Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:190

Thêm vào BST

Báo xấu

92
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án tập trung nghiên những nội dung chủ yếu sau: Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ quả thể nấm; đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm của các chất đã phân lập; tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm.... Mời bạn đọc tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------- TRẦN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes) NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, 2015 i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Tiếng việt AST Serum aspartat transaminase ALT Serum alanin transaminase ATCC American Type Culture Ngân hàng chủng giống Mỹ Collection BC Bạch cầu BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy carbon 13 CC Column Chromatography Sắc kí cột CCT Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng COSY Correlation Spectroscopy Phổ COSY CS% Cell survival % % tế bào sống sót DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DEAE- cellulose Diethylaminoethyl cellulose DMSO Dimethyl sulfoxid Dimetyl sulfoxit EAC Ehrlich ascites Carcinoma Ung thư cổ trướng ECACC The European Collection of Cell Ngân hàng chủng giống châu Cultures Âu ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù Spectra điện tử EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat FBS Foetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò Fl Human cervical uterine carcinoma Tế bào Ung thư tử cung GC Gas Chromatography Sắc kí khí ii
γGT Serum gamma glutanin transaminase Hb Haemoglobin HC Hồng cầu Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton HPLC High Performance liquid Sắc kí lỏng cao áp hiệu năng Chromatography cao HSQC Heteronuclear single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua Conherence một liên kết IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% KLT Khối lượng tạng KN Kháng nguyên LD50 lethal dose 50% Liều gây chết 50% động vật thực nghiệm Lu Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư biểu mô phổi MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NC Nghiên cứu OD Optical Density Mật độ quang OVA Ovalbumin Albumin lòng trắng trứng PBS Phosphat buffer saline Dung dịch đệm phosphat RD Human Rhabdomyosarcoma Ung thư mô liên kết SC% % scavenging capacity % khả năng trung hòa gốc tự do SGMD Suy giảm miễn dịch SRB Sulforhodamine B TCA Trichloacetic acid Axit tricloaxetic TCCS Tiêu chuẩn cơ sở iii
TCL Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TL (g) Trọng lượng (gam) TLCT Trọng lượng cơ thể TNFα Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử ung thư VSV Vi sinh vật WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới iv
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .............................................. ii DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ......................................................................... xiii MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc ............................................ 3 1.1.1. Giới thiệu về nấm dược liệu........................................................................ 3 1.1.2. Ứng dụng trong y học dân tộc..................................................................... 4 1.2. Những nghiên cứu trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học của nấm dược liệu .................................................................................................................. 6 1.2.1. Các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ............................................................ 6 1.2.1.2. Các chất có hoạt tính sinh học khác ......................................................... 11 1.2.2. Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu ......................................... 19 1.3. Tình hình nghiên cứu về nấm hầu thủ và nấm hương ................................... 30 1.3.1. Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) .......................................................... 30 1.3.1.1. Trên thế giới ........................................................................................... 30 1.3.1.2. Ở Việt Nam ............................................................................................ 34 1.3.2. Nấm hương (Lentinus edodes). ................................................................. 35 1.3.2.1. Trên thế giới ........................................................................................... 36 1.3.2.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 40 1.4. Mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ba chiều (3D) trong nghiên cứu ung thư ... 41 CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 44 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 44 2.1.1. Nấm hương................................................................................................ 44 2.1.2. Nấm hầu thủ .............................................................................................. 44 2.2. Dụng cụ, hóa chất và môi trường .................................................................. 44 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 44 2.2.2. Môi trường ................................................................................................ 44 2.3. Các phương pháp phân lập các hợp chất ....................................................... 45 v
