trong Khổ sâm ..........................21 1.4.1. Định tính v định lƣ ng matrine .....................................................................21 1.4.2. Phân lập matrine và oxymatrine làm chất đối chiếu .......................................22 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP........................................................... 23 2.1. Đối tƣ ng nghiên cứu.........................................................................................23 2.1.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu .......................................................................23 2.1.2. Vật Liệu ...........................................................................................................23 2.1.3. Thiết bị sử dụng ...............................................................................................24 2.2. Phƣơng ph p nghi n cứu....................................................................................25 2.2.1. Định anh v đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu ..................................................25 2.2.2. Chiết xuất ƣ c liệu Khổ sâm định hƣ ng phân lập alkaloid matrine và oxymatrine .................................................................................................................29 2.2.3. Định lƣ ng polyphenol và flavonoid tổng số ..................................................32 2.2.4. Phƣơng ph p x c định hoạt tính kháng oxy hóa .............................................33 2.2.5. Nuôi cấy tế bào................................................................................................34 2.2.6. Hoạt tính kháng tế o ung thƣ HepG2 v BT474 của các cao chiết phân đoạn từ rễ Khổ sâm ............................................................................................................35 2.2.7. Phƣơng ph p thống kê.....................................................................................39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN .................................................................. 40 3.1. Định anh v đánh giá chất lƣ ng ƣ c liệu .....................................................40 3.1.1. Định danh loài cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguyên ........................................40 3.1.2. Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu ........................................................................42 3.2. Kết quả tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm ............................49 3.2.1. Phân lập Matrine và Oxymatrine bằng phƣơng ph p sắc ký điều chế ............49 3.2.2. X c định tổng polyphenol và tổng flavonoi trong ƣ c liệu ........................56 3.2.2.1. Định tính thành phần flavonoi trong ƣ c liệu. .........................................56 3.2.2.2. Định lƣ ng h p chất polyphenol tổng số (TPC) ..........................................58
v 3.2.2.3. Định lƣ ng flavonoid tổng số ......................................................................59 3.3. Kết quả hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết rễ Khổ sâm. .............................61 3.4. Kết quả ức chế các tế o ung thƣ .....................................................................63 3.4.1. Ảnh hƣởng cao chiết phân đoạn t i s tăng sinh của tế bào HepG2 và BT474. ...................................................................................................................................63 3.4.2. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên mật đ tế bào, hình thái tế bào và nhân .........66 3.4.3. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên chu kì tế bào ..................................................71 3.4.4. Ảnh hƣởng của cao CHCl3 lên quá trình Apoptosis.......................................73 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 81 1. Kết luận ........................................................................................................81 2. Kiến nghị ........................................................................................................81 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................................ 82 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ......................................................... 83 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………...………………………………….………...83 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..95
