Luận án Tiến sĩ Dược học: Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol sử dụng trong kiểm nghiệm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:333

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Dược học "Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol sử dụng trong kiểm nghiệm" trình bày các nội dung chính sau: Tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm; Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia; Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Dược học: Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol sử dụng trong kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LỮ THIỆN PHÚC TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU CỦA ALLOPURINOL SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LỮ THIỆN PHÚC TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP TẠP CHẤT ĐỐI CHIẾU CỦA ALLOPURINOL SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62720410 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. TRƯƠNG NGỌC TUYỀN PGS.TS. TRẦN VIỆT HÙNG TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2024
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy, Cô thuộc Đại học Y Dược TP.HCM; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và thu thập số liệu. Tôi cũng xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến Thầy, Cô, anh, chị và các bạn đồng nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Xin gởi lời cám ơn đến gia đình luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi. Tôi cũng xin phép tỏ lòng biết ơn PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền, PGS.TS. Trần Việt Hùng đã tận tâm hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2024 Tác giả Lữ Thiện Phúc
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi tên là Lữ Thiện Phúc, là Nghiên cứu sinh ngành kiểm nghiệm thuốc – Độc chất, khóa 2017 – 2020, xin cam đoan: (1) Luận án là do chính bản thân tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền; PGS.TS. Trần Việt Hùng (2) Các tài liệu tham khảo được tôi xem xét, chọn lọc kỹ lưỡng, trích dẫn và liệt kê tài liệu tham khảo đầy đủ; (3) Kết quả trình bày trong luận án được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của bản thân tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ đề tài cùng cấp nào khác. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2024 Người hướng dẫn Tác giả thực hiện PGS. TS. Trương Ngọc Tuyền PGS. TS. Trần Việt Hùng Lữ Thiện Phúc
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT ...........................v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ............................................................................................... xi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... xiii ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Tổng quan về allopurinol và tạp chất liên quan ...............................................3 1.2. Kiểm nghiệm tạp chất allopurinol theo Dược điển tham chiếu và các công trình nghiên cứu .............................................................................................................15 1.3. Một số phương pháp xác định độ tinh khiết ...................................................22 1.4. Chất chuẩn đối chiếu ......................................................................................29 1.5. Tổng quan về thẩm định quy trình theo ICH Q2(R2) và phương pháp LC- MS/MS trong định lượng tạp chất liên quan .........................................................35 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................41 2.1. Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................41 2.2. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................42 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................42 2.4. Cỡ mẫu của nghiên cứu ..................................................................................42 2.5. Xác định các biến số độc lập và biến phụ thuộc ............................................42 2.6. Phương pháp và công cụ đo lường thu thập số liệu .......................................43 2.7. Quy trình thu thập và cách phân tích số liệu ..................................................45 2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu .......................................................................63 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................64 3.1. Tổng hợp và tinh chế tạp chất liên quan của allopurinol ...............................64
