Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:128

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn. Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng S. paucimobilis lựa chọn. Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ SPHINGOMONAS PAUCIMOBILIS ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ SPHINGOMONAS PAUCIMOBILIS ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm 2.TS. Trần Thị Mai Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự chân thành và biết ơn nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS. Trần Thị Mai - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian làm luận án; cảm ơn các Cô đã trang bị thêm cho em cách tiếp cận với các phương pháp khoa học để em tự tin hơn trên con đường phía trước. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền tải cho em thêm nhiều kiến thức chuyên môn sâu cũng như cho những góp ý quí báu trong quá trình học tập và hoàn thiện các nghiên cứu của luận án. Nhân dịp này, xin bày tỏ niềm tri ân tới Ban lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch và các bạn bè, đồng nghiệp, đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi yên tâm học tập và nghiên cứu. Lúc này đây, với tư cách là người con, người vợ và người mẹ, tôi muốn gửi thật nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm yêu thương vô bờ của tôi đến gia đình - nơi luôn là điểm tựa tinh thần vững chắc và tiếp sức cho tôi trong suốt sự nghiệp phấn đấu. Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2018 Nguyễn Thị Hồng Hà i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được tác giả khác công bố. Nghiên cứu của luận án có sự kế thừa của đề tài ĐT.04.13/CNSHCB - Bộ Công thương và đã được sự đồng ý của các thành viên trong nhóm nghiên cứu. Việc tham khảo nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn theo đúng yêu cầu. Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2018 GVHD 1 GVHD 2 Tác giả Nguyễn Thị Xuân Sâm Trần Thị Mai Nguyễn Thị Hồng Hà ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................................... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................................ 4 1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ............................................ 4 1.1.1. Cấu tạo .................................................................................................................... 4 1.1.2. Tính chất.................................................................................................................. 4 1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel ................................. 5 1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan .................................... 7 1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa................................................................. 7 1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan .............................................................................. 8 1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis .......... 9 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 11 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan .................................... 11 1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống ........................................................ 11 1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ............................................. 11 1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí .......................................... 14 1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan ......................... 15 1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men.......................................................... 18 1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................................................. 20 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL ..................... 21 1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây ......................................................... 21 1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm ..................................................................... 23 1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác ........................................................................ 25 1.4. VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN................................................................... 26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 29 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ .......................................................... 29 2.1.1. Chủng giống, nguyên liệu chuối ........................................................................... 29 2.1.2. Môi trường ............................................................................................................ 29 2.1.3. Hóa chất ................................................................................................................ 30 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................... 30 2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ......................................................................................... 31 iii
2.2.1. Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl ..................................................... 31 2.2.2. Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl (phổ MNR) ..................................... 32 2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của gellan ............................................................... 33 2.2.4. Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) của gellan khử acyl .................................... 34 2.2.5. Xác định độ bền gel của gellan khử acyl .............................................................. 35 2.2.6. Xác định khả năng tạo gel với các ion Ca+2 và Na+ .............................................. 35 2.2.7. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của gellan ................................................ 35 2.2.8. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn ........................................................................... 36 2.2.9. Xác định hàm lượng protein.............................................................................36 2.2.10. Xác định hàm lượng màu carotenoid................................................................36 2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................... 36 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 36 2.3.1. Nhân giống và điều kiện bảo quản giống .............................................................. 36 2.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4....................... 36 2.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 37 2.3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................................. 37 2.3.3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin ........................................................... 37 2.3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 37 2.3.4. Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan cho chủng S. paucimobilis GL12 .. 