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid ACN : Acetonitrile AIDS : Acquired Immuno-deficiency Syndrome (h i chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) AR : Analytical Reagent (thuốc thử dùng cho phân tích) ATCC : American Type Culture Collection (B sƣu tập giống của Mỹ) BT474 : Breast Tumor 474 (Dòng tế o ung thƣ vú BT474) DĐTQ : Dƣ c điển Trung Quốc DĐVN : Dƣ c điển Việt Nam DMEM : Môi trƣờng Dulbecco's Modified Eagle DMSO : Dimethylsulfoxide DNPH : 2,4-dinitrophenylhydrazin DPPH• : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EA : Ethyl acetate EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid disodium salt EtOH : Ethanol FCR : Folin–Ciocalteu Reagent (thuốc thử Folin-Ciocalteu) FRAP : Ferric Re ucing Antioxi ant Power (năng l c khử sắt) FV : FRAP Value (chỉ số FRAP) GAE : Gallic acid Equivalent (đƣơng lƣ ng gallic acid) GSH : Glutathione HepG2 : Hepatoma G2 (Dòng tế o ung thƣ gan HepG2) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HRMS : High Resolution Mass Spectrometry (Khối phổ phân giải cao) IC50 : Inhibition concentration at 50 % (nồng đ ức chế 50 %) LOD : Loss On Drying (Mất khối lƣ ng do làm khô)
vii OD : Optical Density (Mật đ quang) PBS : Phosphate-buffered saline QE : Quercetin Equivalent (đƣơng lƣ ng quercetin) RT- PCR: Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction Rf : Retention factor (chỉ số lƣu giữ) RNS : Reactive Nitrogen Species (Các gốc t do chứa Ni tơ) ROS : Reactive Oxygen Species (Các gốc t do chứa Oxy) SFNP : Sophora Flavescens Nanoparticles SPE : Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TFC : Total Flavonoid Content (hàm lƣ ng flavonoid tổng số) TLC : Thin layer Chromatography (Sắc ký l p mỏng) TPC : Total Phenolic Content (h m lƣ ng h p chất polyphenol tổng số)
viii DANH MỤC BẢNG B ng 1.1: M t số dạng gốc t do ...........................................................................11 B ng 1.2: Tính chất hóa lý của matrine và oxymatrine ............................................21 B ng 2.1: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu. ...........................................24 B ng 2.2: Chƣơng tr nh pha đ ng phân tách matrine và oxymatrine .......................27 B ng 2.3: Chƣơng tr nh pha đ ng hệ sắc ký điều chế ..............................................31 B ng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR cho các gene liên quan t i s chết theo chƣơng tr nh.....................................................................................37 B ng 2.5: Trình t cặp mồi đặc hiệu sử dụng cho phản ứng định lƣ ng Realtime RT- PCR ....................................................................................................................37 B ng 3.1: Kết quả search last NCBI .......................................................................41 B ng 3.2: Kết quả đ ẩm, tro toàn phần và tổng chất chiết của nguyên liệu............44 B ng 3.3: Chƣơng tr nh pha đ ng HPLC-UV phân tách matrine và oxymatrine .....46 B ng 3.4: Khảo sát tỉ lệ dung môi EtOH chiết matrine và oxymatrine từ rễ Khổ sâm ...................................................................................................................................48 B ng 3.5: Các thông số thẩm định phƣơng ph p HPLC-UV x c định matrine và oxymatrine. ................................................................................................................48 B ng 3.6: H m lƣ ng matrine và oxymatrine trong cao phân đoạn EtOH 80 %, EA, CHCl3 v cao nƣ c ....................................................................................................49 B ng 3.7: Tối ƣu l m sạch dịch chiết ƣ c liệu trên c t OASIC MCX, sử dụng 200 mg cao CHCl3 cho ƣ c khảo sát này.......................................................................50 B ng 3.8: Nhận danh flavonoid trong cao EA bằng HPLC-HRMS .........................57 B ng 3.9: Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết rễ Khổ sâm ..............61
ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm ...................................4 Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm...................................................5 Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid .....................................................6 Hình 1.4: Phân iệt s kh c nhau giữa Apoptosis v Necrosis . ..............................16 Hình 1.5: Dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 . ............................................................18 Hình 1.6: Dòng tế o ung thƣ vú BT474 ................................................................20 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất khảo sát ...........................................................30 Hình 3.1: (A), (B) hình thái cây Khổ sâm 2 năm tuổi đƣ c trồng tại Đắk Nông và thu hái vào tháng 3/2016, (C) hoa Khổ sâm, (D) rễ Khổ sâm tƣơi (E) rễ Khổ sâm phơi khô, (F) mặt cắt ngang của rễ Khổ sâm khô, (G), rễ Khổ sâm khô chặt nhỏ, (H) b t rễ Khổ sâm. .........................................................................................................40 Hình 3.2: (A) Tinh b t vi phẫu và (B) vi phẫu mặt cắt ngang rễ Khổ sâm ..............42 Hình 3.3: M t số thành phần b t rễ Khổ sâm quan s t ƣ i kính hiển vi quang học (X10) .........................................................................................................................43 Hình 3.4: Phản ứng v i NaOH của rễ Khổ sâm phơi khô ........................................44 Hình 3.5: Kết quả định tính alkaloi trong ƣ c liệu ...............................................46 Hình 3.6: Phƣơng tr nh đƣờng chuẩn matrine và oxymatrine ..................................47 Hình 3.7: Cấu trúc pha tĩnh c t OASIS MCX ..........................................................51 Hình 3.8: Sắc ký đồ điều chế matrine và oxymatrine ...............................................52 Hình 3.9: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của matrine điều chế. ...................................................................................................................................54 Hình 3.10: Sắc ký đồ và phổ khối HRMS kiểm tra đ tinh khiết của oxymatrine điều chế .....................................................................................................................55 Hình 3.11: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao chiết EA ..................................56 Hình 3.12: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ gallic acid và đ hấp thu quang 765 nm. .........................................................................................................58 Hình 3.13: Tƣơng quan tuyến tính giữa nồng đ quercetin và đ hấp thu quang ở 415 nm. .....................................................................................................59 Hình 3.14: Phân bố TPC và TFC trong b t rễ Khổ sâm và các loại cao ..........60 Hình 3.15: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào HepG2 .......................................................................................................................63
x Hình 3.16: Ảnh hƣởng của cao EA (A), CHCl3 (B), EtOH (C) và H2O (D) lên tế bào BT474 ........................................................................................................................64 Hình 3.17: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên s tăng sinh tế bào ung thƣ BT474. a c : kh c iệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05). .......................64 Hình 3.18: S thay đổi hình thái tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm: 3,125 µg/mL (A), 6,25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 25 µg/mL (D), 50 µg/mL (E) và 100 µg/mL (F) đ phóng đại x 100. .........................66 Hình 3.19: Đƣờng tuyến tính giữa mật đ tế bào/ giếng v i giá trị OD tƣơng ứng đƣ c đo tại ƣ c sóng 450 nm. .................................................................................66 Hình 