2.4. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ ................... 46 2.4.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương.................................... 46 2.4.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ .................................. 46 2.5. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học .................................................. 46 2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide ......................................... 46 2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng -1,3-glucanase...................................................................................................... 47 2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan ................................ 47 2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học....................................................... 48 2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) ........................... 48 2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vitro ....................................................................................... 50 2.10. Các phương pháp thử dược lý ...................................................................... 51 2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp........................................................... 51 2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn...................................... 51 2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm .............................. 52 2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid ...................................................................................... 52 2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn ................................................................................. 52 2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm ............. 52 2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm.................................... 52 2.10.4. Xử lý số liệu............................................................................................... 52 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ........................................................................... 53 3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương............................ 53 3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương ............................................. 53 3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương ...................................... 55 3.1.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hương 55 vi
3.1.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương (sơ đồ 3.3) ................ 56 3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ .......................... 57 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ (sơ đồ 3.4) .......................... 57 3.2.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ .................................... 60 3.2.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hầu thủ 60 3.2.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ ................................................. 61 3.2.5. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzyme - 1,3-glucanase ......................................................................................................... 62 3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin .......... 64 3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm .............................................................................. 66 3.4. Thử dược lý chế phẩm .................................................................................... 66 3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp .............................................................................. 66 3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm ……………………………………………………………………………………68 3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm HG2….…………………………………………………………………………...70 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 73 4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương............................ 73 4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học ................................... 73 4.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3 ................................. 76 4.1.2.1. Hợp chất NH1: galactiol ........................................................................ 76 4.1.2.2. Hợp chất NH-2: Ergosterol .................................................................... 80 4.1.2.3. Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide ...................................................... 84 4.1.2.4. Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan (lentinan) ...................................... 88 4.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương .... 89 4.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ .......................... 92 4.2.1. Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư ................................ 92 4.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ ............................ 94 vii
