Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:171

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh được loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên trồng ở Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp và Tây Ninh; tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt.... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHẠM ĐÌNH DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN - SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp. GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2020
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHẠM ĐÌNH DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO OLIGOCHITOSAN - SILICA NANO VÀ KHẢO SÁT TÍNH KÍCH KHÁNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM Colletotrichum spp. GÂY HẠI CÂY ỚT (Capsicum frutescens L.) Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG 2. PGS. TS. BÙI VĂN LỆ Tp. Hồ Chí Minh – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khác. Những tài liệu tham khảo có nguồn gốc rõ ràng. Nếu có gì sai sót, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Nghiên cứu sinh Phạm Đình Dũng
i MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC .......................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. x TÓM TẮT ....................................................................................................... xii SUMMARY ................................................................................................... xiv MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5 1.1. Giới thiệu chung về cây ớt................................................................................... 5 1.2. Sơ lược về nấm Colletotrichum spp. và bệnh thán thư trên cây ớt ..................... 6 1.2.1. Giới thiệu chung về nấm Colletotrichum spp................................................... 6 1.2.2. Bệnh thán thư trên cây ớt (Chilli anthracnose) và biện pháp phòng trừ .......... 9 1.3. Tổng quan về cơ chế kháng và kích kháng bệnh ở thực vật ............................. 15 1.3.1. Cơ chế kháng bệnh ở thực vật ........................................................................ 15 1.3.2. Chất kích kháng bệnh (elicitor) ở thực vật ..................................................... 17 1.4. Chitin/Chitosan và Silic trong kích kháng bệnh cây trồng ................................ 19 1.4.1. Vai trò chitin/chitosan trong kích kháng bệnh ............................................... 19 1.4.2. Vai trò Silic trong kích kháng bệnh ................................................................ 22 1.5. Chế tạo oligochitosan, nano silica và ứng dụng trong kích kháng bệnh ........... 25 1.5.1. Chế tạo oligochitosan ..................................................................................... 25 1.5.2. Chế tạo nano silica.......................................................................................... 27 1.5.3. Chế tạo oligochitosan-silica nano ................................................................... 28 1.5.4. Ứng dụng vật liệu nano trong nông nghiệp .................................................... 30 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................. 35 2.1. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 35 2.2. Thời gian, địa điểm và điều kiện nghiên cứu .................................................... 35 i
ii 2.2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 35 2.2.2. Điều kiện thực hiện nghiên cứu ...................................................................... 36 2.3. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 38 2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 39 2.4.1. Nội dung 1. Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lập và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt ........................... 39 2.4.2. Nội dung 2. Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano .................. 50 2.4.3. Nội dung 3. Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt chỉ thiên trong điều kiện phòng thí nghiệm.................................................................... 55 2.4.4. Nội dung 4. Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt chỉ thiên trồng trong điều kiện nhà màng và đồng ruộng............................................... 58 2.2.5. Xử lý số liệu ................................................................................................... 60 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 61 3.1. Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.) ........................... 61 3.1.1. Phân lập và định danh hình thái mẫu nấm gây bệnh thán thư ........................ 61 3.1.2. Khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp. đã phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm và nhà màng......................................................................... 64 3.2. Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano ......................................... 74 3.2.1. Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp với H2O2 .......................................... 75 3.2.2 Điều chế hạt nano silica từ nguồn vỏ trấu ....................................................... 84 3.2.3. Điều chế hỗn hợp oligochitosan-silica nano .................................................. 87 3.3. Khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................................................................. 92 3.3.1. Tình hình bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên ớt ............................................................................................................................... 92
