Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:299

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam; nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập được từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng, thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tương quan cấu trúc – hoạt tính của chúng. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VÕ THỊ QUỲNH NHƢ NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, CHUYỂN HÓA HÓA HỌC VÀ THĂM DÕ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC TRITERPENOID TỪ CÂY RAU MÁ [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN] HỌ HOA TÁN (APIACEAE) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TSKH. Trần Văn Sung 2. TS. Trần Văn Lộc HÀ NỘI - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Võ Thị Quỳnh Như
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và người thân. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến GS. TSKH. Trần Văn Sung và TS. Trần Văn Lộc – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường THPT Gio Linh cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án. Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.01-2012.33 do TS. Trần Văn Lộc làm chủ nhiệm. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2017 Võ Thị Quỳnh Như
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................. v DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ......................................................................................... x MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 2 1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng ...................................................................................2 1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian 2 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................2 1.1.1.2. Phân bố và sinh thái...............................................................................2 1.1.1.3. Tác dụng, công dụng .............................................................................2 1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má.....................................................3 1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid ..........................................................................3 1.1.2.2. Các hợp chất polyphenol .......................................................................8 1.1.2.3. Các lớp chất khác ..................................................................................9 1.2. Một số kết quả nghiên cứu chiết tách triterpene và triterpene glycoside từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban .......................................................................9 1.3. Hoạt tính sinh học của cây rau má .................................................................15 1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn ..............................................................................15 1.3.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm ...........................................................15 1.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa...........................................................................16 1.3.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh ........................................................................16 1.4.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch ..........................................................16 1.4. Hoạt tính sinh học của asiatic acid, madecassic acid và các dẫn xuất ...........17 1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thƣ ..............................................17 1.4.2. Hoạt tính làm lành vết thƣơng ..................................................................19 1.4.3. Hoạt tính chống trầm cảm ........................................................................20 1.4.4. Hoạt tính bảo vệ gan .................................................................................20 1.4.5. Các hoạt tính khác ....................................................................................20 i
1.5. Một số chuyển hóa của asiatic acid ................................................................21 1.5.1. Một số chuyển hóa hóa học của asiatic acid.............................................21 1.5.2. Chuyển hóa bằng phƣơng pháp sinh học..................................................29 1.6. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ...................................................................30 Chƣơng 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................... 34 2.1. Các phƣơng pháp chiết xuất và phân lập chất ................................................34 2.2. Các phƣơng pháp phổ ....................................................................................34 2.3. Các phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ................................................................34 2.4. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro ........................................35 2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm ...............35 2.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc trên hai loại enzyme SIRT1 và 17β-HSD1 (docking phân tử) ..............................35 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM ..................................................................................... 37 3.1. Nguyên liệu ....................................................................................................37 3.1.1. Mẫu cây rau má ........................................................................................37 3.1.2. Dung môi, hóa chất ...................................................................................37 3.2. Phân lập chất ..................................................................................................37 3.2.1. Phân lập các thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh .............................................................................................................37 3.2.1.1. Phân lập các chất .................................................................................37 3.2.1.2. Các số liệu phổ của các chất phân lập đƣợc ........................................38 3.2.2. Nghiên cứu định lƣợng các thành phần triterpene acid chính trong mẫu rau má thu thập ở một số tỉnh thuộc Bắc bộ và Nam bộ ....................................40 3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng asiatic acid bằng phƣơng pháp HPLC ...............40 3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid bằng sắc ký cột 42 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu hồi asiatic acid và madecassic acid ...........................................................................42 3.2.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ......................................................................42 3.2.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn ...............................................................43 3.2.3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chiết ............................................................44 ii
3.2.4. Phân lập asiatic acid và madecassic acid từ cây rau má Centella asiatica (L.) Urban làm nguyên liệu để điều chế các dẫn xuất ........................................44 3.3. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic và madecassic acid ..................................47 3.3.1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid ....................................................47 3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ............................................63 3.4. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc ..................72 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ..............................................................72 3.4.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) .......................73 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 75 4.1. Phân lập chất ..................................................................................................75 4.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây rau má thu tại Thành phố Hồ Chí Minh (RMHCM).................................................................................................75 4.1.2.1. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong một số mẫu rau má bằng phƣơng pháp HPLC .................................................................................78 4.1.2.2. Định lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má bằng phƣơng pháp CC ...............................................................................................79 4.2. Điều kiện chiết xuất cho hiệu suất cao nhất từ mẫu rau má...........................80 4.3. Chuyển hóa hóa học của asiatic acid và madecassic acid ..............................80 4.3.1. Chuyển hóa của asiatic acid .....................................................................80 4.3.1.1. Chuyển hóa nhóm COOH (C-28) ........................................................80 4.3.1.2. Chuyển hóa vòng A của asiatic acid ...................................................98 4.3.2. Các dẫn xuất của madecassic acid ..........................................................103 4.4. Thử hoạt tính sinh học..................................................................................113 4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................................113 4.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của asiatic acid .113 4.4.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của các dẫn xuất của madecassic acid ........................................................................................................................115 4.5.2. Hoạt tính bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) .....................118 4.6. Nghiên cứu, dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp trên mô hình tế bào (docking phân tử) .......................................................................119 iii