38 2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 40 2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 40 2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan ........................................................................... 40 2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 40 2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 40 2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 41 2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột ............................... 41 2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ........................................... 41 2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì ............................................................................. 42 2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản ................................................................................ 42 2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl ................................................................... 42 2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ......... 42 2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl .................................. 43 2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl ........................................... 43 2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ................................................................ 43 2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối …………… 43 2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan............................................... 44 2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan......................... 44 iv
2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng ............................................................ 47 2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa .......................... 48 2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch................. 48 2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ........... 48 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 50 3.1. LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO ............................. 50 3.1.1. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4................. 50 3.1.2. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12 ...................................................................................................... 53 3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ CHỦNG S. PAUCIMOBILIS GL12 ............................54 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan ......... 54 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ ......................................................................................... 54 3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin ..................................................... 55 3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 .................................................................. 56 3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan ............................. 57 3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 ..58 3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít ........................ 61 3.2.3.1. Xác định tốc độ khuấy ..................................................................................... 61 3.2.3.2. Xác định thời gian thu hồi gellan..................................................................... 62 3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men ........................................................... 63 3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối ............................................ 63 3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ ........................................... 65 3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan ........................................................................... 66 3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột ............................................................. 68 3.2.6. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan ................................... 70 3.2.6.1. Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm...................................... 70 3.2.6.2. Xác định điều kiện bảo quản ........................................................................... 72 3.2.7. Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12..............................74 3.3. CHUYỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KHỬ ACYL .................................................. 76 3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl ............................... 76 3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan ............................................ 76 3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl .................................. 78 3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol .................................................................... 80 3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl .................................................................. 81 3.3.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl ..................................................................... 82 3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .......................................... 83 3.4. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CÁC CHẾ PHẨM ................................................................... 85 3.4.1. Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis GL12 ........................... 85 3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan .................................................................................. 85 v
3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan ................................................................ 87 3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan ............. 88 3.4.2. Đánh giá chất lượng gellan khử acyl..................................................................... 90 3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl ................................................................... 90 3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90 3.5. THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL .................... 91 3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối .......................... 91 3.5.1.1. Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong công thức dung dịch tạo màng ... 91 3.5.1.2. Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn ............................. 93 3.5.1.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan ................................. 93 3.5.2. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa ............................ 97 3.5.2.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong công thức thạch .... 97 3.5.2.2. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch.................................................... 98 3.5.2.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch ................................... 100 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 102 4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................................. 