Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển Anthenea sibogae và Anthenea aspera của Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:225

Thêm vào BST

Báo xấu

19
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nghiên cứu các nội dung: Phân lập các hợp chất từ hai loài sao biển Anthenea aspera và Anthenea sibogae thu thập từ vùng biển Việt Nam; xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được; thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của một số chất phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển Anthenea sibogae và Anthenea aspera của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC HAI LOÀI SAO BIỂN ANTHENEA SIBOGAE VÀ ANTHENEA ASPERA CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN ANH HƯNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC HAI LOÀI SAO BIỂN ANTHENEA SIBOGAE VÀ ANTHENEA ASPERA CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy 2. TSKH. Alla Anatolievna Kicha HÀ NỘI - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy và TSKH. Alla Anatolievna Kicha. Các kết quả trong Luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Anh Hưng
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quí báu của các thầy cô, những nhà khoa học trong và ngoài nước cũng như các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất tới hai cô hướng dẫn là PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy (Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và TSKH. Alla Anatolievna Kicha (Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương,Viện Hàn lâm Khoa học liên bang Nga). Nhờ sự hướng dẫn tận tình, sự định hướng nghiên cứu một cách khoa học, cũng như việc tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất của các cô trong quá trình thực thiện luận án, tôi đã tiếp thu được nhiều kiến thức mới trong lĩnh vực nghiên cứu và hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện tốt nhất và những góp ý quý báu trong thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. Phạm Quốc Long cùng các anh, chị phòng Hóa Sinh Hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và các bạn đồng nghiệp Khoa Hóa học trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2 đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Luận án được thực hiện với sự tài trợ kinh phí từ đề tài hợp tác song phương Việt Nam - Ấn Độ 2012-2013 do PGS.TS. Đoàn Lan Phương làm chủ nhiệm đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh. Tác giả luận án Nguyễn Anh Hưng
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... iv MỤC LỤC.............................................................................................................. v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................... xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ............................................................................. xii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................. 2 1. 1. Giới thiệu về sao biển ...................................................................................... 2 1.1.1. Cấu tạo của sao biển và phân bố ................................................................... 2 1.1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam......................................................................... 4 1.1.3. Họ sao biển Oreasteridae .............................................................................. 5 1.2. Thành phần hóa học họ sao biển Oreasteridae................................................... 5 1.2.1. Steroid ........................................................................................................... 6 1.2.2. Các dẫn xuất ceramide ................................................................................ 21 1.3. Hoạt tính sinh học của sao biển ....................................................................... 27 1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .............................................................................. 27 1.3.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.............................................................. 31 1.3.3. Hoạt tính tán huyết ...................................................................................... 31 1.3.4. Hoạt tính neuritogenesis (tạo tế bào thần kinh hình sợi) .............................. 32 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 33 2.1.1. Sao biển Anthenea sibogae .......................................................................... 33 2.1.2. Sao biển Anthenea aspera ............................................................................ 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 35 2.2.1. Phương pháp phân lập các chất................................................................... 35 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................... 35 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học .................................................... 37 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 40 3.1. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea sibogae ..................... 40 3.1.1. Xử lý mẫu sao biển A. sibogae ..................................................................... 40