iv 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol .............82 3.3. Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS .......................................................100 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .....................................................................................109 4.1. Bàn luận về quy trình tổng hợp và tinh chế 6 tạp của allopurinol ...............109 4.2. Bàn luận về xây dựng và đánh giá tạp chất đối chiếu của allopurinol .........135 4.3. Bàn luận về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng LC-MS/MS ....................................142 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................149 5.1. Về tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm .................................................................................................149 5.2. Về thiết lập tạp chuẩn A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia .............................................................................................................................149 5.3. Về xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS ............................150 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Chữ viết tắt Từ nguyên Nghĩa ACN Acetonitrile Acetonitril ADN Acid Deoxyribonucleic Vật liệu di truyền ASEAN Association of South East Hiệp hội các Quốc gia Đông Nam Asian Nations Á ACRS ASEAN Chemical Reference Chất chuẩn đối chiếu ASEAN Standard BP British Pharmacopoeia Dược điển Anh CCĐC Chất chuẩn đối chiếu Chất chuẩn đối chiếu CĐC Chất đối chiếu Chất đối chiếu CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản CTPT Công thức phân tử Công thức phân tử DAD Detector Diod Array Đầu dò dãy diod quang DĐVN Dược điển Việt Nam Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DSC Differential scanning Phân tích nhiệt quét vi sai calorimetry EDQM European Directorate for the Hội đồng châu Âu về chất lượng Quality of Medicines and thuốc và chăm sóc sức khỏe HealthCare EEMCA Ethyl-(ethoxymethylen) Ethyl-(ethoxymethylen) cyanoacetat cyanoacetat FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ GC Gas chromatography Sắc ký khí GLP Good Laboratory Practice Thực hành tốt phòng thí nghiệm GMP Good Manufacturing Practice Thực hành tốt sản xuất thuốc
vi GPP Good Pharmacy Practice Thực hành tốt quản lý nhà thuốc GTAĐ Giá trị ấn định Giá trị ấn định LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HRMS High Resolution Mass Khối phổ phân giải cao Spectrometry ICH International Conference on Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa Harmonization các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người ICRS International Chemical Chất chuẩn quốc tế Reference Substances IR Infrared red Hồng ngoại ISO International Organization for Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế Standardization NT Nguyên trạng Nguyên trạng MRM Multiple Reaction Monitoring Chế độ quét kiểm tra đa phản ứng MS Mass spectrometry Khối phổ NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PCRS Primary chemical reference Chất chuẩn đối chiếu hóa học gốc standard PL Phụ lục Phụ lục PPPT Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích PTN Phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm Rf Retention factor Hệ số di chuyển Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối
vii SIM Selected Ion Monitoring Chế độ quét ion chọn lọc SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng SRM Selected Reaction Monitoring Chế độ quét chọn lọc phản ứng ion US United States Hợp chủng quốc Hoa Kỳ UPLC Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Chromatography USP United States Pharmacopoeia Dược điển Hoa Kỳ UV Ultraviolet Tia tử ngoại WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Giới hạn các tạp allopurinol theo DĐVN V; BP 2023; USP-NF 2023...15 Bảng 1. 2. Bảng tổng hợp các quy trình định lượng tạp chất liên quan allopurinol trong nguyên liệu .......................................................................................................16 Bảng 1. 3. Bảng tổng hợp các quy trình định lượng tạp chất liên quan allopurinol trong thành phẩm.......................................................................................................20 Bảng 1. 4. Quy định xác định độ tinh khiết ..............................................................25 Bảng 1. 5. Các quy trình phân tích và các chỉ tiêu liên quan cho đặc điểm từng quy trình phân tích ...........................................................................................................36 Bảng 1. 6. Các tiêu chí thẩm định quy trình phân tích tạp trong nguyên liệu và thành phẩm theo hướng dẫn Q2(R2) của ICH ....................................................................37 Bảng 2. 1. Một số nguyên liệu, chất chuẩn dùng trong nghiên cứu .........................43 Bảng 2. 2. Một số dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu..................................43 Bảng 2. 3. Một số trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ...........................................44 Bảng 2. 4. Các thông số khối phổ cần khảo sát quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng LC-MS/MS ....................................................................................60 Bảng 2. 