Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:172

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ hai quả thể nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH HOÀNG VĂN TRUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC NGHỆ AN - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH HOÀNG VĂN TRUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG PGS. TS. ĐINH THỊ TRƯỜNG GIANG NGHỆ AN - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Vinh, ngày 15 tháng 12 năm 2018 Ký tên Hoàng Văn Trung
LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Công nghệ thực phẩm, phòng thí nghiệm Trung tâm Phân tích thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, Viện Hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, khoa Hóa-Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến GS. TS. Trần Đình Thắng, PGS. TS Đinh Thị Trường Giang - Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tôi từng bước trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nguyễn Hoa Du, PGS. TS Hoàng Văn Lựu đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận án. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn GS. TS Tian-Shung Wu, PGS. TS Ping-Chung Kuo-Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan giúp đánh giá kết quả. PGS. TS. Ngô Anh khoa Sinh, Đại học Khoa học Huế giúp định danh mẫu nấm. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phòng ban chức năng, các thầy cô, cán bộ phòng Đào tạo Sau đại học, khoa Hoá học, viện Công nghệ Hóa, Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Vinh, ngày 15 tháng 12 năm 2018 Hoàng Văn Trung
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH DANH SÁCH SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Lí do chọn đề tài ..........................................................................................................1 2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu ..................................................................................................2 4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................3 5. Những đóng góp mới của luận án ...............................................................................3 6. Cấu trúc của luận án ....................................................................................................4 Chương 1: TỔNG QUAN .............................................................................................5 1.1. Nấm lớn ....................................................................................................................5 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nấm .............................................................................5 1.2.1. Hàm lượng chất khô ..............................................................................................5 1.2.2. Protein và acid amin ..............................................................................................6 1.2.3. Carbohydrate .........................................................................................................8 1.2.4. Lipid.......................................................................................................................9 1.2.5. Vitamin ..................................................................................................................9 1.2.6. Khoáng chất .........................................................................................................10 1.3. Chi Daldinia ............................................................................................................11 1.3.1. Đặc điểm chung về hình thái ...............................................................................11 1.3.2. Thành phần hóa học.............................................................................................11 1.4. Nấm than (Daldinia concentrica) ...........................................................................13 1.4.1. Đặc điểm hình thái và phân bố ............................................................................13 1.4.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ..........................................................13 1.5. Chi linh chi (Ganoderma) ......................................................................................15 1.5.1. Đặc điểm hình thái...............................................................................................15 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ..........................................................15 1.6. Nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) ...........................................................27 1.6.1. Đặc điểm hình thái và phân bố ............................................................................27 1.6.2. Thành phần hóa học.............................................................................................28
1.6.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................................29 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM ................................................30 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .................................................................30 2.1.1. Thu mẫu ...............................................................................................................30 2.1.2. Các phương pháp xử lý mẫu và chiết ..................................................................30 2.1.3. Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất .........30 2.1.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất.......................................................30 2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị ..................................................................................30 2.2.1. Hoá chất ...............................................................................................................30 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................31 2.3. Nghiên cứu thành phần các chất dinh dưỡng có trong các loài nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ. .......................................................................................................................32 2.3.1. Xác định thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng. ...................................32 2.3.2. Xác định hàm lượng acid amin ............................................................................34 2.3.3. Xác định hàm lượng các vitamin A và E.............................................................36 2.4. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide .........................................37 2.4.1. Chất chuẩn ...........................................................................................................37 2.4.2. Chiết các sterol ....................................................................................................37 2.4.3. Phân tích bằng sắc ký (HPLC) ............................................................................37 2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D. concentrica) .................................38 2.5.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được ..................38 2.5.2. Các dữ liệu vật lý .................................................................................................39 2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) ...............43 2.6.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất ....................................................................43 2.6.2. Các dữ kiện vật lý và phổ ....................................................................................43 2.7. Phương pháp thử hoạt tính .....................................................................................47 2.7.1. Gây độc tế bào .....................................................................................................47 2.7.2. Kháng viêm..........................................................................................................48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................51 3.1. Kết quả xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng của một số loài nấm ................51 3.1.1. Thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng ...................................................51 3.1.2. Hàm lượng các acid amin trong các mẫu nấm ....................................................53 3.1.3. Hàm lượng các vitamin trong các mẫu nấm ........................................................60 3.2. Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide ........................................................62 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của ergosterol và ergosterol peroxide ...........................62 3.2.2. Kết quả phân tích .................................................................................................64
3.3. Nấm than (D. concentrica) .....................................................................................64 3.3.1. Kết quả phân lập hợp chất. ..................................................................................64 3.3.2. Xác định cấu trúc .................................................................................................65 3.3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học .............................................................................97 3.4. Nấm linh chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. ).............................................98 3.4.1. Phân lập một số hợp chất .....................................................................................98 3.4.2. Xác định cấu trúc .................................................................................................98 KẾT LUẬN ................................................................................................................106 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...............................108 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................109 PHỤ LỤC ...................................................................................................................121
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt Association of official analytical chemists Hiệp hội các nhà hoá phân AOCA tích chính thức GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí-khối phổ CC Column Chromatography Sắc kí cột FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng EI-MS Electron Impact-Mass Spectroscopy Phổ khối va chạm electron Electron Spray Ionzation-Mass Phổ khối lượng phun mù ESI-MS Spectroscopy electron HR-ESI- High Relution-Electron Spray Impact Phổ khối lượng phân giải MS Mass Spectroscopy cao phun mù electron 1 Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt H-NMR nhân proton 13 Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt C-NMR nhân cacbon-13 Distortionless Enhancement by Phổ DEPT DEPT Polarisation Transfer Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân HSQC trực tiếp H→C Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân HMBC qua nhiều liên kết H→C NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Inductively Coupled Plasma - Mass Phổ khối lượng plasma cao ICP-MS Spectrometry tần cảm ứng Atomic Absorption spectrosopy Phương pháp quang phổ AAS hấp thụ nguyên tử Flame -Atomic Absorption spectrosopy Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ F-AAS thuật nguyên tử hóa dùng ngọn lửa
Graphite - Atomic Ábsorption spectrosopy Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ GF-AAS thuật nguyên tử hóa lò graphit Hydride Generation - Atomic Ábsorption Phương pháp quang phổ HG-AAS spectrosopy hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật hyđrua hóa Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối IC50 tượng thử nghiệm Human Immuno-deficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn HIV dịch ở người CTPT Molecular formula Công thức phân tử ACN Acetonitrile Axetonitrile Đ.n.c. Melting point Điểm nóng chảy LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng ppb parts per billion Một phần tỷ (ng/ml) ppm parts per million Một phần triệu ( g/ml) DMSO DiMethylSulfoxide DiMethylSulfoxit MeOH Methanol Metanol TMS Tetramethylsilan Tetramethylsilan RT Retention time Thời gian lưu Effective concentration 50% Giá trị 50% các tế bào hoặc gốc tự do bị chết EC50 hoặc được tạo ra bởi DPPH được trung hòa Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δC của carbon Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δ*C của carbon theo tài liệu tham khảo Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δH của proton Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học δ*H của proton theo tài liệu
tham khảo s Singlet vân đơn br s broad singlet Singlet tù t triplet triplet d doublet vân đôi dd dublet của duplet doublet của doublet dt dublet của triplet doublet của triplet m multiplet multiplet dm dry mass Khối lượng khô
DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng chất khô của một số loài nấm (%) ...............................................6 Bảng 1.2. Thành phần acid amin thiết yếu trong một số loài nấm (mg/kg chất khô). ....7 Bảng 1.3. Thành phần acid amin không thiết yếu trong một số loài nấm (mg /kg chất khô) ..................................................................................................................................8 Bảng 1.4. Hàm lượng nguyên tố thiết yếu trong một số loài nấm (mg /kg chất khô) ...10 Bảng 2.1. Chương trình vô cơ hóa mẫu trong lò vi sóng ..............................................32 Bảng 2.2. Các điều kiện và thông số máy tối ưu để định lượng Ge Na, K, Ca, Mg. ....33 Bảng 2.3. Các điều kiện và thông số máy tối ưu để định lượng Se Fe, Cu, Zn. ...........33 Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn, ...........................................................................51 Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong 08 mẫu nấm lớn .....52 Bảng 3.3. Kết quả xác định Se, Fe, Cu, Zn trong trong 08 mẫu nấm lớn ....................52 Bảng 3.4. Sự phụ thuộc của diện tích peak sắc ký vào nồng độ (pmol/ l ) của acid amin ...............................................................................................................................54 Bảng 3.5. Hàm lượng acid amin thủy phân trong nấm nghiên cứu (μg/g) ....................58 Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi của acid amin trong nấm cổ linh chi (G. applanatum) .....59 Bảng 3.7. Diện tích peak của vitamin A tương ứng với từng nồng độ chuẩn ..............60 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong nấm .....................................61 Bảng 3.9. Diện tích peak của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn .............61 Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm ...................................62 Bảng 3.11. Diện tích peak của ergosterol và ergosterol peroxide ứng với từng nồng độ chuẩn ..............................................................................................................................63 Bảng 3.12. Hàm lượng của ergosterol trong 8 mẫu nấm (μg/kg) ..................................64 Bảng 3.13. Các hợp chất được tách ra từ nấm than (D. concentrica) ...........................65 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR và DEPT của hợp chất DCM1 .........................67 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất DCM2 .......................................................79 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 13C- NMR của hợp chất DCM4 ..............................................85 Bảng 3.17. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất DCM8 (ergosterol) ...................................94 Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất DCM9 ......................................................96 Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư ................................97 Bảng 3.20. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs INHIBITION) .....98 Bảng 3.21. Các hợp chất được tách ra từ nấm linh chi (G. applanatum) ......................98 Bảng 3.22. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất GAM4 ....................................................100 Bảng 3.23. Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất GAM5 .............................102
DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1. Nấm Daldinia concentrica ...........................................................................13 Hình 1.2. Bề mặt dưới của thể quả Ganoderma applanatum ........................................28 Hình 3.1. Đường chuẩn định lượng Asp .......................................................................54 Hình 3.2. Đường chuẩn định lượng His ........................................................................55 Hình 3.3. Đường chuẩn định lượng Thr ........................................................................55 Hình 3.4. Đường chuẩn định lượng Tyr ........................................................................55 Hình 3.5. Đường chuẩn định lượng Ile ..........................................................................55 Hình 3.6. Đường chuẩn định lượng Glu ........................................................................55 Hình 3.7. Đường chuẩn định lượng Ser ........................................................................55 Hình 3.8. Đường chuẩn định lượng Gly ........................................................................56 Hình 3.9. Đường chuẩn định lượng Ala ........................................................................56 Hình 3.10. Đường chuẩn định lượng Arg......................................................................56 Hình 3.11. Đường chuẩn định lượng Leu ......................................................................56 Hình 3.12. Đường chuẩn định lượng Cys – SS – Cys. ..................................................56 Hình 3.13. Đường chuẩn định lượng Val ......................................................................56 Hình 3.14. Đường chuẩn định lượng Met .....................................................................57 Hình 3.15. Đường chuẩn định lượng Phe ......................................................................57 Hình 3.16. Đường chuẩn định lượng Lys ......................................................................57 Hình 3.17. Đường chuẩn định lượng Pro ......................................................................57 Hình 3.18. Đường chuẩn định lượng vitamin A ............................................................60 Hình 3.19. Đường chuẩn định lượng vitamin E ............................................................62 Hình 3.20. Đường chuẩn định lượng ergosterol ............................................................63 Hình 3.21. Đường chuẩn định lượng ergosterol peroxide .............................................63 Hình 3.22. Hợp chất DCM1 .........................................................................................66 Hình 3.23. Phổ của hợp chất của hợp chất DCM1 ........................................................68 Hình 3.24. Phổ IR của hợp chất của hợp chất DCM1 ...................................................68 Hình 3.25. Phổ khối lượng của hợp chất DCM1 ...........................................................69 Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM1 ..............................................................69 Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM1 ..............................................................70 Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM1.............................................................70 Hình 3.29. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM1.............................................................71 Hình 3.30. Phổ DEPT của hợp chất DCM1 ..................................................................71 Hình 3.31. Phổ DEPT của hợp chất DCM1 ..................................................................72