3.20: Mật đ tế bào HepG2/giếng khi xử lý v i các mức nồng đ khác nhau của cao chiết CHCl3 ..................................................................................................67 Hình 3.21: Tỉ lệ quẩn thể tế bào HepG2 xử lý v i các mức nồng đ cao chiết CHCl3. (A) Q1: quần thể tế bào necrosis, Q2: quần thể tế o nh thƣờng, Q3: quần thể tế bào apoptosis s m, Q4: quần thể tế bào apoptosis mu n và (B) *** khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,001), ** khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.01). ................68 Hình 3.22: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình thái nhân. A (0 mg/L) , B (1 µg/mL), C (10 µg/mL), D (100 µg/mL); Thang đo: 30 µm.................69 Hình 3.23: Ảnh hƣởng của cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm lên hình dạng tròn nhân (Nuclear round shape). a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05). ................70 Hình 3.24: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau........................................................71 Hình 3.25: Tỉ lệ tế bào trong pha G0/G1 và G2/M khi đƣ c xử lý v i cao chiết CHCl3 từ rễ Khổ sâm ở các nồng đ khác nhau. a, b, c, d: khác biệt có ý nghĩa thống k (P ≤ 0,05). .............................................................................................................72 Hình 3.26: S biểu hiện mRNA gene p53, Bcl-2, Caspase 9, Caspase 3 và Bax của tế bào HepG2 thông qua phản ứng Realtime-PCR sau 24h và 48h cảm ứng bằng CHCl3 v nhóm đối chứng ........................................................................................73 Hình 3.27: Tỉ lệ tế bào nh thƣờng ƣ i s cảm ứng của dịch chiết sau 24h, 48h và 72h so v i nhóm đối chứng (*p
xi Hình 3.28: Tỉ lệ tế bào apoptosis s m và apoptosis mu n ƣ i s cảm ứng của dịch chiết sau 24h, 48h và 72h so v i nhóm đối chứng (*p
1 MỞ ĐẦU Nghiên cứu sử dụng cây thuốc trong y học cổ truyền hiện nay đang đƣ c phát triển rất mạnh và có chiều sâu ở Việt Nam. Nằm ở vùng khí hậu nhiệt đ i gió mùa, Việt Nam đƣ c đ nh gi l nƣ c đứng thứ 16 trên thế gi i về s phong phú, đa ạng sinh vật trong đó có đ đa ạng về cây thuốc. Để tăng th m tính đa ạng của cây thuốc Việt Nam và phong phú các bài thuốc trong y học cổ truyền thì việc di th c m t số cây thuốc có giá trị về trồng và phát triển l m ƣ c liệu cũng l m t việc làm rất cần thiết. Trong đó khổ sâm (Sophora flavescens Ait.) l ƣ c liệu đã đƣ c sử ụng từ lâu trong y học cổ truyền phƣơng đông để chữa nhiều ệnh nhƣ chống loạn nhịp tim c c chứng vi m xuất huyết ti u ho l v ký sinh tr ng. Rễ của cây Khổ sâm (Sophorae Flavescentis Radix) đã đƣ c chứng minh trong thử nghiệm lâm sàng là không gây đ c đối v i con ngƣời. Các nghi n cứu tr n thế gi i cho thấy cao chiết từ rễ khổ sâm có chứa c c h p chất alkaloi v flavonoi có hoạt tính kh ng oxy hóa kh ng vi m kh ng khuẩn v ức chế s ph t triển của m t số ng tế o ung thƣ nhƣ HepG2, MCF7 và A549. Tuy nhi n cơ chế tăng sinh ị ức chế trong tế bào HepG2 v BT474 ƣ i t c đ ng của chiết xuất từ rễ Khổ sâm vẫn chƣa đƣ c nghiên cứu chuyên sâu. Tại Việt Nam, m t số chế phẩm đƣ c sản xuất từ cây Khổ sâm nhƣ Ninh tâm vƣơng h tr trong ệnh lý nhịp tim nhanh Nữ vƣơng h tr trong điều trị vi m nhiễm phụ khoa ở nữ gi i, tuy nhiên chủ yếu nhập nguyên liệu từ Trung Quốc. Hệ quả là nguồn nguyên liệu còn bị đ ng và các đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu chƣa kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay, khổ sâm đã đƣ c i th c trồng tại Đắk Nông - Tây Nguy n bởi Công ty Cổ phần Dƣ c phẩm BV Pharma. Từ đó, các nghiên cứu đ nh giá chất lƣ ng ƣ c liệu nhằm x c định thành phần h m lƣ ng hoạt chất có hoạt tính sinh học v x c định đ c tính là việc cần phải đƣ c th c hiện giúp chủ đ ng nguồn ƣ c liệu trong sản xuất v đảm ảo chất lƣ ng nguy n liệu. Trong định hƣ ng chiến lƣ c của ng nh ƣ c Việt Nam đến năm 2020 v tầm nh n đến năm 2030 cũng đã đề ra mục tiêu phát triển để Việt Nam có thể chủ đ ng đƣ c 60 % về thuốc v o năm 2020 m trong đó chú trọng đến thuốc có nguồn gốc th c vật. Theo báo cáo của cục quản lý ƣ c và tổ chức IQVIA năm 2020 thuốc sản xuất trong nƣ c chiếm 47 % nhu cầu sử dụng.