5. Điều kiện sắc ký cần khảo sát quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurniol bằng LC-MS/MS ....................................................................................60 Bảng 2. 6. Nồng độ các tạp và allopurinol trong tuyến tính .....................................61 Bảng 3. 1. Tóm tắt điều kiện sắc ký các quy trình định lượng các tạp allopurinol bằng phương pháp HPLC-DAD ........................................................................................83 Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n = 6) ...............................84 Bảng 3. 3. Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của các quy trình định lượng các tạp chất .............................................................................................91 Bảng 3. 4. Kết quả xác định hàm lượng (%) tính theo chế phẩm nguyên trạng của các tạp chất allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..........................92
ix Bảng 3. 5. Kết quả đánh giá chất lượng tạp A allopurinol .......................................92 Bảng 3. 6. Kết quả đánh giá chất lượng tạp B allopurinol .......................................93 Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá chất lượng tạp C allopurinol .......................................94 Bảng 3. 8. Kết quả đánh giá chất lượng tạp D allopurinol .......................................94 Bảng 3. 9. Kết quả đánh giá chất lượng tạp E allopurinol........................................95 Bảng 3. 10. Kết quả đánh giá chất lượng tạp F allopurinol ......................................96 Bảng 3. 11. Khối lượng chất khảo sát đóng trong 1 lọ và số lọ đóng được .............96 Bảng 3. 12. Kết quả đánh giá đồng nhất lọ sau khi đóng gói ...................................97 Bảng 3. 13. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp A allopurinol (n = 18) .......97 Bảng 3. 14. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp B allopurinol (n = 18) .......98 Bảng 3. 15. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp C allopurinol (n = 18) .......98 Bảng 3. 16. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp D allopurinol (n = 18) .......98 Bảng 3. 17. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp E allopurinol (n = 18) .......99 Bảng 3. 18. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng tạp F allopurinol (n = 18) ........99 Bảng 3. 19. Tóm tắt kết quả xác định giá trị ấn định và công bố các tạp đối chiếu .................................................................................................................................100 Bảng 3. 20. Tóm tắt kết quả đánh giá các tạp allopurinol tổng hợp .......................100 Bảng 3. 21. Điều kiện khối phổ tối ưu quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phương pháp LC/MS/MS ...............................................................................101 Bảng 3. 22. Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (n = 6) .102 Bảng 3. 23. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử ........................102 Bảng 3. 24. Phương trình tuyến tính của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS ............................................................104 Bảng 3. 25. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các tạp allopurinol ...........104 Bảng 3. 26. Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong mẫu giả lập nguyên liệu allopurinol .....................................105
x Bảng 3. 27. Kết quả độ chính xác và độ chính xác trung gian của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong mẫu giả lập thành phẩm allopurinol .....................................106 Bảng 3. 28. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng đồng thời 6 tạp trong nền mẫu giả lập thành phẩm và giả lập nguyên liệu allopurinol ...........................................107 Bảng 3. 29. Kết quả định lượng tạp trong các mẫu nguyên liệu và thành phẩm allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS ............................................................108 Bảng 4. 1. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn .....................................................................................................111 Bảng 4. 2. Dữ liệu phổ NMR sản phẩm tổng hợp so với phổ tạp B allopurinol chuẩn .................................................................................................................................117 Bảng 4. 3. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp C allopurinol chuẩn .................................................................................................................................122 Bảng 4. 4. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp D allopurinol chuẩn .................................................................................................................................126 Bảng 4. 5. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp E allopurinol chuẩn .................................................................................................................................130 Bảng 4. 6. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp so với tạp F allopurinol chuẩn theo tài liệu tham khảo ............................................................................................134 Bảng 4. 7. Bảng so sánh Lenene - Test ..................................................................141