iii 3.3.2. Đánh giá về khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên cây ớt ................................................................................ 94 3.4. Khả năng kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và đồng ruộng ............................................................................................... 105 3.4.1. Khả năng kích kháng bệnh thán thư do C. gloeosporioides gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng .................. 106 3.4.2. Khả năng kích kháng bệnh thán thư do Colletotrichum truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng .................. 115 3.4.3. Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do C. gloeosporioides gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng ở đồng ruộng ...................................... 121 3.4.4. Đánh giá khả năng kích kháng bệnh thán thư do C. truncatum gây ra của oligochitosan-silica nano trên cây ớt trồng ở đồng ruộng ...................................... 128 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................. 137 PHỤ LỤC
iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid AATCC American Association of Textile Chemists and Colorists (Hiệp hội các nhà hoá học ngành dệt may và các nhà phối màu) ACT Partial actin AUX Auxin BR Brassinosteroid CAL Calmodulin CHS Chalcone synthase CHI Chalcone isomerase CEBiP Chitin elicitor binding protein, motif lysine hay LYM CERK1 Chitin elicitor receptor kinase 1 CK Cytokinin COS Chitin oligosaccharide CTS Chitosan Da Dalton DP Độ polymer hóa ĐC Đối chứng ĐĐA Độ deacetyl hóa ETI Effector-triggered-immunity EDX Energy Dispersive X-ray (phổ tán xắc nặng lượng tia X) ET Ethylen FE-SEM Field emission scanning electron microscopy (kính hiển vi điện tử quét phân giải cao)
v FT-IR Fourier-transform infrared (Phổ hồng ngoại biến đổi fourier) FW Fresh Weight GA Gibberellic acid GPC Gel permeation chromatography GPDH Glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase GS Glutamine synthetase HEC HydroxyEthylCellulose IR Infrared (phổ hồng ngoại) ITS Internal Transcribed spacer ISR Induced Systemic Resistance JA Jasmonic acid KLPT Khối lượng phân tử hay Mw LAR Localized Acquired Resistance MAPKK Mitogen activated ptotein kinase Mw Molecular weight hay KLPT NSLN Ngày sau lây nhiễm NSXL Ngày sau xử lý NST Ngày sau trồng PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PAL Phenylalanine ammonia lyase PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns PTI PAMP triggered immunity PR protein Pathogenesis-related (PR) protein RLCK Receptor Like cytoplasmic Kinase
vi ROS Reactive oxygen species SOD2 Partial manganese superoxide dismutase SAR Systemic Acquired Resistance SA Salicylic acid SDS Sodium dedecyl sulfate SEM Scanning electron microscopy (kính hiển vi điện tử quét) TEM Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền qua) TF Transcription factor TLB Tỷ lệ bệnh TUB2 β-tubulin UV-Vis Ultraviolet-visible XRD X-ray diffraction (phổ tia X)
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia [17]10 Bảng 1.1. Nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên ớt ở một số quốc gia (tiếp theo) [17] ............................................................................................................... 11 Bảng 2.1. Nhiệt độ và ẩm độ không khí nhà màng trong thời gian thí nghiệm ............ 37 Bảng 2.2. Đặc tính lý hóa đất khu thí nghiệm ............................................................... 38 Bảng 2.3. Đặc điểm khí hậu thời tiết ở Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian thí nghiệm ................................................................................................................... 38 Bảng 2.4. Danh sách các mẫu bệnh đã thu thập được trong đề tài ................................ 40 Bảng 2.5. Thông tin về các mồi được sử dụng trong nghiên cứu ................................. 48 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR ........................................................................... 49 Bảng 3.1. Tình hình bệnh trên lá trong điều kiện gây vết thương (%) .......................... 65 Bảng 3.3. Tình hình bệnh trên trái trong điều kiện không gây vết thương (%) ............ 68 Bảng 3.4. Tỷ lệ bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) ....................... 70 Bảng 3.5. Chỉ số bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) ..................... 71 Bảng 3.6. Kết quả định danh loài Colletotrichum spp. dựa vào trình tự các vùng gen. 73 Bảng 3.7. Sự suy giảm KLPT của chitosan trong dung dịch 4% có và không có H2O2 theo liều xạ ............................................................................................................ 75 Bảng 3.8. Độ ĐĐA% và chỉ số đa phân tán (PI) của chitosan theo liều xạ .................. 76 Bảng 3.9. KLPT (Mw), PI và ĐĐA của chitosan trong dung dịch 2%/H2O2 0,5% theo liều xạ .................................................................................................................... 78 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,01% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. ............................... 80 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,05% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. ............................... 81 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,1% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. ............................... 82 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,5% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. ............................... 83 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 1% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. ...................................... 84