2 Tuy vậy ƣ c điển Việt Nam V vẫn chƣa có chuy n luận ri ng về ƣ c liệu rễ khổ sâm đồng thời hiện nay chỉ có m t v i công tr nh nghi n cứu về ƣ c liệu khổ sâm tại Việt Nam, gây khó khăn trong đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu thô v chế phẩm chứa ƣ c liệu n y trong nƣ c v ngoại nhập. Từ những lý do cấp thiết tr n đề t i: “Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết tách từ rễ cây Khổ sâm (Sophora flavescens Ait.)” trồng tại Tây Nguyên” đƣ c th c hiện. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: - Đ nh gi đƣ c m t số hoạt tính sinh học của cao chiết chứa alkaloid và flavonoid chiết xuất từ rễ Khổ sâm trồng tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu chính của luận án: - Đ nh gi chất lƣ ng ƣ c liệu - Nghiên cứu tách chiết m t số hoạt chất chính trong rễ Khổ sâm. - Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá của các cao chiết rễ Khổ sâm. - Nghiên cứu khả năng kh ng ung thƣ của cao chiết rễ Khổ sâm trên các dòng tế o ung thƣ gan HepG2 v ng tế o ung thƣ vú BT474. Tính mới của đề tài: - Các kết quả đƣ c th c hiện và công bố trong đề tài này là những nghiên cứu chuy n sâu đầy đủ nhất từ trƣ c t i nay tr n đối tƣ ng th c vật Khổ sâm di th c đang đƣ c trồng tại Tây Nguyên. - Lần đầu ti n đ nh gi đƣ c tác dụng kháng oxy hóa và ức chế tăng sinh tế o ung thƣ gan ung thƣ vú của cao rễ cây Khổ sâm trồng ở Tây Nguyên. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Việc x c định khả năng kh ng oxy hóa v ức chế tăng sinh tế o ung thƣ gan ung thƣ vú của cao CHCl3 từ rễ cây Khổ sâm đã góp phần khẳng định chất lƣ ng của cây Khổ sâm đang trồng tại Tây Nguyên. - Phát hiện và chứng minh ƣ c tính của rễ cây Khổ sâm trồng tại Tây Nguy n đã góp phần xây d ng chiến lƣ c bảo tồn, phát triển và thƣơng mại hóa cây Khổ sâm ở Tây Nguyên
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về thực vật học Khổ Sâm Theo The Plant list, có 62 loài thu c chi Sophora đƣ c chấp nhận và phân bố chủ yếu tại c c v ng Trung Đông Đông Á, Nam Mỹ và New Zealand [1]. 1.1.1. Vị trí phân loại Tên khoa học: Sophora flavescens Ait. Tên Việt Nam: Dã hòe, khổ cốt, Khổ sâm cho rễ (phân biệt v i Khổ sâm cho lá - Croton tonkinensis Gagnep) sơn đậu căn địa sâm… Theo hệ thống phân loại Takhtajan A.L (2009) cây Khổ sâm có vị trí phân loại thu c ng nh Ngọc lan (Magnoliophyta) l p Ngọc lan (Magnoliopsi a) phân l p Hoa hồng (Rosi ae) li n Đậu (Fa anae) Đậu (Fa ales) họ Đậu (Fabaceae), chi Sophora, loài Sophora flavescens Ait. [2]. 1.1.2. Mô tả đặc điểm hình thái Khổ sâm là cây bụi nhỏ có c c đặc điểm đặc trƣng nhƣ: Thân cây cao 0,5 - 1,2 m; phân nhiều cành và c nh non có lông tơ rải rác; lá cây kép lông chim lẻ mọc so le gồm 5 - 10 đôi, lá chét hình mác dài 3 - 4 cm, r ng 1 - 2 cm, dốc thuôn đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt ƣ i lông mịn màu xám; hoa màu vàng nhạt, đ i 5 răng h nh chuông tr ng 5 c nh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn và cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm; quả đậu, thắt lại giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đƣờng kính 5 - 8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3-7, hình cầu m u đen; rễ hình trụ dài, vỏ ngoài màu vàng trắng [3, 4]. Theo ƣ c điển Trung Quốc 2015 (DĐTQ), rễ Khổ sâm có dạng hình trụ dài 10 – 30 cm đƣờng kính từ 1 đến 6,5cm và phân nhánh phần phía ƣ i. Bề mặt ngoài của rễ có màu nâu xám hoặc nâu vàng, có nếp nhăn ọc theo rễ và có các nốt sần. Vỏ ngoài của rễ có màu vàng, mỏng và nhẵn, dễ gãy và cu n lại, dễ bong tróc. Mặt cắt rễ có màu vàng trắng, cứng, không dễ gãy, dạng s i có kết cấu xuyên tâm và có bó mạch không điển h nh trong c c v ng đồng tâm hoặc phân tán rời rạc. Rễ cây Khổ sâm có vị đắng [5].
