Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:142

Thêm vào BST

Báo xấu

83
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của luận án là: Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây..; phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị cao tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …………***………… NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Ngọc Tú 2. PGS.TS. Dương Anh Tuấn HÀ NỘI, NĂM 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu i
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn, những người Thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới GS. VS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Văn Lạng, đã giới thiệu, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CNC, Ban Quản lý Khu CNC Hòa Lạc đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Sinh dược, các Thầy, Cô và bạn bè đồng nghiệp tại Viện Hóa học (đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh, các bạn Đức, Thủy, Minh, Hiền, Dung...), các đồng nghiệp tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã tận tình truyền thụ kiến thức, cùng phối hợp cũng như giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành các nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, luôn là nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC......................................................................................................... ii DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi DANH MỤC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................ x CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 5 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật........... 5 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật ........................ 9 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu............................................................... 9 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh .................................................. 12 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam ......................................................................................................... 13 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới ................................................................................................. 14 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật .......................................................... 14 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 15 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................................................................................................................... 23 1.5.1. Thực vật học.......................................................................................... 23 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học............................................ 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 33 iii
2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 33 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ....................................................................................... 34 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật............................................. 35 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật ............................. 35 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS .......... 35 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu ......................... 37 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 37 2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 37 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 38 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm................................... 39 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm ................................................................... 39 2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm ......................................................... 41 2.4. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật .................. 42 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44 3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật ....................... 45 3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................. 45 3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) ............... 51 3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) ................. 55 3.2. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 56 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) ............ 56 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) ................ 62 3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) ................... 63 3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)................ 65 iv