4.2.2.1. Hợp chất HT1: axit stearic........................................................................ 94 4.2.2.2. Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide ......................................................... 97 4.2.2.3. Hợp chất HT3 - Cerebroside B ................................................................. 99 4.2.2.4. Hợp chất HT4 - Hericenone D ............................................................... 104 4.2.2.5. Hợp chất HT5 - Ergosterol .................................................................... 110 4.2.2.6. Hợp chất HT6 - β-Adenosine ................................................................. 112 4.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ ... 118 4.3. Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn và đánh giá hoạt tính của chúng .......................................................................... 121 4.3.1. Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase ................................................. 122 4.3.2. Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin ............. 124 4.4. Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm...128 4.4.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống của chế phẩm HG1 ............................................................................................................ 128 4.4.2. Độc tính bán trường diễn của sản phẩm HG1 khi cho uống trên động vật thực nghiệm ......................................................................................................... 129 4.4.2.1. Ảnh hưởng của HG1, cho CNT uống trường diễn đối với khối lượng gan, lách, thận động vật ............................................................................................... 130 4.4.2.2. Kết quả nghiên cứu trọng lượng cơ thể CNT, khối lượng gan, lách, thận và tỷ số giữa khối lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể ............................. 131 4.4.2.3. Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu huyết học trên động vật thực nghiệm ............................................................................ 132 4.4.2.4. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số hóa sinh động vật khi cho uống bán trường diễn ........................................................................................... 133 4.4.2.5. Ảnh hưởng của sản phẩm dùng uống 6 tuần đến chức năng tim thỏ được đo điện tim ........................................................................................................... 134 4.4.2.6. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số mô bệnh học khi dùng trường diễn....................................................................................................................... 135 4.4.3. Kết quả nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 ......................... 136 viii
4.4.3.1. Tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm trên chuột nhắt được gây độc gan bằng carbon tetraclorid ........................................................................................ 136 4.4.3.2. Ảnh hưởng của sản phẩm uống bán trường diễn đến quá trình tổng hợp protein trên động vật thực nghiệm ....................................................................... 137 4.4.3.3. Tác dụng trên hệ miễn dịch của sản phẩm ............................................. 138 4.4.3.4. Kết quả đánh giá tỷ lệ sống/chết của CNT sau chiếu xạ dưới tác dụng của sản phẩm .............................................................................................................. 139 4.4.3.5. Kết quả nghiên cứu tác dụng tên các dòng tế bào có chức năng miễn dịch ............................................................................................................................. 140 4.4.3.6. Kết quả nghiên cứu về phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu dưới tác dụng của sản phẩm ........................................................................ 141 4.4.4. Thử nghiệm tác dụng của sản phẩm HG1 lên tế bào ung thư ................... 144 4.4.4.1. Tác dụng của sản phẩm HG1 lên hồng cầu và tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vitro ............................................................................. 144 4.4.4.2. Tác dụng của hỗn hợp HG1 lên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) in vivo ...................................................................................................... 144 4.4.4.1. Tác dụng của chế phẩm HG1 lên khối tế bào ung thư Ehrlich in vivo .. 144 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 147 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 149 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............... 150 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 152 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ..............................Error! Bookmark not defined. ix