4 Hình 1.1: B phận trên mặt đất (A) và rễ (B) của Khổ sâm [6] 1.1.3. Phân bố sinh thái, thu hái và chế biến Khổ sâm có nguồn gốc ở Trung Quốc đƣ c di th c vào Việt Nam v o đầu những năm 1970. Chúng là cây sống lâu năm về m a đông phần trên tàn lụi, phần gốc còn lại sẽ nảy mầm vào giữa m a xuân năm sau. Cây ƣa s ng ƣa ẩm, thích nghi v i điều kiện của nƣ c ôn đ i ẩm và vùng nhiệt đ i núi cao, nhiệt đ trung bình năm khoảng 15 oC. Cây trồng ở Sa Pa sinh trƣởng tốt, ra hoa nhiều nhƣng không có quả [3]. Khổ sâm đƣ c công ty cổ phần sản xuất chế biến nông lâm sản ƣ c liệu sạch Đắk Nông trồng để lấy ƣ c liệu. Rễ sau khi thu h i đƣ c rửa sạch đất cát, thái phiến phơi khô, hoặc đem rễ tƣơi ngâm nƣ c vo gạo nếp m t đ m rửa sạch để trong 3 giờ rồi thái phiến phơi khô [3]. 1.1.4. Thành phần hóa học Các công trình nghiên cứu về cây Khổ sâm chủ yếu từ các nhà khoa học Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Nga nơi m lo i cây n y chủ yếu tập trung phân bố. Tính đến năm 2015 đã có hơn 200 h p chất đƣ c phân lập v x c định cấu trúc từ ƣ c liệu này bao gồm: 47 alkaloid, 9 terpenoid, 124 flavonoid (3 isoflavanon, 41 flavanon, 15 flavonol, 13 flavanonol, 27 isoflavon, 2 homoisoflavon, 7 chalcon, 2 biflavonoid, 14 pterocarpan), và 26 chất là thành phần khác nhƣ lignan phenylpropanoid, coumarin và phenolic acid, trong đó hai nhóm hoạt chất chủ yếu đó là flavonoid và alkaloid [6] .
5 Kuraramin Isokuraramin Sophocarpin Isosophocarpin 7,11-Dehydromatrin Matrine 9a-Hydroxysophocarpin Sophoridin Lupanin 9a-hydroxysophoramin Isomatrine Oxysophocarpin 7a-hydroxysophoramin Sophoranol Oxymatrine Leontalbinin N-oxid 9a-hydroxymatrin Mamanin Lamprolobin Hình 1.2: M t số thành phần alkaloid của Khổ sâm [6]
6 Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu chiết xuất, phân lập các h p chất trong rễ Khổ sâm còn hạn chế. M t số tài liệu tham khảo tiếng Việt chỉ viết về Khổ sâm nói chung, và chủ yếu viết về mô tả h nh th i đặc tính sinh thái, nguồn gốc xuất xứ, hay bài thuốc đông y có th nh phần Khổ sâm phối h p v i các vị thuốc khác và các ứng dụng trong dân gian. Năm 2015 Trần Hồng Quang và c ng s tiến hành chiết tách các flavonoid từ rễ Khổ sâm gồm isoxanthohumol, norkurarinon, kurarinon, 2- methoxykurarinon, kushenol T, norkurarinol, kuraridin và formononetin [7]. Năm 2019, Phan Nguyễn Trƣờng Thắng và c ng s đã tiến hành phân lập ba h p chất flavonoid từ rễ Khổ sâm là isoxanthohumol, kurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon [8]. 1.1.4.1. Alkaloid Alkaloid là thành phần hóa học có hoạt tính chính trong Khổ sâm. Hiện nay có khoảng 27 alkaloi đã đƣ c phân lập v x c định cấu trúc từ rễ Khổ sâm, 20 alkaloid khác từ các b phận trên mặt đất của Khổ sâm nhƣ hoa và hạt của cây đã đƣ c báo cáo [9]. C c alkaloi đƣ c phân loại d a vào cấu trúc bao gồm: cấu trúc kiểu matrine, cấu trúc kiểu cytisin, cấu trúc kiểu anagyrin và cấu trúc kiểu lupinin (Hình 1.2) [10, 11, 12]. 