3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển Anthenea sibogae .................................................................................................. 42 3.2. Chiết tách, phân lập các hợp chất từ sao biển Anthenea aspera ....................... 44 3.2.1. Xử lý mẫu sao biển Anthenea aspera ........................................................... 45 3.1.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được từ loài sao biển Anthenea aspera .................................................................................................... 47 CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 49 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea sibogae .................. 49 4.1.1. Hợp chất ASB1: cholesterol ......................................................................... 51 4.1.2. Hợp chất ASB2: Thymine ............................................................................. 56 4.1.3. Hợp chất ASB3: L-Tyrosine ......................................................................... 59 4.1.4. Hợp chất ASB4: L-Tryptophan..................................................................... 60 4.1.5. Hợp chất ASB5: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl- -D-galactofuranosyl)-16-O-(3- O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3 ,6, 7,16 -tetraol (anthenoside S1, hợp chất mới)...................................................... 62 4.1.6. Hợp chất ASB6: (20R,22E)-7-O-(6-O-methyl- -D-galactofuranosyl)-16-O-(4- O-methyl--D-glucopyranosyl)-24-nor-5-cholesta-8(14),22(23)-diene-3 ,6, 7,16 -tetraol (anthenoside S2, chất mới) ............................................................ 72 4.1.7. Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl- -D-glucopyranosyl)-5-cholesta-8(14),24-diene-3,6,7 ,16-tetraol (anthenoside S3) .................................................................................................... 78 4.1.8. Hợp chất (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(3-O-methyl- -D-glucopyranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3 ,6,7,16- tetraol (anthenoside S4)......................................................................................... 83 4.1.9. Hợp chất (20R,20E)-16-O-(3-O-methyl- -D-galactofuranosyl)-5-cholesta- 8(14),22,23-diene-3,6,7,16 -tetraol (anthenoside S5, hợp chất mới). ............. 89 4.1.10. Hợp chất ASB10: (20R)-7-O-(6-O-methyl--D-galactofuranosyl)-16-O-(-D- galactofuranosyl)-24-methyl-5-cholesta-8(14),24(28)-diene-3,6,7,16-tetraol (anthenoside S6, hợp chất mới) ............................................................................. 95 4.1.11. Hỗn hợp (ASB11) của anthenoside J ((20R,24R)-7-O-(6-O-methyl-β-D- galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest-
8(14)-ene-3α,6β,7β, 16α-tetraol) và anthenoside K ((20R,24S)-7-O-(6-O-methyl-β- D-galactofuranosyl)-16-O-(6-O-methyl-β-D-galactofuranosyl)-24-ethyl-5α-cholest- 8(14)-ene-3α,6β,7β,16α-tetraol............................................................................ 103 4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất từ loài sao biển Anthenea aspera .................. 107 4.2.1. Hợp chất AA1: cholesterol ......................................................................... 109 4.2.2. Hợp chất AA2: Lathosterol (Cholest-7,8-ene-3 -ol) .................................. 109 4.2.3. Hợp chất AA3: cholest-4-ene-3 ,6-diol ................................................... 115 4.2.4. Hợp chất AA4: cholestane 3,5,6,15,16,26-hexol ............................. 118 4.2.5. Hợp chất AA5: cyclo(L-glycine-L-proline) (Hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea ) ..................................................................................................... 123 4.2.6. Hợp chất AA6: L-glycine-L-prolin (Hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Anthenea) ............................................................................................................ 128 4.2.7. Hợp chất AA7: cyclo(L-alanyl-4-hydroxyl-L-prolyl) (Hợp chất lần đầu phân lập từ chi Anthenea) ............................................................................................ 130 4.2.8. Hợp chất AA8: L-Phenylalanine ................................................................ 134 4.2.9. Hợp chất AA9: tyramine ........................................................................... 138 4.2.10. Hợp chất AA10: thymine .......................................................................... 140 4.2.11. Hợp chất AA11: uracil ............................................................................. 141 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của một số chất mới phân lập từ sao biển A. sibogae ............................................................................................................................ 142 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ............................................................................ 143 4.3.2. Hoạt tính chống tăng sinh tế bào ............................................................... 143 4.3.3 Khảo sát hoạt tính ức chế sự hình thành khối tế bào ung thư trên thạch mềm ............................................................................................................................ 144 CHƯƠNG V - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .............. 146 PHỤ LỤC........................................................................................................... 157