3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M. hawaiiensis)..................................................................................................... 68 3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F. oxysporum) ...................................................................................................... 70 3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F. solani)73 3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và chất sạch .......................................................................................................... 74 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 76 4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật76 4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật77 4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 81 4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla) ..................................................................................................... 81 4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.).................... 90 4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.).................... 92 4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu .......... 94 4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng ........ 97 4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không............ 102 4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học thực vật và nấm nội sinh thực vật ................................................................. 104 4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu ................................................................... 104 4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng.................................................. 105 4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không................................................ 106 v
KẾT LUẬN ................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 111 DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải Carbon-13 nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt 13C-NMR magnetic nhân cacbon 13 resonance spectroscopy Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt 1H-NMR resonance spectroscopy nhân proton CC Column chromatography Sắc kí cột Phổ tương tác 2 chiều COSY Correlation spectroscopy đồng hạt nhân 1H-1H Distortionless DEPT enhancement by Phổ DEPT polarisation transfer DMSO Dimethyl sulfoxide Electron spray ionization Phổ khối lượng ion hóa ESI-MS mass spectra phun mù điện tử Heteronuclear mutiple Phổ tương tác dị hạt nhân HMBC bond connectivity qua nhiều liên kết High resolution Phổ khối lượng phân giải HR-ESI-MS electronspray cao phun mù điện tử ionization mass spectrum Phổ tương tác dị hạt nhân HSQC Heteronuclear single- qua 1 liên kết vi
quantum coherence NOESY Nuclear overhauser effect Phổ NOESY Spectroscopy IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại Inhibitory concentration at Nồng độ ức chế 50% đối IC50 50% tượng thử nghiệm RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 Thin layer TLC Sắc ký lớp mỏng chromatography TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan Polymerase Chain Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR Reaction DNA, Deoxyribonucleic ADN Vật chất di truyền Acid ITS Internal transcribed spacer Môi trường nuôi cấy PDA Potato dextrose agar khuẩn nấm gồm khoai tây, đường, agar Môi trường nuôi cấy MEA Malt extract Agar khuẩn nấm gồm mạch nha và agar rRNA Ribosomal RNA RNA ribosome vii
DANH MỤC BẢNG Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) của các mẫu dịch chiết cây ngâu.................................................................................. 77 Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực vật .................................................................................................................... 78 Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F. oxysporum80 Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 81 Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)...................................... 90 Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14................................ 96 Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26................................................ 97 Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29................................ 100 Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 30................................ 102 Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 31............................... 104 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta................................................................................... 24 Hình 1.5.2. Cây Gội ổi .................................................................................... 24 Hình 1.5.3. Cây Trầu không............................................................................ 25 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng............................................................................. 26 Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ......... 45 Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. .............. 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride 47 Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride .......................... 48 Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum ... 49 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum............................ 51 Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides ..... 52 Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes................ 52 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis ........... 53 Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủng Microdiplodia hawaiiensis................. 54 Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp..... 55 Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ....... 56 Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng ........ 75 thí nghiệm........................................................................................................ 75 Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại phòng thí nghiệm............................................................................................. 