viii Bảng 3.15. Hiệu suất tạo nano silica từ vỏ trấu đã xử lý với HCl 5% .......................... 85 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến mức độ bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................................... 92 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến hoạt tính chitinase (U/mg protein) trong điều kiện phòng thí nghiệm .................. 96 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến hoạt tính của β 1,3-glucanase (µmol/h/mg protein) trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................................................................... 97 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến capsidiol (µg/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm ........................................ 99 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến salicylic acid (ng/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................ 101 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến jasmonic acid (ng/g FW) trong điều kiện phòng thí nghiệm..............................103 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) trên cây ớt trong điều kiện nhà màng .................107 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trong điều kiện nhà màng .............................................................................................................................112 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến tỷ lệ nhiễm bệnh và chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng ....................................................................................................................116 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trong điều kiện nhà màng .............................................................................................................................118 Bảng 3.27. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng ...........................122 Bảng 3.28. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng ....................................123
ix Bảng 3.29. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trồng ở đồng ruộng ......125 Bảng 3.30. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến tỷ lệ nhiễm bệnh và chỉ số bệnh thán thư (%) trên cây ớt trồng ở đồng ruộng ...130 Bảng 3.31. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ớt trồng ở đồng ruộng ......133
x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây ớt: hình thái (A) giống trồng (B) và tỷ lệ diện tích trồng (C) [1] ............ 5 Hình 1.2. Chu trình gây bệnh do nấm Colletotrichum spp. trên thực vật (A, B) và cây phân loại của nấm (C) [5] ........................................................................................ 8 Hình 1.3. Các giai đoạn lây nhiễm của nấm Colletotrichum trên ớt (A, B) [17] .......... 12 Hình 1.4. Cơ chế kháng bệnh nấm ở thực vật (A) và cơ chế kích kháng của chitin (B) [36]......................................................................................................................... 18 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan (DP > 50%) [42] ............................ 20 Hình 2.1. Sơ đồ thể hiện sự liên quan giữa các nội dung nghiên cứu của đề tài ........... 35 Hình 2.2. Kiểu nhà màng thông gió cố định sử dụng làm thí nghiệm .......................... 36 Các thí nghiệm trong nhà màng được tiến hành từ tháng 03 – 09/2017. Cây ớt được trồng trên bầu giá thể 70% mụn xơ dừa + 20% phân trùn quế + 10% tro trấu. .... 37 Hình 2.3. Mẫu trái và mẫu lá dùng để lây nhiễm các mẫu phân lập nấm Colletotrichum ............................................................................................................................... 43 Hình 2.4. Thang phân cấp bệnh trên trái và lá ớt (QCVN 01-160:2014/BNNPTNT) .. 44 Hình 2.5. Thí nghiệm khả năng kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum trong phòng thí nghiệm ......................................................................................... 55 Hình 3.1. Triệu chứng bệnh thán thư trên trái (A - C), trên lá (D) và trên thân (D) của cây ớt ngoài tự nhiên ............................................................................................. 61 Hình 3.4. Điện di sản phẩm khuếch đại PCR các mẫu phân lập Colletotrichum spp. .. 72 Hình 3.6. Phổ hồng ngoại (IR) và nhiễu xạ tia X (XRD) của các mẫu chitosan (a) và các phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) và 2,5 kDa (d) .................. 79 Hình 3.7. Nano silica chế tạo từ vỏ trấu: xử lý với nước (a), HCl 5% (b) và 10% (c) . 85 Hình 3.8. Hình chụp TEM (A, B); phân bố kích thước hạt đo bằng phương pháp tán xạ laser (C); và các giản đồ XRD (D) và EDX (E) hạt nano silica điều chế ............. 86 Hình 3.9. Sự phối trộn tạo gel tạo chế phẩm (A), khảo sát độ bền gel theo pH 5; 6,5; 7,5; 8,5 (D) thành phẩm pH 7,5 và 1% HEC (E). Các tính chất chế phẩm tạo thành như hình chụp TEM (G) và TEM pH 5 (H) và phổ FTIR ban đầu hạt nano silica (B) oligochitosan (C) khi phối trộn (F) và thành phẩm (I). ......................... 88
xi Hình 3.10. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến hoạt tính chitinase trong điều kiện phòng thí nghiệm ........................................... 95 Hình 3.11. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến hoạt tính β 1,3- glucanase trong điều kiện phòng thí nghiệm. ................................ 98 Hình 3.12. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến capsidiol trong phòng thí nghiệm. .......................................................................100 Hình 3.13. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến salicylic acid trong phòng thí nghiệm .................................................................102 Hình 3.14. Ảnh hưởng của oligochitosan, silica nano và oligochitosan-silica nano đến jasmonic acid trong điều kiện phòng thí nghiệm ................................................105