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh ..................... 5 Bảng 1.2. Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u .................................. 9 Bảng 1.3. Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu19 Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide .............. 28 Bảng 1.5. Giá trị y học và một số chất hoạt tính từ nấm hương ............................ 37 Bảng 3.1. Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzym -1,3-glucanase .......................................................................................... 63 Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương ................. 73 Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết của nấm hương ........................ 74 Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn polysaccharide .............................................................................................. 74 Bảng 4.4. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn ............................................... 75 Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn........................................................................................................................ 76 Bảng 4.6. Kết quả phổ 13C- NMR của NH2 .......................................................... 83 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất NH3 và hợp chất tham khảo ............... 86 Bảng 4.8. So sánh phổ 13C-NMR của lentinan và β-1,3/1,6 tinh sạch .................. 89 Bảng 4.9. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương ..... 90 Bảng 4.10. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan Hep-G2 trên thạch mềm của các hợp chất........................................................................... 91 Bảng 4.11. Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm hương .................................................................................................. 92 Bảng 4.12. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn chiết tách từ nấm hầu thủ .... 93 Bảng 4.13. Hoạt tính kháng u trên thạch của các cặn chiết nấm hầu thủ .............. 94 Bảng 4.14. Kết quả phổ NMR của HT3 .............................................................. 103 Bảng 4.15. Kết quả phổ NMR của HT4 .............................................................. 107 Bảng 4.16. Kết quả phổ NMR của HT6 .............................................................. 113 Bảng 4.17. giá trị tín hiệu phổ 13C-NMR của -1,3/1,6 glucan hầu thủ ............ 118 x
Bảng 4.18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ119 Bảng 4.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 trên thạch mềm của các hợp chất......................................................................... 120 Bảng 4.20. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng phân tử khác nhau. ............................................................................................... 123 Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β- 1,3/1,6-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau ............................................... 124 Bảng 4.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các sản phẩm trên dòng tế bào HepG2................................ 128 Bảng 4.23. Độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống trên CNT ................... 129 Bảng 4.24. Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sản phẩm nghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩm trên chuột nhắt trắng ............................................................................................................. 131 Bảng 4.25. Kết quả nghiên cứu về trọng lượng cơ thể và khối lượng các tạng ở mức liều sản phẩm là 3,0 g/kg/24h trong 42 ngày. ............................................. 132 Bảng 4.26. Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bán trường diễn với mức liều 3,0g/kg/24h ............................................................................. 133 Bảng 4.27. Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩm bán trường diễn liều 3,0 g/kg/24 giờ .......................................................................... 133 Bảng 4.28. Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều 3,0 g/kg TLCT tại các thời điểm (n=12) ................................................................... 134 Bảng 4.29. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan, lách, thận khi uống sản phẩm bán trường diễn liều 3,0 g/kg/TLCT.......................................................... 135 Bảng 4.30. Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGT ở các nhóm chuột nhắt nghiên cứu dưới tác dụng của sản phẩm............................................ 136 Bảng 4.31. Kết quả định lượng khối lượng gan ở các nhóm chuột nhắt nghiên cứu137 Bảng 4.32. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm uống liều 1,0 g/kg/TLCT đến lượng protein toàn phần (tính bằng g/L) ở huyết tương động vật thực nghiệm (n=12) ............................................................................................. 138 xi
Bảng 4.33. Tác dụng của sản phẩm về tác dụng trên hệ miễn dịch ở động vật thực nghiệm dùng uống liều 1,0 g/kg TLCT/24h và 3,0 g/kg TLCT/24h trên các chỉ tiêu khối lượng các cơ quan miễn dịch ................................................................ 138 Bảng 4.34. Tỷ lệ chuột nhắt sống sót sau chiếu xạ liều 7.0 Gy dưới tác dụng của sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT-CNT .................................................................... 139 Bảng 4.35. Ảnh hưởng của sản phẩm đến kết quả định lượng các tế bào tủy, bạch cầu và quần thể coloni lách ở CNT ..................................................................... 140 Bảng 4.36. Ảnh hưởng của sản phẩm đến tỷ số thực bào và chỉ số thực bào ..... 141 Bảng 4.37. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu trên CNT dưới tác dụng của HG1 liều 1,0 g/kg TLCT (chiếu xạ 7.0 Gy, sau đó uống sản phẩm) ............................................................................................................. 141 Bảng 4.38. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên chuột nhắt dưới tác dụng của sản phẩm; uống sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT, sau đó được chiếu xạ 7,0 Gy ... 142 Bảng 4.39. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên CNT chiếu xạ 7,0 Gy không dùng sản phẩm. .................................................................................................... 143 Bảng 4.40. Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế bào ung thư Ehrlich ở chuột (số trung bình ± s.e; n = 10; p
DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH Hình 1.1: Kết nối các polymer trong thành tế bào nấm. ....................................... 21 Hình 1.2. cấu trúc hóa học điển hình của β1,3/1,6 glucan. ................................. 22 Hình 1.3. Các dạng cấu trúc của βglucan và sự chuyển đổi giữa chúng............. 24 Hình 1.4. Cấu trúc của lentinan ............................................................................. 25 Hình 1.5. Cấu trúc β1,3/1,6 glucan của schizophyllan ........................................ 26 Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide .............. 28 Hình 1.6. Mô hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân gây bệnh (Leung, 2006) [81]. ....................................................................................... 29 Hình1.7. Tác dụng y học của nấm hương (Bisten et al. 2010). ............................ 37 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương ............................................... 54 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3 .......................................... 55 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương ................................. 57 Sơ đồ 3.4: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ ............................................ 59 Sơ đồ 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất HT1 và HT2 .......................................... 60 Sơ đồ 3.6. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ ................................. 62 Sơ đồ 3.7. Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ bằng emzyme ...... 64 Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ và curcumin ........ 65 Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của NH1 .......................................................................... 77 Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH1 ............................................ 78 Hình 4.3. Phổ COSY của NH1 .............................................................................. 78 Hình 4.4. Phổ HMBC của NH1 ............................................................................. 79 Hình 4.5. Phổ ESI-MS của NH1 ........................................................................... 79 Hình 4.6. Cấu trúc hóa học hợp chất NH1 ............................................................ 80 Hình 4.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất NH2 .......................................................... 80 Hình 4.8. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH2............................................ 81 Hình 4.9. Phổ 1H-NMR của NH2 .......................................................................... 82 Hình 4.10. Cấu trúc hóa học của NH2................................................................... 84 Hình 4.11. Phổ ESI-MS của NH3 ......................................................................... 84 xiii
Hình 4.12. Phổ 1H-NMR của NH3 ........................................................................ 85 Hình 4.13. Phổ 13C-NMR của NH3 ....................................................................... 86 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của NH3................................................................... 87 Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của NH-GL .................................................................. 88 Hình 4.16. Ức chế phát triển khối u tế bào Hep-G2 bởi các chất phân lập........... 91 Hình 4.17. Phổ 1H-NMR của HT1 ........................................................................ 95 Hình 4.18. Phổ 13C-NMR của HT1 ....................................................................... 95 Hình 4.19. Phổ ESI-MS của HT1 .......................................................................... 96 Hình 4.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất HT1 .................................................... 97 Hình 4.21. Phổ ESI-MS của HT2 .......................................................................... 97 Hình 4.22. Phổ 13C-NMR của HT2 ....................................................................... 98 Hình 4.23. Phổ 1H-NMR của HT2 ........................................................................ 99 Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của HT2 ................................................................... 99 Hình 4.25. Phổ ESI-MS của HT3 ........................................................................ 100 Hình 4.26. Phổ 1H-NMR của HT3 ...................................................................... 100 Hình 4.27. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT3 ........................................ 101 Hình 4.28. Phổ HMBC của HT3 ......................................................................... 