102 4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 104 vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Chú thích ADN Axit deoxyribonucleic ADP Adenosine diphosphate AL/PE Màng nhôm PE Al-Foil Lá nhôm mỏng BOPP/PE Màng Biaxial Oriented Polypropylene PE Cp Centipoazo đơn vị tính độ nhớt CT Công thức ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm ĐĐA Mức độ deacyl ĐVTN Động vật thí nghiệm GFC Sắc ký lọc gel HDPE Polyethylene tỷ trọng cao MDPE Polyethylene tỷ trọng trung bình NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Ny/PE Màng nylon PE PE Polyethylene PET Polyethylene terephthalate PVDC Polyvinylidende chloride TSS Chất rắn hòa tan tổng số vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl ............................................ 5 Bảng 1.2. Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp gellan............................................................................................................. 17 Bảng 1.3. Đặc điểm và hiệu quả gellan ............................................................................... 24 Bảng 2.1. Đặc tính của gellan và gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn ............................ 30 Bảng 2.2. Thời gian và liều lượng H2O2 khảo sát ............................................................... 38 Bảng 2.3. Các yếu tố và các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12 .......................................................................... 38 Bảng 2.4. Ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 39 Bảng 2.5. Chỉ số màu chuẩn cho chuối ............................................................................... 44 Bảng 2.6. Tỷ lệ thành phần trong các công thức tạo dung dịch màng gellan ..................... 44 Bảng 2.7. Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan chuối ................................................................ 46 Bảng 2.8. Phiếu cho điểm của phép thử cảm quan.............................................................. 47 Bảng 2.9. Bảng điểm cảm quan của sản phẩm thạch dứa ................................................... 48 Bảng 2.10. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên trong hội đồng cảm quan ..................................................................................................... 49 Bảng 3.1. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12 ........................................................................................................... 53 Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 54 Bảng 3.3. Ảnh hưởng củ các xit min đến khả năng sinh tổng hợp gellan ..................... 56 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan ..... 57 Bảng 3.5. Kết quả ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S. pausimobilis GL12 ............................................................................................................... 59 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phư ng s i Anov của mô hình ............................................ 60 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn ................................................................................................................................ 64 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch tới khả năng loại protein khỏi dịch lên men 65 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu ............................................................................................................................... 67 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hiệu suất và chất lượng gellan thành phẩm .. 68 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hiệu suất thu hồi gellan ............................... 69 Bảng 3.12. Ảnh hưởng củ độ dày lớp vật liệu sấy đến hiệu suất thu hồi gellan ................ 70 Bảng 3.13. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 .................................................................................................................................... 70 viii
Bảng 3.14. Sự th y đổi độ ẩm và độ nhớt của gellan sau 06 tháng bảo quản .................... 72 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sản phẩm gellan ................ 73 Bảng 3.16. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gell n trước và sau khi bảo quản 06 tháng ............................................................................................................... 73 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan .................................... 78 Bảng 3.18. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl ................................................ 81 Bảng 3.19. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 ............................................................................................................... 82 Bảng 3.20. Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan khử cyl trước và sau khi bảo quản 06 tháng ................................................................................................... 82 Bảng 3.21. Kết quả phân tích chất lượng và ATTP của chế phẩm gellan ........................... 89 Bảng 3.22. Kết quả phân tích chất lượng của sản phẩm gellan khử acyl ........................... 91 Bảng 3.23. Ảnh hưởng củ hàm lượng gellan trong công thức tạo màng đến hiệu quả bảo quản chuối............................................................................................................................ 92 Bảng 3.24. Một số chỉ tiêu và đặc tính hóa lý của dung dịch tạo màng gellan ................... 93 Bảng 3.25. Ảnh hưởng củ màng b o đến các chỉ tiêu sinh lý của chuối trong quá trình bảo quản .............................................................................................................................. 94 Bảng 3.26. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan chuối sau 18 ngày bảo quản .............. 96 Bảng 3.27. Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp trong thành phần thạch........ 98 Bảng 3.28. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan thạch dứa có bổ sung gellan ................................ 99 Bảng 3.29. Chỉ tiêu ATTP và các tính chất cảm quan của thạch ...................................... 101 ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) ....................................... 4 Hình 1.2. C chế tạo gel của gellan ..................................................................................... 6 Hình 1.3. C chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation ................................................... 6 Hình 1.4. C chế sinh tổng hợp gellan .................................................................................. 9 Hình 1.5. Động học quá trình STH gellan từ chủng S. paucimobilis ATCC 31.461........... 10 Hình 1.6. S đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men ...................................................... 19 Hình 1.7. S đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan ................................................. 20 Hình 2.1. Khuẩn lạc của S. paucimobilis GL12 (A) và S. paucimobilis GL4 (B)................ 29 Hình 2.2. Đường chuẩn gellan ........................................................................................... 