xi DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. 1. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Roland K. Robin.............................3 Sơ đồ 1. 2. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Jean Druey ......................................4 Sơ đồ 1. 3. Nguồn gốc phát sinh tạp A của allopurinol ..............................................6 Sơ đồ 1. 4. Quy trình tổng hợp tạp A theo Roland K. Robins ....................................6 Sơ đồ 1. 5. Quy trình tổng hợp tạp A theo Ronald M. Cresswell ...............................6 Sơ đồ 1. 6. Quy trình tổng hợp tạp A..........................................................................7 Sơ đồ 1. 7. Nguồn gốc phát sinh tạp B allopurinol .....................................................8 Sơ đồ 1. 8. Nguồn gốc phát sinh tạp C allopurinol .....................................................9 Sơ đồ 1. 9. Nguồn gốc phát sinh tạp D allopurinol ..................................................10 Sơ đồ 1. 10. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol ...................................................11 Sơ đồ 1. 11. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol theo Sindhu Jose .......................11 Sơ đồ 1. 12. Nguồn gốc phát sinh tạp E ...................................................................12 Sơ đồ 1. 13. Nguồn gốc phát sinh tạp F ....................................................................13 Sơ đồ 2. 1. Phân hủy allopurinol bằng NaHCO3 ......................................................45 Sơ đồ 2. 2. Phân hủy allopurinol bằng NH3 ..............................................................46 Sơ đồ 2. 3. Phân hủy allopurinol bằng NaOH ..........................................................46 Sơ đồ 2. 4. Quy trình phản ứng tổng hợp tạp B ........................................................47 Sơ đồ 2. 5. Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân 1,2-diformylhydrazin ......................47 Sơ đồ 2. 6. Sơ đồ tổng hợp tạp C với tác nhân acid formic và hydrazin ..................47 Sơ đồ 2. 7. Sơ đồ tổng hợp tạp D allopurinol ...........................................................48 Sơ đồ 2. 8. Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và triethyl orthoformat ........48 Sơ đồ 2. 9. Sơ đồ tổng hợp tạp E từ tạp D allopurinol và acid formic .....................49 Sơ đồ 2. 10. Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và triethylorthoformat .......49 Sơ đồ 2. 11. Sơ đồ tổng hợp tạp F từ tạp D allopurinol và hydrazin hydrat 50% ....49
xii Sơ đồ 3. 1. Quy trình tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat ...................................67 Sơ đồ 3. 2. Quy trình tổng hợp tạp B allopurinol .....................................................70 Sơ đồ 3. 3. Quy trình tổng hợp tạp C allopurinol .....................................................73 Sơ đồ 3. 4. Quy trình tổng hợp tạp D allopurinol ....................................................76 Sơ đồ 3. 5. Quy trình tổng hợp tạp E allopurinol .....................................................79 Sơ đồ 3. 6. Quy trình tổng hợp tạp F allopurinol ......................................................81 Sơ đồ 4. 1. Sự phân mảnh của tạp A allopurinol ....................................................111 Sơ đồ 4. 2. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp B allopurinol .......................................115 Sơ đồ 4. 3. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp C allopurinol .......................................121 Sơ đồ 4. 4. Cơ chế phản ứng đóng vòng tạp D allopurinol ....................................125 Sơ đồ 4. 5. Cơ chế phản ứng Wolff-Kisser tạo nhóm hydrazid..............................127 Sơ đồ 4. 6. Phương trình minh họa 2 giai đoạn của phản ứng tổng hợp tạp E .......128 Sơ đồ 4. 7. Cơ chế đề nghị phản ứng tổng hợp tạp E từ tạp D và triethyl orthoformat .................................................................................................................................129 Sơ đồ 4. 8. Cơ chế đề nghị phản ứng tổng hợp tạp E từ tạp D và acid formic .......129 Sơ đồ 4. 9. Cơ chế tự phản ứng tạo ra tạp F ...........................................................133