102 Hình 4.29. Phổ HSQC của HT3 .......................................................................... 102 Hình 4.30. Cấu trúc hóa học của HT3 ................................................................. 104 Hình 4.31. Phổ ESI-MS của HT4 ........................................................................ 105 Hình 4.32. Phổ 1H-NMR của HT4 ...................................................................... 105 Hình 4.33. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT4 ........................................ 106 Hình 4.34. Phổ HSQC của HT4 .......................................................................... 107 Hình 4.35. Phổ HMBC của HT4 ......................................................................... 109 Hình 4.36. Cấu trúc hóa học của HT4 ................................................................. 109 Hình 4.37. Phổ 1H-NMR của HT5 ...................................................................... 110 Hình 4.38. Phổ 13C-NMR của HT5 ..................................................................... 111 Hình 4.39. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT5 ........................................ 111 Hình 4.40. Cấu trúc hóa học của HT5 ................................................................. 112 xiv
Hình 4.41. Phổ ESI-MS của HT6 ........................................................................ 112 Hình 4.42. Phổ 1H-NMR của HT6 ..................................................................... 113 Hình 4.43. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT6 ........................................ 114 Hình 4.44. Phổ HSQC của HT6 .......................................................................... 114 Hình 4.45. Phổ HMBC của HT6 ......................................................................... 115 Hình 4.46. Cấu trúc hóa học của HT6 ................................................................. 115 Hình 4.47. Phổ 13C-NMR của HT-GL................................................................. 117 Hình 4.48. Ức chế phát triển khối u tế bào HepG2 bởi các chất phân lập .......... 121 Hình 4.49. Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Mw phân đoạn HT-GL1, HT-GL2 và HT-GL3 sau khi ủ với enzyme và tách phân đoạn bằng EtOH 25, 40 và 70%.122 Hình 4.50. Phổ hấp thụ điện tử của Cur và Cur-Glu. .......................................... 126 Hình 4.51. Phổ huỳnh quang của Cur và Cur-Glu. ............................................. 126 Hình 4.52. Ảnh FESEM của Glu (a), Cur (b) và Cur-Glu (c,d) .......................... 127 Hình 4.53. Hình ảnh minh họa độ hòa tan của hỗn hợp Glu- Cur so sánh với Curcumin (độ tan của Glu-Cur (a) và Cur (b)) .................................................... 127 Hình 4.54. Ảnh huỳnh quang của hạt Cur (a) và Cur-Glu (b)............................. 127 xv
MỞ ĐẦU Hàng nghìn năm nay, nấm lớn (mushroom) đã được con người sử dụng làm thực phẩm và thuốc chữa bệnh. Theo ước tính, trên thế giới có khoảng 140.000 loài nấm lớn, trong đó có 14.000 loài đã được biết và mô tả với 50% có thể dùng làm thực phẩm. Hơn 2.000 loài nấm là an toàn cho người và khoảng 700 loài có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược. Vì vậy, nấm lớn là nguồn tài nguyên phong phú phục vụ cho phát triển các sản phẩm có giá trị cho ngành y và dược học. Một số loài đang được sử dụng rộng rãi phải kể đến nấm linh chi (Ganoderma lucidum), hầu thủ (Hericium erinaceus), nấm hương (Lentinula edodes), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm chân chim (Schizophyllum commune)… Khoa học đã chứng minh rằng nấm dược liệu hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch do virus, chống viêm nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh ... (Wasser, 2002; Chang và cs., 2004) [167,29]. Các hoạt chất trong nấm có thể là các phân tử nhỏ như triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm linh chi G. lucidum (Huie và cs., 2004) [60], các hericinone (8 loại) và erinacine của nấm hầu thủ H. erinaceus (Arnone và cs., 1994) [17], và hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ các chất phân tử lượng lớn như polysaccharide và glycoprotein. Phần lớn các polysaccharide ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật …) mà không hây hại cơ thể chủ. Ở Việt Nam, nấm lớn đã được chú ý từ lâu. Nấm có thể được thu hái từ tự nhiên hoặc chủ động nuôi trồng. Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây, nấm dược liệu được sử dụng nhằm bổ sung nguồn dinh dưỡng, tăng cường sức khoẻ và hệ miễn dịch, điều trị hỗ trợ phòng và chống các bệnh hiểm nghèo. 1