32 Hình 2.3. Đường chuẩn gellan khử acyl .............................................................................. 32 Hình 2.4. Phư ng pháp xác định độ nhớt thực .................................................................... 34 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các nguồn nit tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 50 Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4 ................................................................................................................. 51 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL4 ........................................................................................................ 52 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL4 ....................................................................................................... 52 Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 ......... 53 Hình 3.6. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 .................................................................................................... 55 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ -threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan ................. 56 Hình 3.8. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gell n của chủng S. paucimobilis GL12 .................................................................................................................................... 58 Hình 3.9. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng gellan ............... 60 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới khả năng tạo gellan ....................................... 62 Hình 3.11. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men sục khí .............................................................................................. 63 Hình 3.12. Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hiệu suất thu hồi gellan ......................... 65 Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/eth nol đến hiệu suất thu hồi gellan ........... 66 Hình 3.14. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại .................. 67 x
Hình 3.15. Qui trình công nghệ thu nhận gellan dạng bột từ chủng S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men 10 lít ......................................................................................... 75 Hình 3.16. Phổ IR của các mẫu gellan và gellan khử acyl .................................................. 77 Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gian de cyl đến độ deacyl của gellan ............................... 79 Hình 3.18. Phổ IR của gellan khử acyl ( phản ứng pH = 10 / 10 phút) .................................. 80 Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử cyl/eth nol đến hiệu suất thu hồi .......... 80 Hình 3.20. Kết tủa gellan khử acyl sau 1 lần kết tủa cồn .................................................... 81 Hình 3.21. Qui trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl .................................................... 84 Hình 3.22. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR hai chiều của mẫu gellan chuẩn.............. 86 Hình 3.23. So sánh phổ proton của gellan chuẩn và gellan từ S. paucimobilis GL12 ...... .87 Hình 3.24. Đồ thị biểu diễn mối tư ng qu n giữ độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan ....... 88 Hình 3.25. So sánh phổ proton của gellan khử acyl chuẩn và gellan khử acyl từ S. paucimobilis GL12 ............................................................................................................... 90 Hình 3.26. Sự biến đổi hàm lượng chất khô tổng số của chuối theo thời gian bảo quản ..... 96 Hình 3.27. Một số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan ....................................... 97 Hình 3.28. Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa......................................... 99 xi
MỞ ĐẦU Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel. So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả. Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao, tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch. Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng. Các công bố về quá trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung các thông tin về cải tạo chủng giống, điều kiện lên men, thu hồi nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng cho chế phẩm. Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được sử dụng để bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, tuy nhiên giá của chúng vẫn còn cao (khoảng 20-50 usd/kg tùy loại). Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của đề tài chúng tôi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao (18-20 g/lit dịch nuôi). Đề tài cũng đã bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng cần phải có các nghiên cứu cải tiến hơn nữa nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp gellan và hoàn thiện hơn các đánh giá về đặc tính, chất lượng cho các chế phẩm gellan, gellan khử acyl làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng chúng. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã được lựa chọn trong khuôn khổ của luận án này. 1
Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn. - Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng S. paucimobilis lựa chọn. - Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm. Nội dung nghiên cứu 1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao - Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 - So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12. 2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn - Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác - Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men10 lít - Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột - Nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm - Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn 3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis - Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl - Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl - Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl - Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl 4. Đánh giá chất lƣợng các chế phẩm gellan - Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis - Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl 5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl - Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối - Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa Những kết quả mới của luận án - Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập tại Việt Nam. Sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan có giá thành rẻ hơn thay thế cho nguồn trypton, kết hợp với việc bổ sung theo bậc H2O2 khắc phục độ nhớt dịch 2
lên men, cải thiện phương thức cấp ôxi đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp gellan và đạt 32,8 g/lít. - Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86% đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao. - Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ chủng S. paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. - Luận án đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với đối chứng chỉ đạt 9 ngày). Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định trong môi trường pH thấp (pH