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc kí cột HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography 13 C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy Cacbon 13 TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng SiO2 Silica gel Các phương pháp phổ 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt Resonance Spectroscopy nhân carbon 13 COSY Correlated Spectroscopy Phổ tương tác proton DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Phổ khối lượng ion hóa phun Spectrometry mù điện tử GC-MS Gas chromatography - Mass Sắc ký khí ghép nối khối phổ spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân Correlation qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High Resolution – Electron Spray Phổ khối phân giải cao ion Ionization - Mass Spectrometry hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân Coherence qua 1 liên kết
IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại ROESY Rotating frame Overhauser effect Phổ ROESY spectroscopy J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz δ(ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu Các dòng tế bào RPMI-1640 Human malignant melanoma cell Dòng tế bào u sắc tố ác tính line ở người T-47D Human breast cancer cell line Dòng tế bào ung thư vú ở người Các hóa chất CHCl3 Chloroform Cloroform CH2Cl2 Dichloromethane Diclometan (DCM) DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxit EtOH Ethanol Cồn EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat MeOH Methanol Ancol metylic TMS Tetramethylsilane Tetramethylsilane Các ký hiệu viết tắt khác EC50 Effective concentration 50% Nồng độ có hiệu quả 50% ED50 Effective dose 50% Liều để vật thí nghiệm hiệu quả ở 50% FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bê FFA Free fatty acid Acid béo tự do
M.p. Melting point Điểm chảy MTS [3-(4,5-dimetylthiazon-2-yl)5-(3- carboxymetoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium] IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm [α]D Độ quay cực riêng
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 154-157 trên một số dòng tế bào ung thư ở người (giá trị ED50 (g/mL) ............................................................ 28 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của ASB1 và hợp chất tham khảo .............................. 55 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của ASB2 và hợp chất tham khảo .............................. 58 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của ASB3 và hợp chất tham khảo .............................. 60 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của ASB4 và hợp chất tham khảo .............................. 62 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của ASB5 và hợp chất tham khảo .............................. 70 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của ASB6 và hợp chất tham khảo .............................. 77 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của ASB7 và hợp chất tham khảo .............................. 81 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của ASB8 và hợp chất tham khảo .............................. 87 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của ASB9 và hợp chất tham khảo............................. 94 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của ASB10 và hợp chất tham khảo......................... 101 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hỗn hợp ASB11 ............................................... 106 Bảng 4.13. Bảng tổng hợp các chất phân lập được từ sao biển Anthenea aspera . 108 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của AA2 và hợp chất tham khảo............................. 114 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của AA3 và hợp chất tham khảo ............................. 117 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của AA4 và hợp chất tham khảo............................. 122 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của AA5 và hợp chất tham khảo............................. 127 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của AA6 và hợp chất tham khảo............................. 130 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của AA7 và hợp chất tham khảo............................. 134 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của AA8 và hợp chất tham khảo............................. 138 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AA9 và hợp chất tham khảo .............. 140
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu tạo của sao biển (nguồn: inforvisual.info) ......................................... 3 Hình 1.2. Các dạng cấu trúc sterol chính từ sao biển (S: mạch nhánh) ..................... 6 Hình 1.3. Các glycone chính của các hợp chất glycoside trong sao biển .................. 8 Hình 1.4. Các nhóm polyhydroxysteroid glycoside (S: mạch nhánh, G: phần đường) ................................................................................................................................ 9 Hình 1.5. Các nhóm cấu trúc của các hợp chất 3β-OH steroid có trong sao biển ...... 9 Hình 1.6. Các nhóm cấu trúc của hợp chất 3β-O-glycosylsteroid B2 ..................... 12 Hình 1.7. Cấu trúc của các dẫn xuất ceramide........................................................ 22 Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của Neu5Ac, Neu5Gc và GalNAc ............................... 