1.1.4.2. Flavonoid Flavonoid là nhóm l n nhất của h p chất polyphenol và hầu hết đều có màu. Flavonoid có cấu trúc mạch car on cơ ản là C6 – C3 – C6, trong đó gốc C6 (B) gắn tại vị trí C3 có nguồn gốc từ con đƣờng shikimic; C6 (A) còn lại có nguồn gốc từ s h p lại của 3 phân tử acetic acid [13, 14]. C B A C C Hình 1.3: Khung cấu trúc chung của flavonoid Từ các b phận của cây Khổ sâm, 124 h p chất nhóm flavonoi đã đƣ c phân lập nhƣ kushenol A, B, C, E, F, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, kurarinon, isokurarinon, norkurarinon, (2S)-2’-methoxykurarinon, kurarinol, neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianone A, leachianone G,
7 sophoraflavanone G, 8- lavan ulylkaempferol formononetin v isoxanthohumol đã đƣ c x c định có tác dụng ƣ c lý in vitro và in vivo [15, 16, 17, 18, 19, 20]. 1.1.4.3. Terpenoid h h h Đến năm 2015 c c nh nghi n cứu đã phân lập đƣ c 9 h p chất triterpen gồm lupeol lupenone monogynol B β-amyrenol soyasaponin І v sophoraflavosi І II III IV [6]. M t loạt các h p chất khác, bao gồm m t số lignan nhƣ citrusin A citrusin B và alaschanioside A phenylpropanoi coumarin v phenolic aci cũng đã đƣ c phân lập từ rễ Khổ sâm. 12 dẫn xuất dibenzoyl m i (sophodibenzosid A-L) đã đƣ c tinh chế từ phân đoạn cao chiết n-butanol của Khổ sâm. Các chất khác nhƣ syringin, corchionosid C, coniferin, piscidic acid và benzyl O-β-D-glucopyranosid cũng đã đƣ c phân lập từ thân và lá của cây này [21, 22]. 1.1.5. Tác dụng dược lý của Khổ Sâm. Các hoạt chất của Khổ sâm có tác dụng ƣ c lý khác nhau: tác dụng đối v i trung khu thần kinh, kháng viêm, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, tác dụng l i tiểu, tác dụng đối v i huyết áp, tác dụng đối v i dạ dày và ru t. M t số nghiên cứu m i đây cho thấy chúng còn có khả năng kh ng ung thƣ của tế bào ung thƣ. Trung tâm quản lý ƣ c phẩm và th c phẩm Trung Quốc về việc chứng nhận sản xuất thuốc đã liệt kê ra 20 ứng dụng lâm sàng cho các chế phẩm matrine và oxymatrine. Những ƣ c phẩm này bao gồm: thuốc đạn, viên nén, hạt, viên nang, cốm, viên nang và thuốc tiêm pha liều đã đƣ c sử dụng ở Trung Quốc để chữa các bệnh nhiễm trùng và bệnh tim mạch [6]. Ngoài ra, sản phẩm thuốc và th c phẩm chức năng từ rễ Khổ sâm nhƣ thuốc tiêm Yanshu, Fufang kushen, viên nén Kushen Pian, th c phẩm bổ sung Kushen Hawaii Pham v Kushen Nature’s Health đƣ c sản xuất d a trên những thành phần alkaloid của ƣ c liệu này. 1.1.5.1 T ụ g h g i Các nghiên cứu in vivo và in vitro đã chỉ ra rằng Khổ sâm ức chế phản ứng vi m v ngăn chặn tình trạng viêm, bao gồm cả việc ức chế sản xuất COX-2, iNOS, NO, IL-8, IL-6 và TNF-α. Chiết xuất từ rễ Khổ sâm v i liều ng 200 mg/kg ức chế phản ứng phản vệ a thông qua ƣỡng o (mast cell), giảm s phóng thích histamine từ ƣỡng o của phúc mạc tr n chu t, tr c tiếp l m giảm iểu hiện của phorbol 12-myristate 13-axetat (PMA) và giảm kích thích TNF-a, IL-6 và IL-8 bởi calcium ionophore A23187 [23]. Các hoạt chất đƣ c phân lập từ Khổ sâm nhƣ