xii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)” đã được thực hiện từ 2014 đến 2018 tại Thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu (1) phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên; (2) tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt và (3) xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được. Đề tài gồm bốn nội dung được thực hiện tuần tự: (1) phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, sinh học phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư do nấm trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.); (2) hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano; (3) đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm của oligochitosan-silica nano tạo được và (4) đánh giá khả năng kích kháng đối với bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra của oligochitosan- silica nano trên cây ớt trồng trong điều kiện nhà màng và ngoài đồng. Đề tài đã phân lập và định danh được 20 mẫu nấm bệnh thán thư gây bệnh trên cây ớt dựa vào đặc điểm hình thái theo Sutton (1992) và kết quả phân tích DNA. Đa số các mẫu phân lập thuộc loài C. gloeosporioides và C. truncatum. Đã thu được các phân đoạn oligochitosan khối lượng phân tử nhỏ (7,7 kDa; 4,6 kDa và 2,5 kDa) và phân đoạn oligochitosan 4,6 kDa 0,5 - 1% có tác dụng kích kháng hiệu quả nhất. Điều chế thành công hạt nano silica (kích thước 30 nm) từ vỏ trấu; tạo thành công oligochitosan-silica nano bền ở pH 7,5 với chất làm đặc HEC 1%. Một số đặc trưng tính chất của vật liệu oligochitosan, nano silica và oligochitosan-silica nano đã được xii
xiii ghi nhận. Trong điều kiện nhà màng và ngoài ruộng sản xuất hiệu quả kích kháng nấm C. gloeosporioides và C. truncatum đạt tốt nhất khi phun oligochitosan 25 ppm hoặc nano silica 50 - 100 ppm hoặc oligochitosan-silica nano 50 ppm. Về tính mới của luận án: đề tài đã (1) hoàn thiện được quy trình sản xuất oligochitosan-silica nano có thể ứng dụng trong sản xuất trên quy mô công nghiệp: (a) tạo oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ (7,7 kDa, 4,6 kDa và 2,5 kDa) bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch 4% chitosan/0,5% H2O2 và dung dịch 2% chitosan/0,5% H2O2; (b) tạo vật liệu nano silica có độ tinh khiết cao bằng phương pháp thiêu kết vỏ trấu đã được xử lý loại bỏ thành phần khoáng và (c) tạo oligochitosan- silica nano bền ở pH gần trung tính (pH ~ 7,5); (2) ứng dụng oligochitosan-silica nano tạo được kích kháng bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum trên cây ớt chỉ thiên trồng tại Thành phố Hồ Chí Minh.
xiv SUMMARY The project of “Study to produce oligochitosan-silica nano and investigate the induced systemic resistance against anthracnose disease caused by Colletotrichum spp. on hot chilli (Capsicum frutescens L.)” was carried out from 2014 to 2018 at Ho Chi Minh City. The objectives of the study were: (1) identify the pathogenicity potential and classificate at species level of Colletotrichum spp. isolated from hot chilli in Vietnam; (2) produce stable oligochitosan-silica nano, which potentially highly induced effectively the systemic resistance against anthranose disease on hot chilli, based on the combination of low molecular weight chitosan with nano silica; and (3) detect the potential control the anthracnose disease caused by C. gloeosporioides and C. truncatum on hot chilli in vitro, greenhouse and opened-field conditions of oligochitosan-silica nano created. Four contents done sequentially were involved in the study: (1) isolate, investigate the pathogenicity potential of isolates and classificate at species level isolated fungus Colletotrichum spp. causing anthracnose disease on hot chilli (Capsicum frutescens L.) based on mophorlogy and molecular characteristics; (2) re- complete the technology to produce oligochitosan-silica nano; (3) evaluate the induced systemic resistance (ISR) potential against anthranose disease caused by C. gloeosporioides and C. truncatum on hot chilli in in vitro condition of oligochitosan- silica nano created; (4) investigate the induced systemic resistance (ISR) potential against anthranose disease caused by C. gloeosporioides and C. truncatum on hot chilli cultivated in greenhouse and opened-field conditions of oligochitosan-silica nano produced. Twenty fungus isolates causing anthranose disease on hot chilli were isolated and scientific classificated to species based on the mophorlogy characteristics according to Sutton (1992) and DNA analysis. Most of isolates belonged to C. gloeosporioides và C. truncatum. Low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and 2.5 kDa) were gained and high effective ISR potential was recorded from the oligochitosan 4.6 kDa 0.5 - 1%. Succesfully produced nano silica (size 30 nm) from
xv husk; succesfully created oligochitosan-silica nano, which stable at pH 7.5 when combined with HEC (1%). Some special characteristics of oligochitosan, nano silica and oligochitosan-silica nano were recorded. In greenhouse and opened-field conditions, the high efficiencies of ISR potential against C. gloeosporioides và C. truncatum were recorded when oligochitosan 25 ppm, nano silica 50 – 100 ppm and oligochitosan-silica nano 50 ppm sprayed. The scientific and practical significance: (1) the practical technologies for creating oligochitosan-silica nano in industry production were re-completed; (a) low molecular weight oligochitosan fragments (7.7 kDa; 4.6 kDa and 2.5 kDa) were created by irradiation method on to the solution of 4% chitosan/0.5% H2O2 and 2% chitosan/0.5% H2O2; (b) highly pure nano silica particles were produced by firing husk after treated to eliminate mineral components and (c) oligochitosan-silica nano stabling at pH ~ 7.5 was produces; (2) applying oligochitosan-silica created to induce the systemic resistance against the anthranose disease caused by C. gloeosporioides và C. truncatum on hot chilli cultivated at Ho Chi Minh City.