26 Hình 1.9. Cấu trúc của GM1-GM3 ........................................................................ 26 Hình 2.1. Ảnh mẫu sao biển Anthenea sibogae ...................................................... 34 Hình 2.2. Ảnh mẫu sao biển Anthenea aspera ....................................................... 35 Hình 3.1. Sơ đồ chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu sao biển A. sibogae ........... 41 Hình 4.1.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB1 ....................................................... 51 Hình 4.1.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB1 ...................................................... 52 Hình 4.1.3. Phổ DEPT của hợp chất ASB1 ............................................................ 52 Hình 4.1.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất ASB1 ................................................. 53 Hình 4.1.5. Phổ HSQC của hợp chất ASB1 ........................................................... 53 Hình 4.1.6. Phổ HMBC của hợp chất ASB1 .......................................................... 54 Hình 4.1.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của ASB1 ........... 54 Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB1 .................................................. 55 Hình 4.1.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB2 ....................................................... 56 Hình 4.1.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB2 .................................................... 57 Hình 4.1.11. Phổ HSQC của hợp chất ASB2 ......................................................... 57 Hình 4.1.12. Phổ HMBC của hợp chất ASB2 ........................................................ 58 Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất ASB2 ................ 58 Hình 4.1.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB3 ..................................................... 59 Hình 4.1.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB3 ................................................... 59 Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB3 ................................................ 60 Hình 4.1.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB4 ..................................................... 61
Hinh 4.1.18. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB4 .................................................... 61 Hình 4.1.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB4 ................................................ 62 Hình 4.1.20. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB5............................................ 63 Hình 4.1.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB5 ..................................................... 64 Hình 4.1.22. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB5. ................................................... 64 Hình 4.1.23. Phổ COSY của hợp chất ASB5. ........................................................ 66 Hình 4.1.24. Phổ HSQC của hợp chất ASB5 ......................................................... 66 Hình 4.1.25. Phổ HMBC của hợp chất ASB5 ........................................................ 67 Hình 4.1.26. Phổ ROESY của hợp chất ASB5 ....................................................... 68 Hình 4.1.27. Các tương tác COSY, HMBC và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB5 .............................................................................................................................. 69 Hình 4.1.28. Phổ 1D TOCSY của hai đơn vị đường............................................... 69 Hình 4.1.29. Cấu trúc hóa học của ASB5 và anthenoside R ................................... 72 Hình 4.1.30. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB6............................................ 72 Hình 4.1.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB6 ..................................................... 73 Hình 4.1.32. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB6 .................................................... 74 Hình 4.1.33. Phổ COSY của hợp chất ASB6 ......................................................... 74 Hình 4.1.34. Phổ HSQC của hợp chất ASB6 ......................................................... 75 Hình 4.1.35. Phổ HMBC của hợp chất ASB6 ........................................................ 75 Hình 4.1.36. Phổ ROESY của hợp chất ASB6 ....................................................... 76 Hình 4.1.37. Các tương tác HMBC, COSY và ROESY chìa khóa của hợp chất ASB6 .............................................................................................................................. 76 Hình 4.1.38. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB7............................................ 79 Hình 4.1.39. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB7 ..................................................... 79 Hình 4.1.40. Phổ COSY của hợp chất ASB7 ......................................................... 80 Hình 4.1.41.Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB7 và hợp chất tham khảo ASB5 ... 81 Hình 4.1.42. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất ASB8 ................................................ 83 Hình 4.1.43. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB8 ..................................................... 84 Hình 4.1.44. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB8 .................................................... 84 Hình 4.1.45. Phổ COSY của hợp chất ASB8 ......................................................... 85 Hình 4.1.46. Phổ HSQC của hợp chất ASB8 ......................................................... 85 Hình 4.1.47. Phổ HMBC của hợp chất ASB8 ........................................................ 86