xiii DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Sơ đồ khối của máy phân tích nhiệt vi sai ...............................................23 Hình 1. 2. Sơ đồ cấu tạo hệ thống LC-MS/MS .............................................................39 Hình 1. 3. Chế độ quét phổ MRM trong LC/MS-MS ..............................................40 Hình 2. 1. Trình tự các nội dung nghiên cứu............................................................41 Hình 3. 1. Phổ MS dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp F theo phương pháp 1 .........79 Hình 3. 2. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, mẫu thử tạp A allopurinol, hỗn hợp chuẩn tạp A và allopurinol, allopurinol nguyên liệu ở bước sóng 220 nm .........................85 Hình 3. 3. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp A allopurinol ........................85 Hình 3. 4. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tạp B allopurinol, mẫu thử tạp A allopurinol; hỗn hợp chuẩn tạp B và tạp A allopurinol ở bước sóng 220 nm ..............................86 Hình 3. 5. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp B allopurinol ........................86 Hình 3. 6. Sắc ký đồ dung môi pha động, allopurinol chuẩn, tạp C allopurinol phân hủy, tạp B allopurinol chuẩn, tạp A allopurinol nguyên liệu, hỗn hợp chuẩn tạp A, B, C allopurinol chế độ UV 200 nm ..............................................................................87 Hình 3. 7. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp C allopurinol ........................87 Hình 3. 8. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp D allopurinol ...................88 Hình 3. 9. Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp D allopurinol .......................................88 Hình 3. 10. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp D allopurinol ......................88 Hình 3. 11. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu định lượng tạp E allopurinol ..................89 Hình 3. 12. Sắc ký đồ sản phẩm tinh chế tạp E allopurinol .....................................89 Hình 3. 13. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp E allopurinol .......................89 Hình 3. 14. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp D, nguyên liệu tổng hợp; tạp F thử và hỗn hợp chuẩn tạp F. ............................................................90 Hình 3. 15. Sắc ký đồ 3 chiều và độ tinh khiết pic tạp F allopurinol .......................90
xiv Hình 3. 16. Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, hỗn hợp chuẩn tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol ................................................................................103 Hình 4. 1. Cơ chế phản ứng tổng hợp tạp A allopurinol hemisulfat ......................110 Hình 4. 2. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp A allopurinol hemisulfat chuẩn .......110 Hình 4. 3. Kết tủa trắng BaSO4 trong phản ứng gốc muối hemisulfat của tạp A allopurinol ...............................................................................................................112 Hình 4. 4. Sản phẩm tạp A tạo thành khi dư NaOH ...............................................113 Hình 4. 5. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp B allopurinol chuẩn .........................116 Hình 4. 6. Định tính nhanh dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp C bằng khối phổ ...119 Hình 4. 7. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp C allopurinol chuẩn .........................121 Hình 4. 8. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và phổ chuẩn tạp D allopurinol..................125 Hình 4. 9. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp E allopurinol chuẩn .........................129 Hình 4. 10. Phổ IR sản phẩm tổng hợp và tạp F allopurinol chuẩn .......................133 Hình 4. 11. Phân mảnh ion định lượng của 6 tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol .143
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp dược trên thế giới, ngành dược Việt Nam cũng đã phát triển và khẳng định được vị thế của mình. Trên cả nước, với hơn 280 nhà máy sản xuất dược phẩm đạt GMP-WHO, GMP-EU sản xuất các thành phẩm, đa phần là thuốc generic, trong đó phổ biến nhất là nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gút, thuốc kháng sinh, thuốc điều trị đái tháo đường và thuốc tim mạch.1 Trong các nhóm thuốc điều trị bệnh gút mạn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã được Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu năm 2018 và được chỉ định thường quy trong điều trị bệnh gút và tăng uric huyết thứ phát do hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư.2,3 Do đó allopurinol là một trong các thuốc được sản xuất bởi nhiều công ty dược phẩm trong nước như Dược Hậu Giang, Domesco, Stella, Pharmedic, Agimexpharm... Tuy nhiên kiểm tra tạp liên quan allopurinol gặp nhiều khó khăn do hệ thống kiểm nghiệm trong nước chưa cung cấp chuẩn tạp đầy đủ.4-6 Hiện nay, ngành công nghiệp dược nước ta vẫn còn phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol được nhập khẩu từ các công ty nước ngoài. Do đó, việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành cần được đặt lên hàng đầu, nhằm đảm bảo chất lượng các chế phẩm nội địa cũng như kiểm soát chất lượng các chế phẩm ngoại nhập từ hoạt chất allopurinol. Trong quá trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản, allopurinol vẫn còn tồn tại hoặc phát sinh các tạp chất liên quan có khả năng gây độc tính hoặc đột biến gen, ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc đối với bệnh nhân.7 Các nghiên cứu đã cho thấy tạp A và tạp D của allopurinol là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp. Tạp A và tạp B cũng là sản phẩm phân hủy của allopurinol khi gặp tác nhân kiềm hóa.8-12 Tạp C, E, F (theo USP Standard 2023) là các sản phẩm phụ được tạo thành từ sản phẩm trung gian với các chất tham gia phản ứng.13 Các tạp A, B, C, D, E, F đã được chứng minh có khả năng gây độc tính trên da và hội chứng Steven Johnson do tác dụng lên gen HLA-B*5801, trong đó tạp F allopurinol nằm trong nhóm cấu trúc có khả năng gây đột biến gen và ung thư.7,14
2 Hiện nay, các chuyên luận của các dược điển tham chiếu và DĐVN V, đều yêu cầu kiểm tra tạp chất liên quan allopurinol là một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm nguyên liệu và thành phẩm allopurinol. Dược điển Anh (BP 2023) bắt buộc kiểm tra tạp A, B, C, D, E cả trong nguyên liệu và thành phẩm allopurinol. DĐVN V và USP NF-2023 không yêu cầu kiểm tra tạp chất trong thành phẩm nhưng bắt buộc kiểm tra tạp A, B, C, D, E, F và hydrazin trong nguyên liệu allopurinol như đầu vào của quá trình đăng ký, sản xuất.15-17 Trong khi đó, các tạp chuẩn này đang được bán với giá rất đắt, phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá bán trung bình mỗi tạp là 2500 USD/100 mg (USP standard 2023) và một số tạp lại không sẵn có như tạp F.18,19 Vì thế gây không ít khó khăn cho công tác kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm chứa allopurinol. Trên thế giới hiện có một số công trình nghiên cứu liên quan đến tạp chất của allopurinol,8,9,13,18,20-22 nhưng chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về thiết lập tạp chuẩn, cũng như quy trình định lượng đồng thời các tạp chất liên quan trong thành phẩm bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ 2 lần. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình tổng hợp các tạp liên quan allopurinol.23-56 Mục tiêu của đề tài là: 1. Tổng hợp 6 tạp chất liên quan của allopurinol A, B, C, D, E, F ở quy mô phòng thí nghiệm. 2. Xây dựng tiêu chuẩn và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol A, B, C, D, E, F đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia. 3. Xây dựng, thẩm định và ứng dụng quy trình định lượng đồng thời 6 tạp A, B, C, D, E, F của allopurinol bằng phương pháp LC-MS/MS.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về allopurinol và tạp chất liên quan 1.1.1. Tổng quan về allopurinol Tên quốc tế: allopurinol, allopurinolum. Tên hóa học: 1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-on. Công thức phân tử: C5H4N4O. CAS: 315-30-0 Khối lượng mol: 136,11 g/mol15 Công thức cấu tạo: Allopurinol được tổng hợp lần đầu bởi Roland K. Robins năm 1956, từ phản ứng malononitril với triethyl orthoformat.11 NC NC NC NH2NH2 CH2 + HC(OC 2H5)3 OEt NH NC CN N H 2N malononitril trietylorthoformat H2O O O H2N NH2 HN H2N-CHO N N N N N H H allopurinol Sơ đồ 1. 1. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Roland K. Robin “Nguồn: Roland K. Robin, 1956”11 Năm 1959, Jean Druey và cộng sự đã tổng hợp allopurinol từ ethyl cyanoacetat và triethyl orthoformat với số bước phản ứng ít hơn so với Rolan K. Robins.8
4 Sơ đồ 1. 2. Quy trình tổng hợp allopurinol theo Jean Druey “Nguồn: Jean Druey và cộng sự, 1959”8 Tính chất vật lý Bột trắng hay gần như trắng.15,18 Nhiệt độ nóng chảy: 350 oC.15,18 Độ tan: rất khó tan trong nước và trong ethanol 96%, tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng, dễ tan trong DMSO (4 mg/ml), kém tan trong n-octanol.15,18 Tính chất hoá học Allopurinol có pKa = 10,2; có thể bị phân hủy một phần trong môi trường acid và kém bền trong môi trường kiềm tạo 3-aminopyrazol-4-carboxamid. Ở môi trường kiềm sản phẩm tiếp tục bị phân hủy thành acid 3-aminopyrazol-4-carboxylic và 3- aminopyrazol.15,17,18,44 Tính chất dược lý Cơ chế tác dụng Allopurinol có cấu trúc tương tự hypoxanthin, tác dụng ức chế enzym xanthin oxydase, là enzym có vai trò chuyển hóa các tiền chất hypoxanthin thành acid uric. Vì thế, allopurinol làm giảm nồng độ acid uric trong máu. Acid uric huyết tăng cũng có thể gây bệnh thận và sỏi thận. Do vậy, allopurinol được dùng để ngăn ngừa sỏi thận do acid uric và ngăn ngừa cơn viêm khớp gút cấp3. Thuốc ức chế xanthin oxydase, bắt đầu làm giảm sản xuất acid uric trong 2 - 3 ngày, acid uric máu trở lại bình thường trong vòng 1 - 3 tuần3. Chỉ định: dự phòng gút và tăng acid uric máu. Chống chỉ định: gút cấp; nếu có đợt cấp xảy ra trong khi đang dùng allopurinol, vẫn tiếp tục dự phòng và điều trị đợt cấp riêng lẻ.