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 1.1.1. Cấu tạo Gellan - một polysaccharit dị thể ngoại bào, được sản xuất bằng quá trình lên men bởi vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas paucimobilis. Cấu trúc phân tử của gellan là một polyme lặp lại của các đơn phân, mỗi đơn phân gồm bốn gốc đường: hai gốc glucose (Glc), một gốc acid glucurunic (GlcA) và một gốc rhamnose (Rha). Chúng liên kết với nhau bởi các liên kết glucozit theo trật tự: [3)-β-D- Glc-(14)-β-D-GlcA-(14)-β-D-Glc(14)-α-Rha-(1)]. Trong đó, ở gốc đường liên kết (1 3)-β-D-Glc- thường gắn thêm nhóm O-5-acetyl và O-2- glyceryl (hình 1.1-A). Trong phân tử của gellan khử acyl, nhóm acyl và glyceryl bị khử (hình 1.1- B) [68]. (A) (B) Hình 1.1. Cấu trúc hó học củ gellan (A) và gell n khử cyl (B) [68] 1.1.2. Tính chất Gellan thương mại được sử dụng dưới dạng bột màu trắng, không mùi, hơi ngọt, tan trong nước nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, aceton, ethanol…), dung dịch có độ nhớt cao, bền ở nhiệt độ sôi, ổn định ở phổ pH rộng (3,0 – 8,0). Gellan khử acyl có độ bền gel 300-800 g/cm2 còn gellan có khả năng giữ nước tốt. Gellan có khối 4
lượng phân tử khoảng 1 - 2 x 106 Da và gellan khử acyl có khối lượng phân tử khoảng 2 - 3 x 105 Da [38, 96]. Gellan có chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo nhũ tương, khả năng tương thích cao, giải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi trơn, chất tạo độ dày và huyền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel mong muốn trong các dạng sản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng [51, 15, 34]. Gellan và gellan khử acyl có những tính chất giống nhau. Điều khác nhau căn bản giữa hai loại gellan này là khả năng tạo gel. Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra những gel có tính chất khác nhau. Gellan tạo gel mềm, đàn hồi và thuận nghịch nhiệt. Sự khử các gốc acyl trong phân tử gellan sẽ tạo ra gellan khử acyl cho gel chắc, giòn. Phụ thuộc vào mức độ deacyl mà gellan khử acyl có độ deacyl hóa càng cao thì khối lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giòn càng tăng. Có thể tóm tắt sự khác nhau giữa hai loại gellan này về một số chỉ tiêu chính ở bảng 1.1.[15, 16, 29, 37, 65]. Bảng 1.1. Đặc điểm khác nh u giữ gell n và gell n khử cyl [15, 16, 29, 37, 65] Đặc điểm Chỉ tiêu Gellan Gellan khử acyl Khối lượng phân tử 1 - 2 x 106 Da 2 - 3 x 105 Da Nhiệt độ bắt đầu tạo gel 70~80oC 30~50oC Khả năng chịu nhiệt Ổn định nhiệt Ổn định nhiệt Ổn định pH 3-8 3 - 10 Khả năng hòa tan trong nước Tan trong nước ấm Tan trong nước lạnh hoặc nóng Cấu trúc gel Gel mềm và đàn hồi Gel cứng và giòn Độ nhớt 1% (Cp) Rất nhớt (+++) Độ nhớt giảm mạnh (+) 1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo gel Gellan Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan tồn tại trong dung dịch dưới dạng sợi cuộn ngẫu nhiên. Khi hạ nhiệt độ của dung dịch xuống, các sợi duỗi ra và xoắn với nhau tạo ra sợi kép. Các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên mạng lưới gel 3 chiều (hình 1.2). 5
Hình 1.2. C chế tạo gel củ gell n [7, 27] Gel gellan hình thành nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự có mặt của các cation. Khi nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan hình thành những vòng xoắn có trật tự, còn ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccarit dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của dung dịch. Nhờ tính chất này, gellan sẽ được tách khỏi tế bào vi khuẩn khi xử lý ở nhiệt độ cao. Nhiệt độ dưới 30 - 35oC, cấu trúc của dung dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình thành gel. Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới không gian ba chiều bằng cách tạo phức với các cation và liên kết hydro với nước. Việc bổ sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh làm tăng số cầu muối tại các mối nối, nên đã cải thiện được tính chất tạo gel của gellan (hình 1.3). Các cation như Na, K, Ca và Mg thúc đẩy sự tạo gel của gellan. Cation tetramethylammonium (TMA) lại kìm hãm sự tạo gel. Gel hình thành bởi các ion hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ mạnh hơn so với các ion hóa trị 1như Na+ và K+. Nồng độ bổ sung cho sự tạo gel gellan với catrion hóa trị 1 thường là 100 mM còn với cation hóa trị 2 là 5 mM. Sự bổ sung các cation thúc đẩy quá trình tạo gel sẽ dẫn đến sự tinh thể hóa những sợi này và hình thành gel bền [27, 36, 45]. Hình 1.3. C chế tạo gel củ gell n khi có mặt các c tion [7, 27] 6
Nhóm thế acyl có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của gel gellan. Các nhóm acetyl và glyceryl cồng kềnh ngăn chặn liên kết chặt chẽ giữa các chuỗi polymer gellan trong dạng xoắn lớn và cản trở cuộn lại của chuỗi xoắn kép. Vì vậy, gel của loại gôm này có tính mềm dẻo và đàn hồi. Gellan khử acyl Gellan khử acyl có thể tạo gel mà không cần có các ion trên khi ở pH < 3.0. Trong môi trường acid (pH 2.8 – 3.0) gel bền, trạng thái này cũng không bị ảnh hưởng bởi nồng độ đường hay nồng độ ion. Bằng thực nghiệm cho thấy, gel trong acid sẽ chắc hơn gel trong nước có bổ sung đường. Gel trong acid sẽ giảm độ chắc nếu có cho thêm các ion. Nhiều trường hợp thì không cần bổ sung ion vì trong nước và các thành phần khác đã có đủ lượng ion cần thiết cho việc tạo gel. Nhiệt độ tạo gel là nhiệt độ bắt đầu có sự tạo gel. Quá trình tạo gel của gellan khử acyl diễn ra nhanh khi nhiệt độ vừa đạt tới nhiệt độ tạo gel. Nhiệt độ nóng chảy gel và nhiệt độ tạo gel sẽ càng tăng khi nồng độ các ion tăng. Với loại gel này, trong đa số trường hợp gel sẽ không có tính thuận nghịch về nhiệt và nó sẽ nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bắt đầu tạo gel. Gellan khử acyl hình thành gel vững chắc, giòn và hồi biến nhiệt vì sự vắng mặt của các nhóm acetyl và glyceryl. Gellan khử acyl có thể tạo gel ở nồng độ thấp khoảng 0.05%, gel tạo ra sẽ cứng và không bị tách lỏng nếu không cắt hoặc phá hủy gel. Tóm lại, gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra gel có tính chất khác nhau. Gellan tự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi còn gellan khử acyl cho ra gel chắc, giòn. Tùy thuộc vào cấu trúc và tính chất của mỗi loại gellan mà chúng sẽ được ứng dụng cho các mục đích khác nh u. Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá cấu trúc và các đặc tính công nghệ cho mỗi loại gellan mới sinh tổng hợp là công việc cần thiết của các nghiên cứu thu nhận nguồn chế phẩm này. 1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan 1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Năm 1993, Takeuchi và cộng sự đã chỉ ra Sphingomonas được chia thành 4 chi: Sphingomonassensu stricto, Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [77, 78]. Các khảo sát đã cho thấy hầu hết các chủng Sphingomonas paucimobilis đều có khả năng sản xuất gellan và chỉ có chủng vi khuẩn này mới có khả năng sinh tổng hợp gellan [15]. Sphingomonas sp. là vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-0,8 x 1,0-2,7 µm, khuẩn lạc có màu vàng, màu cam hoặc màu trắng không bào tử, bề mặt khuẩn lạc có dạng nhầy, phản ứng oxidase dương tính, dị dưỡng, hiếu khí hoàn toàn và sinh sắc tố vàng. 7