Hình 4.1.48. Phổ ROESY của hợp chất ASB8 ....................................................... 86 Hình 4.1.49. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chìa khóa của hợp chất ASB8 .............................................................................................................................. 87 Hình 4.1.50. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB8 và hợp chất tham khảo ASB5 .. 87 Hình 4.1.51. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB9............................................ 89 Hình 4.1.52. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB9 ..................................................... 90 Hình 4.1.53. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB9 .................................................... 91 Hình 4.1.54. Phổ COSY của hợp chất ASB9 ......................................................... 92 Hình 4.1.55. Phổ HSQC của hợp chất ASB9 ......................................................... 92 Hình 4.1.56. Phổ HMBC của hợp chất ASB9 ........................................................ 93 Hình 4.1.57. Phổ ROESY của hợp chất ASB9 ....................................................... 93 Hình 4.1.58. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất ASB9 94 Hình 4.1.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB9 và anthenoside M .................... 94 Hình 4.1.60. Phổ (+)HR-ESI-MS của hợp chất ASB10.......................................... 96 Hình 4.1.61. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB10.................................................... 97 Hình 4.1.62. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB10 .................................................. 98 Hình 4.1.63. Phổ COSY của hợp chất ASB10 ....................................................... 98 Hình 4.1.64. Phổ HSQC của hợp chất ASB10 ....................................................... 99 Hình 4.1.65. Phổ HMBC của hợp chất ASB10 ...................................................... 99 Hình 4.1.66.Phổ ROESY của hợp chất ASB10 .................................................... 100 Hình 4.1.67. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất ASB10 ...... 100 Hình 4.1.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất ASB10 và hợp chất anthenoside S ... 101 Hình 4.1.69. Phổ 1H-NMR của hợp chất ASB11.................................................. 104 Hình 4.1.70. Phổ 13C-NMR của hợp chất ASB11 ................................................ 104 Hình 4.1.71. Phổ HSQC của hợp chất ASB11 ..................................................... 105 Hình 4.1.72. Phổ HMBC của hợp chất ASB11 .................................................... 105 Hình 4.1.73. Cấu trúc hóa học của AS11 ............................................................. 106 Hình 4.2.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA2 ....................................................... 110 Hình 4.2.2. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA2 ...................................................... 110 Hình 4.2.3. Phổ DEPT của hợp chất AA2 ............................................................ 111 Hình 4.2.4. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA2 ................................................. 111 Hình 4.2.5. Phổ HSQC của hợp chất AA2 ........................................................... 112
Hình 4.2.6. Phổ HMBC của hợp chất AA2 .......................................................... 112 Hình 4.2.7. Các tương tác chìa khóa trên phổ COSY và HMBC của AA2 ........... 113 Hình 4.2.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA2 .................................................. 113 Hình 4.2.9. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA3 ....................................................... 115 Hình 4.2.10. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA3 ..................................... 116 Hình 4.2.11. Phổ HMBC của hợp chất AA3 ........................................................ 116 Hình 4.2.12. Các tương tác HMBC chìa khóa của hợp chất AA3 ......................... 117 Hình 4.2.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA3 ................................................ 117 Hình 4.2.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA4 ..................................................... 119 Hình 4.2.15. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA4 ..................................... 119 Hình 4.2.16. Phổ COSY 1H-1H của hợp chất AA4 ............................................... 120 Hình 4.2.17. Phổ HSQC của hợp chất AA4 ......................................................... 120 Hình 4.2.18. Phổ HMBC của hợp chất AA4 ........................................................ 121 Hình 4.2.19. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA4............... 121 Hình 4.2.20. Phổ NOESY của hợp chất AA4 ....................................................... 122 Hình 4.2.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA4 ................................................ 