Hình 3.32. Phổ DEPT của hợp chất DCM1 ..................................................................72 Hình 3.33. Phổ HSQC của hợp chất DCM1 ..................................................................73 Hình 3.34. Phổ HSQC của hợp chất DCM1 ..................................................................73 Hình 3.35. Phổ HSQC của hợp chất DCM1 ..................................................................74 Hình 3.36. Phổ HMBC của hợp chất DCM1.................................................................74 Hình 3.37. Phổ HMBC của hợp chất DCM1.................................................................75 Hình 3.38. Phổ HMBC của hợp chất DCM1.................................................................75 Hình 3.39. Phổ HMBC của hợp chất DCM1.................................................................76 Hình 3.41. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM2............................................................77 Hình 3.42. Phổ DEPT của hợp chất DCM2 ..................................................................78 Hình 3.43. Phổ HMBC của hợp chất DCM2.................................................................78 Hình 3.44. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM3 ..............................................................81 Hình 3.45. Phổ 13C - NMR của hợp chất DCM3...........................................................81 Hình 3.46. Phổ DEPT của hợp chất DCM3 ..................................................................82 Hình 3.47. Phổ HMBC của hợp chất DCM3.................................................................82 Hình 3.48. Phổ HSQC của hợp chất DCM3 ..................................................................83 Hình 3.49. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM4 ..............................................................84 Hình 3.50. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM4.............................................................84 Hình 3.51. Phổ DEPT của hợp chất DCM4 ..................................................................85 Hình 3.52. Phổ HMBC của hợp chất DCM4.................................................................86 Hình 3.53. Phổ HSQC của hợp chất DCM4 ..................................................................87 Hình 3.54. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM5 ..............................................................88 Hình 3.55. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM5.............................................................88 Hình 3.56. Phổ DEPT của hợp chất DCM5 ..................................................................89 Hình 3.57. Phổ HMBC của hợp chất DCM5.................................................................89 Hình 3.58 . Phổ HSQC của hợp chất DCM5 .................................................................90 Hình 3.59. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM6 ..............................................................91 Hình 3.60. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM7 ..............................................................92 Hình 3.61. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM7.............................................................92 Hình 3.62. Phổ DEPT của hợp chất DCM7 ..................................................................93
DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình xử lý mẫu phân tích acid amin .....................................................34 Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý mẫu định hàm lượng vitamin A và E .................................36 Sơ đồ 2.3. Phân lập các hợp chất từ nấm than (D. concentrica) .................................40 Sơ đồ 2.4. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (G. applanatum) ................46
1 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu protein, đầy đủ các acid amin thiết yếu, hàm lượng chất béo ít và đó là những axit béo chưa bão hòa, giá trị năng lượng cao, giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con người. Ngoài ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường sức khỏe, hỗ trợ phòng và điều trị bệnh cho con người. Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài nấm và phát hiện nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như tăng cường hệ miễn dịch, điều trị viêm gan, ung thư, HIV… Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2015, có hơn 2500 loài nấm đã được ghi nhận, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn [3,7,9,11]. Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên, có hơn 50 loài là nấm ăn như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff. felleus Bull.), nấm bào ngư (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) ... [1, 4]. Có khoảng hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Tramethers versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)… [2,8]. Những nghiên cứu bước đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharide, polysaccharide-peptide, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như: flavonoid, steroid, terpenoid… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như: ung thư, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt
2 chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường [5,6,14]. Nghệ An là tỉnh có nhiều vườn quốc gia như: vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm… Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu về nấm là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ”. 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết các loài nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc Trung Bộ của Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các loài dịch chiết của loài nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08). - Xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E. - Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide. - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ hai quả thể nấm Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02). - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.
3 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc xử lý các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. - Phân tích thành phần dinh dưỡng: đã sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector khác nhau và phương pháp phổ khối lượng plasma cảm ứng (ICP – MS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa hỉđrua (HG - AAS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F - AAS). - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha thường. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập, được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1 H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được sử dụng. - Phương pháp thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và kháng viêm. 5. