Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:252

Thêm vào BST

Báo xấu

56
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam; khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO ĐỨC DANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO ĐỨC DANH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG SINH, GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ BA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES G246, G261, G248 THU THẬP TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. Habil Phạm Văn Cƣờng 2. TS. Trần Đăng Thạch Hà Nội - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Habil. Phạm Văn Cường và TS. Trần Đăng Thạch. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Toàn bộ các thông tin trích dẫn trong luận án được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ. Nghiên cứu sinh Cao Đức Danh
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kinh phí thực hiện từ đề tài thuộc đề tài VAST.TĐ.DLB.04/16-18 và VAST. ĐA47.12/16-19 . Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS. Habil. Phạm Văn Cường, TS. Trần Đăng Thạch đã chỉ ra hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin cảm ơn PGS. TS. Đoàn Thị Mai Hương và các anh chị trong phòng Tổng hợp hữu cơ, TS. Lê Thị Hồng Minh và các nhà khoa học phòng Công nghệ sinh học – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã quan tâm, giúp đỡ, thảo luận và đưa ra những chỉ dẫn cho luận án của tôi. Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Hương Khê, Ban Giám đốc Sở GD&ĐT Hà Tĩnh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học của mình. Tôi xin cảm ơn GS.TS. Đỗ Công Thung và các cán bộ kiêm thợ lặn Viện Tài nguyên và Môi trường biển đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt chuyến thu mẫu ngoài biển. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cơ sở đào tạo Viện Hóa sinh biển và Học viện Khoa học và công nghệ, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, các cán bộ phụ trách các nghiên cứu sinh đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Cao Đức Danh
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... i DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Sự phân bố và tính đa dạng của vi sinh vật biển .............................................. 3 1.2. Xạ khuẩn và sự hình thành các hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn ...................... 4 1.2.1. Xạ khuẩn (Actinobacteria)...........................................................................4 1.2.2. Sự hình thành các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học ở xạ khuẩn ....7 1.3. Các họ xạ khuẩn biển thƣờng gặp .................................................................... 8 1.3.1. Họ Streptomycetaceae ..................................................................................8 1.3.2. Họ Micromonosporaceae ..............................................................................8 1.3.3. Các họ khác của xạ khuẩn biển ..................................................................9 1.4. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn biển ........................ 9 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................... 9 1.4.1.1. Các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ..................................................9 1.4.1.2. Các hợp chất có hoạt tính kháng lao .................................................15 1.4.1.3. Các hợp chất có hoạt tính chống ung thư và gây độc tế bào .............18 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ..........................................................26 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 32 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu......................................................................... 32 2.1.1. Vật liệu ......................................................................................................32 2.1.2. Hóa chất....................................................................................................32 2.1.3. Thiết bị ......................................................................................................33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 33 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu .....................................................................33 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn biển [74-76].......................................34 2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch các chủng bằng que cấy vòng [74, 77] ...........35 2.2.4. Phƣơng pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập [74, 77, 78] ......................35 2.2.5. Phƣơng pháp hoạt hoá và nuôi cấy [74, 77, 78] ......................................35
2.2.6. Phƣơng pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh học .............................................................................................................................36 2.2.7. Phƣơng pháp định danh xạ khuẩn .......................................................36 2.2.7.1. Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn ...........................................36 2.2.7.2. Phương pháp phân loại xạ khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử ..36 2.2.8. Phƣơng pháp sinh khối lƣợng lớn [83]...................................................38 2.2.9. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất thứ cấp. ........................................39 2.2.10. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc .39 2.2.11. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ....................39 2.2.13. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng lao [86]. .........................................42 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ...................................................... 43 3.1. Kết quả thu mẫu ................................................................................................43 3.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn .............................................................43 3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc. ...............................43 3.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 ..........................46 3.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu ...............................46 3.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom ....................................................................47 3.4.3. Giải trình tự gen ........................................................................................48 3.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 ...........48 3.6. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G246 ..................................................................................50 3.6.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết ...........................................................................50 3.6.2. Phân lập các chất từ các cặn chiết ...........................................................50 3.6.3. Thông số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G246..............................................................................................52 3.6.3.1. Hợp chất G246-1: 6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone ......................................................................................52 3.6.3.2. Hợp chất G246-2: 5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′- tetrahydroxylchalcone ....................................................................................52 3.6.3.3. Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly)..................................................53 3.6.3.4. Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr)...........................................53 3.6.3.5. Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) ..........................................53
3.6.3.6. Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala) ..................................................53 3.6.3.7. Hợp chất G246-7: norharman ........................................................53 3.6.3.8. Hợp chất G246-8: tryptophan..........................................................54 3.6.3.9. Hợp chất G246-9: indol-3-carboxylic acid .....................................54 3.6.3.10. Hợp chất G246-10: phenyl alanin .................................................54 3.7. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 ................................................................................54 3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết ...........................................................................54 3.7.2. Phân lập các chất từ cặn chiết của chủng Streptomyces sp. G261 ........55 3.7.3 Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 ........................................................................................57 3.7.3.1. Hợp chất G261-1: norharman ..........................................................57 3.7.3.2. Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol ..................................................57 3.7.3.3. Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid ...................................57 3.7.3.5. Hợp chất G261-5: 3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid ......................57 3.7.3.6. Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide .......................................58 3.7.3.7. Hợp chất G261-7: phenyl alanine ....................................................58 3.7.3.8. Hợp chất G261-8: cyclo-(pro-gly) ....................................................58 3.7.3.9. Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala) ...................................................58 3.7.3.10. Hợp chất G261-10: cyclo-(Leu-Pro) ..............................................58 3.7.3.11. Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr) ...............................................58 3.7.3.12. Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) ..........................59 3.8. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 ................................................................................59 3.8.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết ...........................................................................59 3.8.2. Phân lập các chất từ các cặn chiết ..........................................................60 3.8.3. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 ............................................................62 3.8.3.1. Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro – Leu) ................................................62 3.8.3.2. Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe) ..................................................63 3.8.3.3. Hợp chất G248-3: norharman ..........................................................63 3.8.3.4. Hợp chất G248-4: cyclo (Pro-Tyr) ...................................................63
3.8.3.5. Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly)...................................................63 3.8.3.6. Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp)...................................................64 3.8.3.7. Hợp chất G248-7: adenine ...............................................................64 3.8.3.8. Hợp chất G248-8: 2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid ..........................64 3.8.3.9. Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone .......................................................................................64 3.8.3.10. Hợp chất G248-10: (2S)-6-prenyl-4′-methoxy-5,7- dihydroxylflavanone .......................................................................................64 3.8.3.11. Hợp chất G248-11: (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′- tetrahydroxylflavanone ..................................................................................64 3.8.3.12. Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone ....................................................................................65 3.8.3.13. Hợp chất G248-13: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone ......................................................................................65 3.9. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc ................65 3.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSVKĐ của các hợp chất .......................65 3.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của các hợp chất phân lập đƣợc ........65 3.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc .65 CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ............................................................... 68 4.1. Kết quả thu mẫu ...............................................................................................68 4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn ...........................................................68 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu đƣợc. .............................68 4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248 ........................69 4.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu ................................69 4.4.2. Nhân gen 16S ARN riboxom .....................................................................69 4.4.3. Giải trình tự gen xác định tên các chủng xạ khuẩn .................................70 4.5. Kết quả sinh khối lƣợng lớn các chủng xạ khuẩn G246, G261, G248. .......70 4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G246 ................................................................................70 4.6.1. Hợp chất G246-1: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone (hợp chất mới) .................................................................70
4.6.2. Hợp chất G246-2: (2″S)-5′-lavandulyl-4′-methoxy-2,4,2′,6′- tetrahydroxylchalcone (hợp chất mới) ...............................................................77 4.6.3. Hợp chất G246-3: cyclo-(Pro-Gly) ...........................................................83 4.6.4. Hợp chất G246-4: cyclo-(L-Pro-L-Tyr) ...................................................84 4.6.5. Hợp chất G246-5: cyclo-(D-Pro-L-Tyr) ...................................................85 4.6.6. Hợp chất G246-6: cyclo-(Pro-Ala) ...........................................................86 4.6.7. Hợp chất G246-7: norharman .................................................................87 4.6.8. Hợp chất G246-8: tryptophan ..................................................................88 4.6.9. Hợp chất G246-9: indole-3-carboxylic acid ............................................88 4.6.10. Hợp chất G246-10: phenyl alanin .........................................................89 4.6.11. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G246 .............................................................................................................................90 4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G261 ................................................................................91 4.7.1. Hợp chất G261-1: norharman .................................................................91 4.7.2. Hợp chất G261-2: butane-2,3-diol ...........................................................91 4.7.3. Hợp chất G261-3: pyrrole-2-carboxylic acid ...........................................92 4.7.4. Hợp chất G261-4: 2-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]oxazole-4-carboxylic acid .............................................................................................................................92 4.7.5. Hợp chất G261-5: acid 3-hydroxy-4-methoxybenzoic ............................95 4.7.6. Hợp chất G261-6: 2-acetamidobenzamide ..............................................96 4.7.7. Hợp chất G261-7: phenylalanin ..............................................................96 4.7.8. Hợp chất G261-8: cyclo-(Pro-Gly) ...........................................................97 4.7.9. Hợp chất G261-9: cyclo-(Pro-Ala) ...........................................................97 4.7.10. Hợp chất G261-10: cyclo-(Pro-Leu) ......................................................98 4.7.11. Hợp chất G261-11: cyclo-(Pro-Tyr) .......................................................99 4.7.12. Hợp chất G261-12: cyclo-trans-4-OH-(Pro-Phe) ...............................100 4.7.13. Hợp chất G261-13: cyclo-(Leu-Tyr) ....................................................101 4.7.14. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G261 ...........................................................................................................................102 4.8. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G248 ..............................................................................103
4.8.1. Hợp chất G248-1: cyclo-(Pro-Leu) ........................................................103 4.8.2. Hợp chất G248-2: cyclo-(Pro-Phe) ........................................................103 4.8.3. Hợp chất G248-3: norharman ...............................................................104 4.8.4. Hợp chất G248-4: cyclo-(Pro-Tyr) .........................................................105 4.8.5. Hợp chất G248-5: cyclo-(Pro-Gly) .........................................................105 4.8.6. Hợp chất G248-6: cyclo-(Pro-Trp) ........................................................106 4.8.7. Hợp chất G248-7: adenine .....................................................................107 4.8.9. Hợp chất G248-9: (2S,2″S)-6-lavandulyl-7,4′-dimethoxy-5,2′- dihydroxylflavanone .........................................................................................108 4.8.10. Hợp chất G248-10: 6-prenyl-4′-methoxy-5,7-dihydroxylflavanone ...115 4.8.11. Hợp chất G248-11: (2S,2″S)-6-lavandulyl-5,7,2′,4′- tetrahydroxylflavanone .....................................................................................116 4.8.12. Hợp chất G248-12: (2″S)-5′-lavandulyl-2′-methoxy-2,4,4′,6′- tetrahydroxylchalcone ......................................................................................119 4.8.13. Hợp chất G248-13:(2S,2″S)-6-lavandulyl-7-methoxy-5,2′,4′- trihydroxylflavanone.........................................................................................125 4.8.14. Tổng hợp các hợp chất phân lập đƣợc từ chủng Streptomyces sp. G248 ...........................................................................................................................126 4.9. Biện luận kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc từ các chủng xạ khuẩn. .........................................................................................127 4.9.1. Kết quả thử hoạt tính đối với VSV kiểm định của một số hợp chất. ....127 4.9.2. Kết quả thử hoạt tính kháng lao của một số hợp chất ..........................128 4.9.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc ..... ..............................................................................................................128 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 129 * KẾT LUẬN ........................................................................................................ 129 * KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .......................................... 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 132
i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Thành phần hóa học của các nhóm vi khuẩn .............................................6 Bảng 3. 1. Giá trị MIC của cặn chiết EtOAc của các chủng được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. ................................................................................................44 Bảng 3. 2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng lao của các chủng nghiên cứu ............45 Bảng 3. 3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào KB của cặn chiết EtOAc của dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn phân lập được. ............................................................45 Bảng 3. 4. Điều kiện nuôi cấy lượng lớn của 3 chủng nghiên cứu ...........................49 Bảng 3. 5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được đối với VSVKĐ .....................................................................................................................66 Bảng 3. 6. Kết quả thử hoạt tính kháng lao một số chất phân lập được ...................67 Bảng 3. 7. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 14 hợp chất tách chiết từ các chủng nghiên cứu G246, G261 và G248 đối với 4 dòng tế bào thử nghiệm............67 Bảng 4. 1. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-1 và hợp chất tham khảo .............71 Bảng 4. 2. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-2 và chất so sánh G246-1 ...........78 Bảng 4. 3. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-3 và hợp chất tham khảo .............84 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-4 và hợp chất tham khảo ..............85 Bảng 4. 5. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-5 và hợp chất tham khảo .............86 Bảng 4. 6. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-6 ..................................................87 Bảng 4. 7. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-7 và hợp chất tham khảo .............88 Bảng 4. 8. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-9 và hợp chất tham khảo .............89 Bảng 4. 9. Số liệu phổ NMR của hợp chất G246-10 và hợp chất tham khảo ...........90 Bảng 4. 10. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-7 và hợp chất tham khảo ...........96 Bảng 4. 11. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-8 và hợp chất tham khảo ...........97 Bảng 4. 12. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-9 và hợp chất tham khảo ...........98 Bảng 4. 13. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-10 và hợp chất tham khảo .........99
ii Bảng 4. 14. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-12 và hợp chất tham khảo .......100 Bảng 4. 15. Số liệu phổ NMR của hợp chất G261-13 và hợp chất tham khảo .......101 Bảng 4. 16. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-2 và hợp chất tham khảo .........104 Bảng 4. 17. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-6 và hợp chất tham khảo .........106 Bảng 4. 18. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-9 và hợp chất tham khảo ........109 Bảng 4. 19. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-10 và hợp chất tham khảo ......116 Bảng 4. 20. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-11 và chất tham khảo .............119 Bảng 4. 21. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G248-12 và hợp chất tham khảo ......120 Bảng 4. 22. Số liệu phổ NMR của hợp chất G248-13 và hợp chất tham khảo .......126
iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1. Cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Gram dương và Gram âm. ..................6 Hình 1. 2. Cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn lao .....................................................16 Hình 4. 1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G246-1 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo. ......................................70 Hình 4. 2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất G246- 1 ...................................................73 Hình 4. 3. Phổ 1H NMR hợp chất G246-1: (500.13 MHz, CD3OD) ........................73 Hình 4. 4. Phổ 13C NMR của hợp chất G246-1: 125.76 MHz, CD3OD ...................74 Hình 4. 5. Phổ DEPT của hợp chất G246-1: 125.76 MHz, CD3OD.........................74 Hình 4. 6. Phổ 1H-1H COSY của hợp chất G246-1: 500.13 MHz, CD3OD .............75 Hình 4. 7. Phổ HSQC của hợp chất G246-1 .............................................................75 Hình 4. 8. Phổ HMBC của G246-1 ..........................................................................76 Hình 4. 9. Phổ NOESY của G246-1: 500.13 MHz, CD3OD ....................................76 Hình 4. 10. Phổ CD và ECD cho 2 đồng phần 2S,2″S- và 2S,2″R- của G246-1 ......77 Hình 4. 11. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G246-2 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo G246-1 .........................77 Hình 4. 12. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất G246-2 ..................................................79 Hình 4. 13. Phổ 1H NMR của hợp chất G246-2: 500.13 MHz, CDCl3 ....................80 Hình 4. 14. Phổ 13C NMR của hợp chất G246-2: 125.76 MHz, CDCl3 ...................80 Hình 4. 15. Phổ 1H-1H COSY của hợp chất G246-2: 500.13 MHz, CDCl3 ..............81 Hình 4. 16. Phổ HSQC của hợp chất G246-2 ...........................................................81 Hình 4. 17. Phổ HMBC của hợp chất G246-2 ..........................................................82 Hình 4. 18. Phổ NOESY của hợp chất G246-2 (500.13 MHz, CDCl3) ....................82 Hình 4. 19. Phổ CD và phổ CD tính toán 2 đồng phần 2″S- và 2″R- của G246-2 ...83 Hình 4. 20. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-3 ..................................................83 Hình 4. 21. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-4 ..................................................84
iv Hình 4. 22. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-5 ..................................................85 Hình 4. 23. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-6 ..................................................86 Hình 4. 24. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G246-7........................................................................................................87 Hình 4. 25. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-8 ..................................................88 Hình 4. 26. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-9 ..................................................89 Hình 4. 27. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-10 ................................................89 Hình 4. 28. Cấu trúc hóa học của hợp chất G246-1 đến G246-10 ...........................90 Hình 4. 29. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1 ..................................................91 Hình 4. 30. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-2 ..................................................91 Hình 4. 31. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-3 ..................................................92 Hình 4. 32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của G261-4 ..........92 Hình 4. 33. Phổ HR-MS chất G261-4 .......................................................................93 Hình 4. 34. Phổ 1H-NMR (500 MHz; CD3OD) của chất G261-4 ............................93 Hình 4. 35. Phổ 13C-NMR (500 MHz; CD3OD) của chất G261-4 ...........................94 Hình 4. 36. Phổ HSQC của chất G261-4 ..................................................................94 Hình 4. 37. Phổ HMBC của chất G261-4 .................................................................95 Hình 4. 38. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-5 ..................................................95 Hình 4. 39. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-6 ..................................................96 Hình 4. 40. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-7 ..................................................97 Hình 4. 41. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-8 ..................................................97 Hình 4. 42. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-9 ..................................................97 Hình 4. 43. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-10 ................................................98 Hình 4. 44. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-11 ................................................99 Hình 4. 45. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-12 ..............................................100 Hình 4. 46. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-13 ..............................................101
v Hình 4. 47. Cấu trúc hóa học của hợp chất G261-1 đến G261-13 .........................102 Hình 4. 48. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1 ................................................103 Hình 4. 49. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-2 ................................................103 Hình 4. 50. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-3 ................................................104 Hình 4. 51. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-4 ................................................105 Hình 4. 52. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-5 ................................................105 Hình 4. 53. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-6 ................................................106 Hình 4. 54. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-7 ................................................107 Hình 4. 55. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-8 ................................................107 Hình 4. 56. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G248-9 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo. ....................................108 Hình 4. 57. Phổ khối HR-ESI-MS của hợp chất G248-9........................................110 Hình 4. 