75 Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin ............................. 79 Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết F. oxysporum ................................................................................... 80 Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26.................................... 98 ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta............................... 57 Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi .................................. 62 Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng................................. 64 Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không.......................... 66 Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu ...................... 68 Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng............ 71 Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không....... 74 x
MỞ ĐẦU Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta. Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch hại tổng hợp trong thời gian tới. Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả… Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này. 1
Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation...[1]. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV. Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones, pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids...) với rất nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được nguồn nguyên liệu từ nấm NSTV sẽ tránh được việc khai thác cạn kiệt nguồn 2
tài nguyên thực vật, làm mất sự đa dạng sinh học và đe dọa tuyệt chủng các loài thực vật quý hiếm, gây hậu quả xấu tới môi trường tự nhiên. Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo, rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam. Những công bố liên tục trong những năm gần đây của các đoàn khảo sát, chuyên gia Việt Nam và quốc tế về việc phát hiện các loài động thực vật mới tại Việt Nam càng khẳng định giá trị tiềm ẩn vô tận của nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá này. Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm trong việc nghiên cứu, tìm tòi, phát hiện và kết hợp tài tình các nguyên liệu thực vật đa dạng thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, vô cùng đặc sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người, bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại..... Với trình độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi, nghiên cứu, chọn lọc kinh nghiệm dân gian, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng. Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm nội sinh thực vật, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật” trên 3
bốn (04) loài thực vật Việt Nam bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.), Nghệ vàng (Curcuma longa L.) và ba (03) chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu ta, nghệ vàng và trầu không. Đề tài nghiên cứu có tính khoa học, tính thực tiễn và tính thời sự, được thực hiện với mục tiêu là sàng lọc, phát hiện, chiết xuất, xác định cấu trúc các chất có tiềm năng sử dụng làm thuốc trừ sâu và nấm bệnh hại cây. Các nội dung nghiên cứu của Luận án bao gồm: - Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây.. - Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. - Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và cachợp chất hữu cơ thành phần. - Hoàn thiện quy trình phân lập, nhân nuôi và khai thác nguồn nấm NSTV như là một hướng đi mới nhanh hơn và hiệu quả hơn, một nguồn tài nguyên vô tận mới để phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có giá trị cao tại Việt Nam. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật Theo nghiên cứu của nhà côn trùng học Xô viết N. N. Melnikov, có trên 68.000 loài côn trùng có hại cho con người, động vật và thực vật. Số lượng chủng vi sinh vật (nấm bệnh) có hại cũng không ít hơn. Các số liệu thống kê cho thấy côn trùng và vi sinh vật có hại đã gây thiệt hại rất lớn cho sản xuất nông nghiệp, với ước tính khoảng 1/3 tổng sản lượng lương thực toàn cầu đã bị mất hàng năm do côn trùng và nấm bệnh, và thực tế nếu côn trùng và nấm bệnh gây hại đã không được nghiên cứu và khống chế một cách hệ thống thì mức độ thiệt hại còn lớn hơn rất nhiều (ước tính tới 37% tổng sản lượn khoai tây, 22% tổng sản lượng cải bắp, 10% tổng sản lượng táo và 9% sản lượng tổng đào quả toàn cầu sẽ bị hư hại) [1]. Tại Trung quốc, có 1.648 loại tác nhân có hại cho mùa màng, trong đó có 724 loại nhân tố thực vật có hại, 838 loại côn trùng, mối mọt, 64 loại cỏ dại và 22 loài gặm nhấm. Nếu không sử dụng thuốc BVTV, tổng sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc sẽ bị mất tương ứng lần lượt là 78%, 54% và 32%. Sử dụng thuốc BVTV tại Trung Quốc đã góp phần giúp nước này thu được thêm 89,44 triệu tấn ngũ cốc, 1,65 triệu tấn bông, 2,53 triệu tấn hạt lấy dầu và 78 triệu tấn rau màu [2]. Theo đánh giá của Viện Lúa quốc tế (IRRI), côn trùng và nấm bệnh gây thiệt hại khoảng 37% tổng sản lượng lúa thu hoạch hàng năm trên toàn cầu. Một trong những trường hợp nấm gây bênh nổi tiếng nhất, thiệt hại nghiêm trọng nhất trong lịch sử trồng trợt thế giới là bệnh Panama do chủng nấm Fusarium cubense gây ra trên cây chuối. Bệnh Panama đã gần như xóa sổ ngành nông nghiệp trồng chuối tại Châu Mỹ La tinh những năm đầu thế kỷ 20. Những căn bệnh mới do nấm gây ra tiếp tục đe dọa xóa sổ ngành công nghiệp trồng chuối trị giá 11 tỷ USD trên toàn cầu [3]. 5
Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã tạo thêm được 1/3 tổng sản lượng nông sản toàn cầu. Nếu không có thuốc BVTV, sản lượng hoa quả, rau màu và ngũ cốc toàn cầu có thể bị thiệt hại tới 78%, 54% và 32% [4]. Tại Mỹ, cứ 1 USD bỏ ra cho thuốc BVTV sẽ thu về 4 USD sản lượng thu hoạch. Như vậy, với mức chi phí trung bình hàng năm đạt 10 tỷ USD cho thuốc BVTV, nông dân Mỹ đã thu được thêm 40 tỷ USD nông sản đã có thể bị mất bởi sâu bệnh. Nhờ sử dụng thuốc BVTV để ngăn chặn, tiêu diệt côn trùng, sâu bệnh hại mùa màng, các nước đang phát triển đã có thể sản xuất và xuất khẩu sản lượng lương thực, nông sản nhiều hơn bao giờ hết. Diện tích sản xuất nông nghiệp không ngừng được mở rộng, tới tận khu vực Amazon để trồng ngũ cốc đến rừng nhiệt đới Indonexia để trồng cọ dầu. Theo công bố của FAO, cứ tăng thêm 1% sản lượng lương thực là tương ứng với sự tăng thêm 1,8% lượng sử dụng thuốc BVTV [4]. Theo định nghĩa của Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), thuốc BVTV là bất kỳ hợp chất hoặc hỗn hợp dùng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc khổng chế các nhân tố gây hại (như các vector gây hại cho người và động vật, các loại động thực vật không mong muốn) trong quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển và buôn bán lương thực, sản phẩm nông nghiệp, gỗ và đồ gỗ, thức ăn chăn nuôi hoặc các chất dùng để tiêu diệt côn trùng, nhện, vật gây hại trên và trong cơ thể động vật. Nó còn bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, chất gây rụng lá, chất gây mất nước hay làm quả chín chậm. Nó cũng bao gồm các chất được sử dụng trước và sau khi thu hoạch nông sản để ngăn ngừa sự suy giảm chất lượng sản phẩm trong quá trình bảo quản và vận chuyển [1, 3]. Thuốc BVTV có thể phân loại dựa vào vật đích tác dụng (thuốc diệt cỏ, diệt côn trùng, trừ nấm, trừ động vật gặm nhấm, trừ chấy rận), dựa vào cấu 6
trúc hóa học (hữu cơ, vô cơ, tổng hợp) hoặc có nguồn gốc sinh học (biopesticide), hay trạng thái vật lý (dạng rắn, lỏng, khí hóa lỏng, thuốc xông) [2, 5]. Thuốc diệt côn trùng hóa học (chemical insecticides) có một số nhóm thuốc (dựa theo tên của nhóm gốc có hoạt tính trừ bệnh) tiêu biểu như organochlorine, organophosphate, carbamate,... Nhóm thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (biopesticide) bao gồm các loại thuốc có nguyên liệu gốc tự nhiên từ vi sinh vật, thực vật hay khoáng tự nhiên, hiện đang có xu hướng phát triển nhanh chóng, gồm có các nhóm pyrethroid, rotenoid, nicotinoid, strychnine, scilliroside. Ngoài ra, thuốc BVTV có thể được phân loại thành loại dễ phân hủy bởi vi sinh vật thành các chất ít gây hại hơn hoặc thuộc loại bền vững, khó phân hủy, tồn tại nhiều năm, tích lũy trong các chuỗi thức ăn, gây độc cho cả hệ sinh thái [2]. Hiện nay, trung bình hàng năm Thế giới tiêu thụ khoảng 3,5 tỷ kg thuốc BVTV hóa học từ giai đoạn gieo trồng đến khi thu hoạch, bảo quản, trong đó 75% tổng tiêu thụ là tại các quốc gia đã phát triển, nhưng nhu cầu tiêu thụ tại các nước đang phát triển đang không ngừng tăng mạnh [5]. 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học Thực tế phải đối mặt với những vấn đề nguy hiểm, nan giải bới việc sử dụng thuốc BVTV hóa học hiện nay đã đặt Thế giới vào bài toán phải sử dụng thuốc BVTV hợp lý và hiệu quả hơn nữa, được kiểm soát chặt chẽ hơn nữa cũng như hối thúc giới khoa học phải tìm kiếm, thay thế thuốc BVTV hóa học bằng các biện pháp canh tác, các thế hệ thuốc BVTV mới an toàn hơn. Các thế hệ thuốc BVTV trong tương lai sẽ phải có những đặc tính thiết yếu như (1) có hoạt tính sinh học và hiệu lực diệt trừ sâu bệnh cao hơn nữa, để có thể hạn chế tối đa liều lượng thuốc cần sử dụng, giảm thiểu tối đa ô 7
nhiễm môi trường. (2) Không mang độc tính (non toxic); (3) Không gây ô nhiễm, thân thiện môi trường. Theo định nghĩa của Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (Bio-pesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên (như thực vật, động vật, vi khuẩn, vi rút, nấm và các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng). Khái niệm này bao hàm cả các chất sinh ra bởi gene được cấy vào đối tượng cây cần bảo vệ (cây chuyển gene- GMO) nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại. Thuốc BVTV sinh học (BVTVSH) hội tụ nhiều đặc tính phù hợp để có thể thay thế thuốc BVTV hóa học, đã được giới khoa học toàn cầu tập trung nghiên cứu, khám phá, sản xuất và sử dụng để khống chế, tiêu diệt, xua đuổi các loại cỏ dại, bệnh dịch do côn trùng, nấm bênh gây ra. So với thuốc BVTV hóa học, thuốc BVTVSH có các đặc tính ưu việt sau: (1) có hiệu lực tiêu diệt sâu bệnh gây hại nhưng an toàn với con người và động vật, không gây ô nhiễm, không tồn dư hóa chất; (2) có tính lựa chọn vật chủ đích cao, an toàn cho các loài sinh vật có lợi, sinh vật thiên địch tự nhiên; (3) từ nguyên liệu đến chất hoạt hóa đều là sản phẩm tự nhiên, do đó có thể sản xuất bền vững, ổn định; (4) có thể hiệu chỉnh để nâng cao chất lượng sản phẩm bằng công nghệ lên men, công nghệ snh học; (5) Hiếm khi xảy ra hiện tượng kháng thuốc [7]. Trên thế giới hiện đã có hàng trăm nghìn loại thuốc BVTVSH được thương mại hóa và sử dụng [8]. Mexico, Mỹ và Canada đang là nhóm quốc gia sử dụng thuốc BVTVSH dẫn đầu, chiếm tới 44% tổng tiêu thụ toàn cầu, tiếp theo lần lượt là Châu Âu, Châu Á, Châu Đại dương, Mỹ La tinh và Châu Phi lần lượt chiếm 20%, 13%, 11%, 9% và 3% [9]. Tại Trung quốc, từ những năm 1990 đến nay, nền công nghiệp thuốc BVTVSH có tốc độ tăng trưởng rất nhanh, trung bình từ 10% đến 20%/năm 8