122 Hình 4.2.22. Phổ 1H-NMR của AA5 .................................................................... 124 Hình 4.2.23. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA5 ..................................... 125 Hình 4.2.24. Phổ COSY của hợp chất AA5 ......................................................... 125 Hình 4.2.25. Phổ HSQC của hợp chất AA5 ......................................................... 126 Hình 4.2.26. Phổ HMBC của hợp chất AA5 ........................................................ 126 Hình 4.2.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA5 và L-Gly-L-Pro (AA6) ............ 128 Hinh 4.2.29. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA6 .................................................... 129 Hình 4.2.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất L-Gly-L-Pro ................................... 129 Hình 4.2.32. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA7 ..................................................... 131 Hình 4.2.33. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AA7 ..................................... 132 Hình 4.2.34. Phổ COSY của hợp chất AA7 ......................................................... 132 Hình 4.2.35. Phổ HSQC của hợp chất AA7 ......................................................... 133 Hình 4.2.36. Phổ HMBC của hợp chất AA7 ........................................................ 133 Hình 4.2.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA7 ................................................ 134 Hình 4.2.38. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA8 ..................................................... 135 Hình 4.2.39. Phổ C-NMR của hợp chất AA8 ....................................................... 135
Hình 4.2.40. Phổ COSY của hợp chất AA8 ......................................................... 136 Hình 4.2.41. Phổ HSQC của hợp chất AA8 ......................................................... 136 Hình 4.2.42. Phổ HMBC của hợp chất AA8 ........................................................ 137 Hình 4.2.43. Tương tác COSY và HMBC chìa khóa của hợp chất AA8............... 137 Hình 4.2.44. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA9 ..................................................... 139 Hình 4.2.45. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA9 .................................................... 139 Hình 4.2.46. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA9 ................................................ 139 Hình 4.2.48. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA10 .............................................. 141 Hình 4.2.49. Phổ 1H-NMR của hợp chất AA11 ................................................... 141 Hình 4.2.50. Phổ 13C-NMR của hợp chất AA11 .................................................. 142 Hình 4.2.51. Cấu trúc hóa học của hợp chất AA11 .............................................. 142 Hình 4.3.2. Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú T-47D của các chất ASB5, ASB6, ASB8 và hỗn hợp ASB11 so sánh với mẫu chứng .................................... 144
1 MỞ ĐẦU Việt Nam được thiên nhiên ưu đãi với hơn 1 triệu km 2 vùng biển, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, mật độ cửa sông dày đặc là những điều kiện lý tưởng cho hệ sinh vật biển đa dạng về chủng loại và giàu về trữ lượng. Ngay từ những năm 1970 đã có một vài công trình nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển. Tuy nhiên, so với nguồn tiềm năng sinh vật biển ở nước ta thì đến nay những công trình nghiên cứu trong nước vẫn quá ít và tản mát, đặc biệt là những nghiên cứu về ngành Da gai. Sao biển là loài động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai, đã từ lâu được biết đến như một loại thực phẩm bổ dưỡng. Theo thống kê, hiện nay, trên thế giới có khoảng 1800 loài sao biển khác nhau. Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 80 loài được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. Trong đó họ Oreasteridae gồm có 20 chi : Acheronaster, Anthaster, Anthenea, Astrosarkus, Bothriaster, Choriaster, Culcita, Goniodiscaster…. Hiện nay trên thế giới chỉ có 9 loài thuộc họ Oreasterdae được nghiên cứu trong đó có 2 loài đã được nghiên cứu ở Việt Nam đó là Anthenea chinensis và Culcita novaeguineae. Kết quả của những nghiên cứu đó cho thấy rằng, những chất được phân lập từ sao biển họ Oreasteridae có khả năng kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, gây độc tế bào, kháng khuẩn, kháng nấm và kháng một số dòng tế bào ung thư. Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Anthenea đăng trên tạp chí quốc tế uy tín còn chưa nhiều. Chính vì thế nhiệm vụ luận án này tập trung nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ một số loài sao biển chi Anthenea ở vùng biển Việt Nam. Đối tượng được tập trung nghiên cứu là loài sao biển Anthenea sibogae và sao biển Anthenea aspera. Xuất phát từ điểm đó, đề tài “Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học hai loài sao biển Anthenea sibogae và Anthenea aspera của Việt Nam” được thực hiện với những nội dung chính như sau:  Phân lập các hợp chất từ hai loài sao biển Anthenea aspera và Anthenea sibogae thu thập từ vùng biển Việt Nam.  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.  Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của một số chất phân lập được.