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 121 5.1. Kết luận ........................................................................................................121 5.2. Kiến nghị ......................................................................................................122 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................................123 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ..............................................124 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................125 iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phƣơng pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột thƣờng HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phƣơng pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt Spectroscopy nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hƣởng từ hạt Resonance Spectroscopy nhân carbon 13 GC-MS Gas Chromatography-Mass Sắc ký khí ghép nối khối Spectrometry phổ COSY Correlation Spectroscopy Phổ tƣơng tác hai chiều 1 H-1H DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun Spectrometry mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tƣơng tác dị hạt nhân Correlation qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Phổ khối phân giải cao Ionization - Mass Spectrometry ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tƣơng tác dị hạt nhân Coherence qua một liên kết IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) Hằng số tƣơng tác tính bằng Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu s singlet q quartet dt double triplet d doublet quint quintet br broad t triplet dd double doublet m multiplet v
Các dòng tế bào HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thƣ cổ tử cung HepG2 Human hepatocellular Ung thƣ gan carcinoma KB Human epidermoid carcinoma Ung thƣ biểu mô MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thƣ vú MDA-MB-231 Metastatic human breast cancer Ung thƣ vú Lu Human lung carcinoma Ung thƣ phổi LTB Lymphotoxin-beta SIRT1 Enzyme deacetylase sirtuin-1 17β-HSD1 Enzyme 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 Các ký hiệu viết tắt khác IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% Mp Melting point Điểm chảy AA Asiatic acid MA Madecassic acid RMST Rau má Sơn Tây RMND Rau má Nam Định RMHCM Rau má Hồ Chí Minh DMAP 4-Dimethylaminopyridine PCC Pyridinium chlorochromate PDC Pyridinium dichromate CTPT Công thức phân tử TEA Triethanolamine DCM Dichloromethane MDA Malon dialdehyde n- n-Butanol Ac Acet BuOH CHCl3 Chloroform Bz Benzoyl DMSO Dimethylsulfoxide OMe Methoxy EtOAc Ethyl acetate Ph Phenyl MeOH Methanol Et Ethyl TBAI tetrabutylammonium iodide Me Methyl TMS Tetramethylsilane THF Tetrahydrofuran AIF apoptosis-inducing factor TPA 12-O- tetradecanoylphorbol- 13-acetate Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban ...................................................3 Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ................................5 Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má ...............................5 Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ cây rau má ..........................................................................................................................6 Hình 1. 5. Các triterpene và triterpene glucoside khung oleanane đƣợc phân lập từ cây rau má ...................................................................................................................7 Hình 1. 6. Công thức các hợp chất phenolic phân lập từ cây rau má .........................8 Hình 1. 7. Các thành phần hóa học khác đƣợc phân lập từ cây rau má ......................9 Hình 1. 8. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Yoshida M phân lập từ cây rau má trồng tại Nhật Bản và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của chúng .................12 Hình 1. 9. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Rumalla phân lập từ cây rau má trồng tại Mỹ .........................................................................................................13 Hình 1. 10. Các triterpene và triterpene glycoside đƣợc Weng phân lập từ cây rau má trồng tai Trung Quốc ...........................................................................................13 Hình 1. 11. Một số sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có chứa rau má ............................17 Hình 1. 12. Một số sản phẩm từ cây rau má Việt Nam .............................................30 Hình 3. 1. Đƣờng chuẩn asiatic acid .........................................................................41 Hình 4. 1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12- ene-28-oic acid (145) ................................................................................................83 Hình 4. 2. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (147) ..................................................................84 Hình 4. 3. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-propanol (150) ........................................................................86 Hình 4. 4. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-methylhydrazine (154)...............................................................87 Hình 4. 5. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-propyl acetate (157)................................................................89 vii
Hình 4. 6. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylacetamide (158) ............................................................90 Hình 4. 7. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất N-(2α,3β,23-triacetoxy- urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylacetamide (159) .............................................................92 Hình 4. 8. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs- 12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (162).........................................................................94 Hình 4. 9. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α,3β,23-trihydroxy-urs- 12-ene-17-nitrile (170) ..............................................................................................97 Hình 4. 10. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-hydroxy-3β,23- isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (171) ................................................100 Hình 4. 11. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 2α-succinoyl-3β,23- isopropylidenedioxy-urs-12-ene-28-oic acid (172) ................................................101 Hình 4. 12. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất 2α-acetoxy-3β,23- dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (174) .................................................................103 Hình 4. 13. Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất 6β-hydroxy-2α,3β,23- triacetoxy-urs-12-ene-28-amide (180) ....................................................................106 Hình 4. 14. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(6β-hydroxy- 2α,3β,23-triacetoxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-heptylamine (181) ...............................107 Hình 4. 15. Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO) của hợp chất N,N-(2α,3β,6β,23- tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-ethanol (186) ......................................................110 Hình 4. 16. Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD) của hợp chất N-(2α,3β,6β,23- tetrahydroxy-urs-12-ene-28-oyl)-n-nonylamine (190) ...........................................112 viii
DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG Bảng 3. 1. Giá trị HPLC của asiatic acid ..................................................................41 Bảng 3. 2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu quả chiết. ...........................................43 Bảng 3. 3. Ảnh hƣởng của nồng độ dung môi chiết đến hiệu quả chiết asiatic acid và madecassic acid .........................................................................................................43 Bảng 3. 4. Khảo sát thời gian chiết mẫu rau má khô ................................................44 Bảng 4. 1. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phƣơng pháp HPLC ............................................................................79 Bảng 4. 2. Tổng hàm lƣợng asiatic acid và madecassic acid trong ba mẫu rau má xác định theo phƣơng pháp CC .................................................................................79 Bảng 4. 3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các dẫn xuất tổng hợp của asiatic acid .........................................................................................114 Bảng 4. 4. Hoạt tính gây độc tế bào của dẫn xuất madecassic acid ........................117 Bảng 4. 5. Sự thay đổi các chỉ số AST ( UI/ L) và ALT (UI/L) ở các lô thí nghiệm.....118 Bảng 4. 6. Khối lƣợng gan chuột (g/10g cơ thể) ở các lô thí nghiệm .....................118 Bảng 4. 7. Hàm lƣợng MDA trong gan chuột thí nghiệm ......................................119 Bảng 4. 8. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phƣơng pháp docking phân tử của asiatic acid .......................................................119 Bảng 4. 9. Kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp theo phƣơng pháp docking phân tử của madecassic acid ...............................................120 ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1. 1. Chuyển hóa các dẫn xuất của AA tại vị trí C-2 ......................................22 Sơ đồ 1. 2. Tổng hợp dẫn xuất C2- oxo của asiatic acid ...........................................22 Sơ đồ 1. 3. Chuyển hóa ở C2 (khử oxy) của asiatic acid ..........................................23 Sơ đồ 1. 4. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23, C-11 và C-28 của asiatic acid .......23 Sơ đồ 1. 5. Tổng hợp dẫn xuất 3-oxo-23-andehyde và các dẫn xuất ........................24 Sơ đồ 1. 6. Tổng hợp dẫn xuất C2-benzyloxy, C3,23-diacetoxy của acid methyl ester. ..........................................................................................................................24 Sơ đồ 1. 7. Tổng hợp C11-keto asiatic acid. .............................................................25 Sơ đồ 1. 8. Tổng hợp C28-hydroxymethyl asiatic acid. ...........................................26 Sơ đồ 1. 9. Chuyển hóa ở vị trí C-2, C-3, C-23 của asiatic acid ...............................26 Sơ đồ 1. 10. Chuyển hóa ở vị trí C2,3,28 của asiatic acid ........................................27 Sơ đồ 1. 11. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amino axit từ asiatic acid ........................28 Sơ đồ 1. 12. Sơ đồ tổng hợp các dẫn suất amide từ asiatic acid ...............................29 Sơ đồ 1. 13. Tổng hợp một số dẫn xuất của AA bằng con đƣờng sinh học..............30 Sơ đồ 3. 1. Sơ đồ phân lập các chất từ cây rau má [C. asiatica (L.) Urban] thu hái tại Thành phố Hồ Chí Minh ......................................................................................38 Sơ đồ 4. 1. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (1) .............................................81 Sơ đồ 4. 2. Tổng hợp các dẫn xuất của asiatic acid (2) .............................................98 Sơ đồ 4. 3. Tổng hợp các dẫn xuất của madecassic acid ........................................103 x
MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học lý thú đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực y dƣợc, nông nghiệp và đời sống. Có nhiều loại thuốc hoàn toàn phải dựa vào thiên nhiên để chữa các bệnh thông thƣờng cũng nhƣ các bệnh hiểm nghèo. Một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng hiện nay đƣợc các nhà khoa học nƣớc ta và trên thế giới rất quan tâm là: Từ các hợp chất thiên nhiên ban đầu ngƣời ta bán tổng hợp, thay đổi cấu trúc hoá học của chúng để tìm ra các hợp chất mới có hoạt tính và tính chất ƣu việt hơn những hợp chất ban đầu. Cách tiếp cận này có tính kinh tế tốt hơn, phù hợp hơn với cơ thể sống và thân thiện môi trƣờng hơn. Trong số các hợp chất thiên nhiên, các triterpene có khung ursane nhƣ nhóm ursolic acid và các dẫn xuất của ursolic acid có nhiều hoạt tính sinh học lý thú nên ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu về mặt hoá học và dƣợc lý học. Trong đó hoạt tính gây độc với tế bào khối u phổi dòng A-549, cũng nhƣ với tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210, hoạt tính gây độc với tế bào khối u KB và khả năng ức chế phát triển khối u trên da chuột đã đƣợc khẳng định [1]. Trong quá trình tìm hiểu về các cây thuốc cổ truyền Việt Nam, chúng tôi thấy cây rau má, có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), có chứa nhiều hợp chất triterpene thuộc khung ursane nhƣ: asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside… với hàm lƣợng khá cao có hoạt tính độc với tế bào ung thƣ [2]. Để tận dụng nguồn nguyên liệu này và góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các chất mới có hoạt tính cao, chúng tôi đặt mục đích sử dụng các triterpene tách đƣợc từ cây rau má để chuyển hóa chúng tạo thành các dãy dẫn xuất mới và thăm dò hoạt tính kháng ung thƣ của các chất thu đƣợc. Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của các triterpenoid từ cây rau má [Centella asiatica (L.) Urban], họ Hoa tán (Apiaceae)”. Đề tài đƣợc thực hiện với ba mục tiêu: 1. Nghiên cứu chiết tách và tinh chế các thành phần hóa học chính của cây rau má Centella asiatica (L.) Urban thu tại một số vùng của Việt Nam. 2. Nghiên cứu chuyển hóa hóa học asiatic acid và madecassic acid phân lập đƣợc từ cây rau má thành các dẫn xuất mới của chúng. 3. Thăm dò hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tổng hợp đƣợc để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới và tìm mối tƣơng quan cấu trúc – hoạt tính của chúng. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây rau má và hoạt tính sinh học của chúng 1.1.1. Đặc điểm thực vật học và ứng dụng của cây rau má trong y học dân gian - Tên tiếng việt: cây rau má - Tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urb., thuộc họ hoa tán (Apiaceae) - Tên khác: Tích huyết thảo, Liên tiền thảo. 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây rau má là loại cây thảo nhỏ, cao 7-10 cm, thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non, bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2-5 cái ở một mấu, phiến lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo, cuống lá mảnh, dài 3-5 cm, có khi đến 7-8 cm. Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2-5 cái ở kẽ lá, mỗi tán mang 1-5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống, tổng bao có 2-3 mảnh hình trái xoan, nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim, bầu hình cầu. Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7-9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông, vỏ có vân mạng. Mùa hoa quả: tháng 4-6 [1-3]. 1.1.1.2. Phân bố và sinh thái Rau má thƣờng mọc ở những nơi ẩm ƣớt nhƣ thung lũng, bờ mƣơng vùng nhiệt đới nhƣ: Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấn Độ, Pakistan, và Madagascar [4,5,6]. Ở nƣớc ta, rau má đƣợc trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh duyên hải miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm cao và có loại đất sét pha cát rất thích hợp cho loại cây này phát triển. 1.1.1.3. Tác dụng, công dụng Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác dụng dƣỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu, thƣờng đƣợc dùng để làm thuốc bổ dƣỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, mụn nhọt, rôm sảy. Dân gian thƣờng dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ đậu, sởi, sốt da vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm đƣờng tiết niệu, đái dắt, đái buốt, còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hƣ, bạch đới, giải độc lá ngón [1,2]. 2
Rau má đƣợc dùng ăn sống hoặc ép lấy nƣớc pha đƣờng uống cho mát. Có thể giã lấy nƣớc uống hoặc sắc uống làm thuốc giải nhiệt hoặc giải độc, lợi tiểu, cầm máu, trị kiết lỵ, táo bón. Dùng ngoài đắp chữa các vết thƣơng do ngã gãy xƣơng, bong gân và làm tan mụn nhọt. Rau má (300g) và phèn chua (3g) giã nhỏ, hoà nƣớc dừa, vắt lấy nƣớc uống trị kinh nguyệt không đều, đau lƣng, tức ngực, đau bụng máu, khô da, nhức đầu, nóng lạnh, bạch đới. Ngƣời ta đã chế rau má thành những dạng kem để chữa các vết thƣơng phần mềm cho mau liền da, liền sẹo. Mặc dù cây rau má đã đƣợc biết đến từ rất lâu, nhƣng hiện nay vẫn có rất nhiều tài liệu, công trình mới công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nó. Hình 1. 1. Cây rau má Centella asiatica (L.) Urban 1.1.2. Các thành phần hóa học của cây rau má Cây rau má là một trong những cây thảo dƣợc rất phổ biến ở các nƣớc Đông Á, Đông Nam Á và đã đƣợc ứng dụng trong các bài thuốc dân gian ở nhiều nƣớc để điều trị bệnh. Có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm làm sáng tỏ các thành phần hóa học và mối liên quan với ứng dụng của chúng. Các nghiên cứu đã xác định đƣợc trong cây rau má có các thành phần hóa học rất phong phú về cấu trúc cũng nhƣ về tác dụng sinh học. 1.1.2.1. Các hợp chất terpenoid Các hợp chất terpenoid đƣợc cho là có vai trò chính quyết định ứng dụng của cây rau má. Một số thành phần chính của lớp chất này nhƣ: monoterpene, sesquiterpene, triterpene ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Monoterpenoid, sesquiterpenoid 3
Ở Nam Phi cây rau má đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh. Tinh dầu của cây rau má Nam Phi có chứa 11 hợp chất monoterpene hydrocarbon (chiếm 20,20% tinh dầu), 9 hợp chất monoterpene chứa oxy (chiếm 5,46%), 14 hợp chất sesquiterpene hydrocarbon (68,80%), 5 hợp chất sesquiterpene chứa oxeny (3,90%), một số hợp chất sesquiterpene chứa lƣu huỳnh (0,76%). Trong số các hợp chất chính của tinh dầu rau má thì: α-humulene chiếm 21,60%, β-caryophyllene chiếm 19,08%, bicyclo germacrene chiếm 11,22%, germacrene B chiếm 6,29% và myrcene chiếm 6,55%. Tinh dầu rau má Nam Phi có hoạt tính kháng khuẩn rộng đối với vi khuẩn Gram- dƣơng nhƣ Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm nhƣ Escherichia coli, Pseudoneonas aeruginosa, Shigella sonnei [7]. Theo tài liệu tham khảo [4] thì hàm lƣợng tinh dầu trong rau má là xấp xỉ 0,1% tính theo khối lƣợng khô. Thành phần monoterpene chính gồm: α-pinene, β-pinene, myrcene, γ- terpinene, borneol, bornyl acetate, các sesquiterpene chính gồm: α-copaene, β- elemene, β-caryophyllene, trans-β-farnesene, germacrene và bicycloelemene. Các monoterpene tìm thấy trong thành phần tinh dầu rau má tồn tại dƣới dạng mạch hở, đơn vòng, hoặc hai vòng (bicyclic). Các sesquiterpene cũng có cấu trúc mạch hở, đơn vòng, hai vòng (bicyclic) và ba vòng (tricyclic). Nhóm tác giả Qin L.P., Ding R.X. Zhang W.D. và cộng sự đã dùng phƣơng pháp GC - MS để nghiên cứu thành phần tinh dầu cây rau má, qua đó đã xác định 45 chất có trong tinh dầu rau má. Caryophyllene, farnesol và elemene là thành phần chính của tinh dầu rau má [8]. Từ tinh dầu cây rau má sinh trƣởng ở Nam Phi, nhóm tác giả này đã tìm 11 monoterpenoid, 9 monoterpenoid chứa oxy, 14 sesquiterpenoid, 5 sesquiterpenoid chứa oxy, và 1 sesquiterpenoid sulfid. α-humulen, β-caryophyllene và bicyclo-germacrene là các chất chính trong tinh dầu cây này [9]. Dƣới đây là một số hợp chất monoterpenoid và sesquiterpenoid thƣờng gặp trong tinh dầu rau má (Hình 1.2, và 1.3). 4
Hình 1. 2. Các monoterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má Hình 1. 3. Các sesquiterpenoid thu đƣợc từ tinh dầu cây rau má Triterpenoid Triterpenoid đƣợc xác định là thành phần quan trọng nhất của cây rau má, quyết định sự ứng dụng của cây thuốc này trong dân gian. Chất lƣợng của cây rau má đƣợc đánh giá bởi hàm lƣợng của các triterpenoid có trong cây. Các triterpenoid đƣợc xác định là các pentacyclic triterpenoid acid dạng tự do và dạng glycoside. Lớp chất triterpenoid trong rau má chủ yếu có các khung ursane hoặc khung oleanane nhƣ: asiatic acid, asiaticoside, madecassic acid, madecassoside, brahmoside, brahmic acid, brahminoside, thankuniside, isothankuniside, betulinic acid [9,10] 5
Hình 1. 4. Các triterpene và triterpene saponin khung ursane đƣợc phân lập từ cây rau má 6