Với mục đích làm rõ hơn các hoạt chất có giá trị y học trong hỗ trợ điều trị ung thư của một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam”. Trong khuôn khổ luận án, chúng tôi tập trung nghiên những nội dung chủ yếu sau: 1. Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide giàu glucan từ quả thể nấm. 2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối u trên thạch mềm của các chất đã phân lập. 3. Tạo chế phẩm thử nghiệm trên động vật thực nghiệm. 4. Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực nghiệm (hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục hồi chức năng gan của sản phẩm) 2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc 1.1.1. Giới thiệu về nấm dược liệu Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn thức ăn và dược liệu chữa bệnh. Nấm lớn được hiểu là có quả thể rõ ràng xuất hiện trên cây, trên hoặc dưới mặt đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái bằng tay (Chang và Miles, 1992) [28]. Nấm lớn được sử dụng trong y dược gọi là nấm dược liệu. Hiện nay việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu là nấm đảm (Basidiomycetes), vì nấm túi (Ascomycetes) thường khó nuôi trồng. Nấm được con người sử dụng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị dược học của chúng. Nấm cung cấp ít calor và chất béo nhưng rất giầu protein, chất xơ, vitamin và chất khoáng (Crisan và Sands, 1978) [40]. Các nấm có thể ăn được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức năng như các loài thuộc chi Lentinula, Hericium, Grifola, Flammulina, Pleurotus, Tremella… Một số nấm như linh chi (Ganoderrma lucidum), nấm vân chi (Trametes versicolor) chỉ sử dụng làm thuốc bởi chúng có vị đắng và rất cứng. Hiện nay, khoảng hơn 200 loài nấm đã được thu hái và dùng cho chữa bệnh; 35 loài nấm được nuôi trồng cho mục đích thương mại, trong đó 20 loài được sản xuất ở qui mô công nghiệp làm thực phẩm và dược liệu (Chang, 1999) [27]. Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới năm 1994 là 4909103 tấn và tăng 6158103 tấn năm 1997 với giá trị ước tính 14 tỉ đô la Mỹ. Sáu trong số 10 loài nấm được trồng nhiều nhất (chiếm tới 92% tổng sản lượng nấm) gồm: Agaricus bisporus (nấm mỡ, chiếm 31.8%), Lentinus edodes (nấm hương, 25,4%), Pleurotus spp. (thuộc nấm sò, 14,2%), Auricularia auricular (7,9%), Flammulina velutipes (kim châm, 4,6%) và Volvariella volvaceae (nấm rơm, 7,9%) (Chang, 1999) [27]. 3
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm dược liệu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật nuôi trồng (Nguyễn Thị Chính, 2005 và 2011; Lê Minh Tuấn, 2009) [2,3,11]. Nguyễn Thị Chính cũng là một trong những nhà khoa học đầu tiên ở Việt Nam thí điểm nuôi trồng nấm sò và nấm linh chi bằng phương pháp lên men dịch thể để sản xuất thực phẩm chức năng, nhưng không tách chiết lấy polysaccharide hay các thành phần có hoạt tính mà dùng sản phẩm hỗn hợp (Chính, 2005 và 2011) [2,3]. Hoạt tính chống ung thư, tăng cường sức khỏe cho bệnh nhân mắc AIDS của polysaccharide từ nấm linh chi cũng được tác giả Nguyễn Thị Chính (2005) thử nghiệm [2]. Tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng đã bước đầu nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi, nấm hầu thủ nuôi trồng ở Việt Nam và xác định hoạt tính chống oxy hoá của chúng [5]. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi (đứng đầu là PGS.TS. Lê Mai Hương) là những người đi tiên phong trong nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam và đã đạt được những thành tựu đáng kể như tách chiết và sản xuất thực phẩm chức năng chứa β-glucan và một số hoạt chất từ nấm dược liệu. 1.1.2. Ứng dụng trong y học dân tộc Các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng nấm để phòng và chữa một số bệnh, kéo dài tuổi thọ. Những năm gần đây, thị trường Mỹ đã mở cửa để đón nhận những sản phẩm thuốc từ nấm dược liệu, đặc biệt nấm linh chi và nấm maitake. Năm 1994 thế giới tiêu thụ nấm dược liệu và các sản phẩm từ nấm với ước tính tới 3,8 tỉ USD và tăng lên tới 6 tỉ năm 1999 với thị trường chính (chiếm tới 99%) là châu Á và châu Âu. Các sản phẩm quan trọng từ nấm dược liệu thường có nguồn gốc từ các nấm Ganoderma sp., L. edodes, S. commune, Tremella fusiformis, Trametes versicolor, Grifola frondosa, và gần đây là từ Phellinus sp. (thượng hoàng) và Hericium erinaceus (hầu thủ) (bảng 1.1 - Wasser và Weis, 1999) [166]. 4
Bảng 1.1. Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh [166] Kháng nấm Kháng viêm Chống ung thư Chống virut (vd ant-HIV) Kháng vi khuẩn và kí sinh Điều hòa huyết áp Điều hòa tim mạch Chống cholesterol, mỡ máu Chống tiểu đường Tăng miễn dịch Bổ thận Bảo vệ gan Tốt cho thần kinh Tốt cho sinh lý Chữa viêm phổi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 16 5 Auriculariales Auricularia auricular-judas (Bull.) + + X X X Wettst Tremellales Tremella fucifomis Berk. + + + + + + X Tremella mesenterica Rits.:Fr + + Polyporales Schizophyllum commune Fr.:Fr. X X X X X X Dendropolyporus umbellatus (Pers.:Fr.) X X X X Jul. Grifola frondosa (Dicks.:Fr.) S.F. Gray + X X X X X X + + Fomes formentarius (L.:Fr) Fr. + + Fomitopsis pimicola (Schw.:Fr.) + + + + P.Karst. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd X X X X X Piptoporus betulinus (bull.:Fr.) P. + + + Karst. Hericium erinaceus (bull.:Fr.) Pers. + X X X Inonotus obliquus (Pers.:Fr.) Bond.et X X X X Sing. Lenzites betulina (L.:Fr.) Fr. + + Laetiporus sulphurous (Bull.:Fr.) Murr. + + Ganodermatales Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst X X X X X X X X X X X X Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. + + + + Agaricomycetideae Agaricales s.I. Pleurotaceae Lentinus edodes (Berk.) Sing. X X X X X X X X X X X Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kumm. + + + + + Pleurotus pulmonarius (Fr.:Fr.) Quel + + + Tricholomataceae Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) + X X + X P.Karst. Ourdemansiella mucida (Schrad.:Fr.) X v.Hohn Armillariella mellea (VahI.:Fr.) + X X X P.Karst. Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigel. X Marasmius androsaceus (L.:Fr.) Fr. X X Agaricaceae Agaricus blazei Murr. X Agaricus bisporus (J.Lge) Imbach + X X 5