2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1. 1. Giới thiệu về sao biển 1.1.1. Cấu tạo của sao biển và phân bố Sao biển là động vật không xương sống thuộc lớp Asteroidea, ngành Da gai (Echinodermata). Có khoảng 1800 loài sao biển sống ở tất cả các đại dương trên thế giới từ vùng biển nhiệt đới đến vùng biển lạnh, từ bãi triều đến đáy biển sâu. Là một động vật biển thuần túy, thế nên không có loài sao biển nào sống trong môi trường nước ngọt và chỉ một số ít sống trong môi trường nước lợ. Tên gọi “sao biển” bắt nguồn từ hình dạng có 5 cánh của đa số các loài, tuy nhiên cũng có những loài có đến 10, 20 thậm chí 40 cánh [1]. Đặc biệt, sao biển Labidiaster annulatus sống ở Nam Cực có tới hơn 50 cánh [2]. Sao biển được bao phủ bên ngoài bởi một lớp da gai, bên trong là khung xương rất cứng giúp bảo vệ chúng khỏi những kẻ săn mồi. Cơ thể sao biển thường có một đĩa trung tâm và năm cánh, một số ít loài có số lượng cánh tay lớn hơn. Bề mặt phía trên có thể mịn, dạng hạt hoặc gai, và được phủ bằng các tấm chồng lên nhau. Nhiều loài có màu sắc rực rỡ với các sắc thái khác nhau của màu đỏ hoặc cam, trong khi có những loài có màu xanh lam, xám hoặc nâu, có tác dụng ngụy trang hoặc đe dọa kẻ thù. Sao biển có chân ống được vận hành bởi một hệ thống thủy lực và một miệng ở trung tâm của bề mặt dưới. Sao biển không có đầu và việc di chuyển được thực hiện bởi hệ thống chân ống nằm phía dưới mỗi cánh tay. Tốc độ di chuyển rất chậm, khoảng 5-10 cm/phút. Thức ăn của chúng đa số là các động vật không xương sống, cá nhỏ ở tầng đáy, rong biển và cả san hô. Phần lớn sao biển đều có khả năng đặc biệt đó là tiêu hóa con mồi bên ngoài cơ thể. Chúng sử dụng những ống chân nhỏ xíu để mở vỏ trai hoặc hàu rồi sau đó đẩy dạ dày ra khỏi miệng và luồn vào bên trong con mồi. Tiếp đó chúng sẽ tóm lấy và tiêu hóa con mồi, và cuối cùng thu dạ dày trở lại cơ thể. Sao biển có vòng đời phức tạp và có thể sinh sản cả hữu tính và vô tính. Hầu hết sao biển có khả năng tái tạo các bộ phận bị hư hỏng hoặc cánh tay bị mất, đặc biệt có một số loài có thể tái tạo lại toàn bộ cơ thể từ một phần cánh tay bị đứt lìa.
3 Hình 1.1. Cấu tạo của sao biển (nguồn: inforvisual.info) Lớp Asteroidea đóng vai trò sinh thái quan trọng trong hệ sinh vật biển. Sao biển màu nâu đất Pisaster ochraceus và sao biển rạn san hô Stichaster australis, đã được biết đến rộng rãi như là các loài chìa khóa (keystone species) trong hệ sinh thái. Loài sao biển gai Acanthaster planci là loài tiêu diệt san hô ở khắp vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương và bắc Thái Bình Dương và được coi là một trong 100 loài xâm lấn tồi tệ nhất thế giới. Sao biển sản xuất một số lượng lớn các hợp chất thứ cấp ở dạng lipit, bao gồm các dẫn xuất steroid của cholesterol và amit axit béo của sphingosine. Các steroid chủ yếu ở dạng saponin, được gọi là asterosaponin, và các dẫn xuất sunfat hóa của chúng. Các chất này khác nhau tùy theo loài và có thể có đến tối đa sáu phân tử đường (thường là glucose và galactose). Ngoài ra, một số lượng nhỏ các alkaloid cũng đã được tìm thấy trong sao biển. Chức năng của các hợp chất này trong sao biển chưa được nghiên cứu đầy đủ nhưng hầu hết có vai trò trong phòng thủ và liên lạc. Một số chất được sử dụng bởi sao biển để ngăn chặn những kẻ săn mồi. Các chất chống đông máu và các peesellariae dạng chân kìm rất nhỏ có tác dụng ngăn chặn các sinh vật khác định cư trên bề mặt trên của sao biển. Nghiên cứu về tác dụng của các hợp chất này để sử dụng trong ngành y dược hoặc công nghiệp đang được tiến hành trên toàn thế giới [3]. Lớp sao biển Asteroidea được chia thành 7 bộ [4]: - Bộ Brisingida: có 18 chi thuộc 2 họ với khoảng 100 loài, chủ yếu sống dưới đáy biển sâu, cánh tay mỏng, chiều dài từ 6-16 cm. - Bộ Forcipulatida: có 68 chi thuộc 6 họ với khoảng 300 loài, có đặc điểm đặc trưng là cánh tay dạng kìm nhỏ.
4 - Bộ Notomyotida: có 12 chi thuộc 1 họ với khoảng 75 loài, là các loài sao biển sống dưới biển sâu với cánh tay rất linh hoạt và các sợi cơ dài dọc theo bề mặt hông bên trong cơ thể. - Bộ Paxillosida: có 46 chi thuộc 6 họ với khoảng 255 loài, nét đặc trưng là có cánh tay nhọn và có thể vùi cơ thể dưới các lớp bùn cát. - Bộ Spinulosida: có 7 chi thuộc 2 họ với khoảng 120 loài. Là các sao biển với bộ khung tương đối mảnh và chân dạng kìm nhỏ. - Bộ Valvatida: có 172 chi thuộc 17 họ với khoảng 695 loài. Cấu tạo khá đa dạng và thường có đặc điểm chung là xương mép nhỏ, 5 cánh với chân ống. - Bộ Velatida: có 25 chi thuộc 5 họ với khoảng 203 loài. Các loài sao biển thuộc bộ này thường có thân mỏng với vòng tròn trung tâm lớn và những chỗ lõm với đường kính lớn. 1.1.2. Các loài sao biển ở Việt Nam Các nghiên cứu về khu hệ động vật đáy vùng biển Đông trước năm 2003 chỉ ra có khoảng 56 loài sao biển được ghi nhận ở vùng biển Việt Nam [6]. Báo cáo gần đây của nhóm các nhà khoa học Nga (Antokhina và cs.) đưa ra danh mục gồm 79 loài sao biển tìm thấy ở vùng biển Việt Nam [7]. Tuy nhiên số liệu trên còn khá khiêm tốn so với 236 loài được phát hiện ở vùng biển Đông [8,9]. Do đó cần thiết phải có thêm các nghiên cứu về đa dạng loài sao biển tại Việt Nam. Các loài sao biển phân bố dọc bờ biển từ bắc vào nam và ở các độ sâu khác nhau. Hai vùng biển chứa số lượng sao biển đa dạng và phong phú nhất là vịnh Nha Trang và Vạn Bội – Cát Bà. Riêng ở vịnh Nha Trang, các nhà khoa học đã phát hiện được khoảng 20 loài sao biển thuộc 16 chi, 11 họ và 4 bộ khác nhau. Phần lớn các loài sao biển tìm thấy ở Việt Nam thuộc các bộ và họ sau: - Bộ Spinulosida: họ Echinasteridae - Bộ Valvatida: họ Oreasteridae, Ophidiasteridae, Archasteridae. - Bộ Paxillosida: họ Astropectinidae - Bộ Forcipulatida: họ Asteridae Một số loài thường được sử dụng làm thực phẩm, ngâm rượu, làm thuốc hoặc làm đồ mỹ nghệ. Theo y học cổ truyền phương Đông, sao biển là một vị thuốc có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống ung thư, bổ dương và kháng viêm.