1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Ớt (Capsicum sp.) là cây gia vị trồng ở vùng nhiệt đới, được tiêu thụ trên khắp thế giới do có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, dịch bệnh do nấm, virus và vi khuẩn gây ra trên cây ớt là một vấn đề gây trở ngại lớn đến hiệu quả sản xuất. Trong các loại bệnh trên ớt, bệnh do nấm là trong các bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng và làm tổn thất từ 10 - 80% sản lượng ớt ở Việt Nam và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc. Các loại bệnh nấm thường gặp trên cây ớt là bệnh héo cây con (Rhizoctonia solani), bệnh thán thư (Colletotrichum spp.), bệnh mốc xám (Botrytis cinerea), bệnh héo vàng lá (Fusarium oxysporum), bệnh sương mai (Phythopthora capsici), trong đó bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra là bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với cây ớt. Bệnh thán thư trên cây ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra, nấm gây hại trên cả cành, lá, hoa và trái, có thể gây thiệt hại làm giảm năng suất 70 - 80%. Hiện nay, nhiều loại thuốc hóa học được sử dụng để phòng trừ các loại nấm gây hại cho cây trồng, tuy nhiên việc sử dụng với liều lượng cao trong thời gian dài đã làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, tạo điều kiện để nấm bệnh và các loài côn trùng có hại cho cây trồng trở nên kháng thuốc. Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm nông nghiệp và đất đã làm ô nhiễm nguồn nước ngầm, môi trường và gây tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và vật nuôi. Biện pháp trồng giống chống chịu bệnh bị hạn chế do năng suất và độ ổn định giống không cao. Biện pháp sinh học sử dụng chất kích kháng thực vật (elicitor) giúp kích hoạt các cơ chế đề kháng bệnh trong cây trồng là một xu hướng phát triển nông nghiệp xanh đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới với mục đích giảm thiểu tối đa việc sử dụng các hóa chất độc hại và sử dụng giống chuyển gen. Chitin và silic là hai nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên. Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan, oligochitosan (dẫn suất của chitin) cùng với silic và silica nano khi dùng riêng lẻ hoặc phối hợp có các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng
2 nấm và làm tăng khả năng chống chịu bệnh ở đa số các loài thực vật, giúp cây tiết ra một số enzyme, hoạt chất chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn gây bệnh; kích thích sự tăng trưởng và phát triển cây trồng [39]. Oligochitosan tạo được có khối lượng phân tử lớn từ 100 kDa đến 30 kDa theo công nghệ cũ dẫn đến khó điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất quy mô lớn. Vì vậy cần tạo được oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ bằng phương pháp chiếu xạ thích hợp ứng dụng trong nông nghiệp. Hoàn thiện quy trình sản xuất oligochitosan có thể ứng dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết, ổn định cao và dễ dàng điều chỉnh khối lượng phân tử trong sản xuất. Kết hợp được hai loại vật liệu có hiệu ứng kích kháng để chế tạo vật liệu lai ứng dụng trong nông nghiệp. Xuất phát từ các lý do trên đề tài ‘Nghiên cứu tạo oligochitosan-silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây hại cây ớt (Capsicum frutescens L.)’ đã được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh và định danh loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên; - Tạo được oligochitosan-silica nano trên cơ sở các phân đoạn chitosan có trọng lượng phân từ thấp với hạt nano silica có độ ổn định và hiệu quả kích kháng cao đối với bệnh thán thư trên ớt; - Xác định được khả năng kiểm soát bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides và C. truncatum gây ra trên cây ớt trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà màng và ngoài đồng ruộng của oligochitosan-silica nano tạo được. Nội dung nghiên cứu của luận án Luận án gồm các nội dung sau: - Nội dung 1: Phân lập, khảo sát khả năng gây bệnh của các mẫu phân lặp và định danh bằng hình thái, và đặc điểm phân tử loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt chỉ thiên (Capsicum frutescens L.).