58. Phổ IR của hợp chất G248-9 ................................................................111 Hình 4. 59. Phổ 1H-NMR (500 MHz; CD3OD) của hợp chất G248-9 ..................111 Hình 4. 60. Phổ 13C NMR của hợp chất G248-9: 125.76 MHz, CD3OD ...............112 Hình 4. 61. Phổ DEPT của hợp chất G248-9: 125.76 MHz, CD3OD.....................112 Hình 4. 62. Phổ 1H-1H COSY của hợp chất G248-9: 500.13 MHz, CD3OD .........113 Hình 4. 63. Phổ HMBC của G248-9 ......................................................................113 Hình 4. 64. Phổ HSQC của hợp chất G248-9 ........................................................114 Hình 4. 65. Phổ ROESY của hợp chất G248-9 (1H: 500.13 MHz) ........................114 Hình 4. 66. Phổ CD và phổ ECD của 2 đồng phân 2S,2″S- và 2S,2″R- G248-9 ....115 Hình 4. 67. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-10 ..............................................115 Hình 4. 68. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G248-11 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo ...................................116 Hình 4. 69. Phổ CD và ECD cho 2 đồng phân 2S,2″S- và 2S,2″R- G248-11 .........118
vi Hình 4. 70. Cấu trúc hóa học, các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất G248-12 và cấu trúc hóa học hợp chất tham khảo ..........................................119 Hình 4. 71. Phổ HR- ESI-MS của hợp chất G248-12 ............................................121 Hình 4. 72. Phổ 1H-NMR (500 MHz; CD3OD) của hợp chất G248-12 ................122 Hình 4. 73. Phổ 13C NMR của hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD .............122 Hình 4. 74. Phổ DEPT của hợp chất G248-12: 125.76 MHz, CD3OD...................123 Hình 4. 75. Phổ 1H-1H COSY của hợp chất G248-12: 500.13 MHz, CD3OD .......123 Hình 4. 76. Phổ HMBC của G248-12 .....................................................................124 Hình 4. 77. HSQC của hợp chất G248-12 ..............................................................124 Hình 4. 78. Phổ CD và ECD của 2 đồng phân 2″S- G248-12 và 2″R-G248-12 .....125 Hình 4. 79. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-13 ..............................................125 Hình 4. 80. Cấu trúc hóa học của hợp chất G248-1 đến G248-13 .........................127
vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Diễn giải TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng CC Column Chromatography Sắc ký cột RP Reverse Phase Sắc ký pha đảo ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khối phun mù điện tử Spectroscopy HRESI-MS High-resolution Electrospray Phổ khối phân giải cao phun mù Ionization Mass Spectroscopy điện tử 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác hai chiều trực tiếp Correlation dị hạt nhân HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác đa liên kết hai Correlation chiều dị hạt nhân NOESY: Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy: IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào thử nghiệm OD Optical density Mật độ quang TMS Tetramethyl silan (CH3)4Si ppm Part per million Phần triệu RNA Ribonucleic Acid Ribonucleic Acid SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét UIC University of Illinois at Trường đại học Ilinois Chicago Chicago UV Ultraviolet Tia cực tím DMSO: Dimethylsulfoxide (CH3)2SO DNA Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic MRSA Methicillin-Resistant Tụ cầu khuẩn Staphylococcus Staphylococcus Aureus Aureus kháng Methicillin MIC Minimal Inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration G- Gram - Gram âm G+ Gram + Gram dương
viii Ký hiệu Diễn giải KS Kháng sinh HTKS Hoạt tính kháng sinh VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn δH, δC Độ chuyển dịch hóa học của proton, cacbon CTPT Công thức phân tử CKS Chất kháng sinh
1 MỞ ĐẦU Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá. Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số đó có rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000.000 km2) có hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển. Chính phủ Việt Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển. Tuy nhiên nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động vật. Khoảng nửa sau thế kỷ 19, người ta đã phát hiện vi sinh vật chính là nguyên nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm. Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây bệnh đã được phát triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh và được Abraham, Chain, Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941. Thuốc kháng sinh Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người trong chiến tranh thế giới II. Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn. Hiện nay, đã có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Nhưng càng ngày càng nhiều các vi sinh vật
2 gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm, phát hiện các loại kháng sinh mới, các hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư. Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện các hợp chất có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào từ nguồn vi sinh vật đáy biển miền Trung của Việt Nam, cụ thể là: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam. - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này. Nhiệm vụ nghiên cứu: - Tổng quan tài liệu các nghiên cứu trước đây về các hợp chất thứ cấp cũng như hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật biển. - Tìm các quy trình xử lý dịch nuôi cấy để tạo dịch chiết. Tinh chế các cặn dịch chiết này trên sắc ký cột để thu được các phân đoạn. - Tinh chế các chất có trong các phân đoạn để thu được các hợp chất sạch. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được. - Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các chất phân lập được. - Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với một số dòng tế bào ung thư như KB, MCF-7, Hep-G2, Lu-1 của các hợp chất sạch phân lập được.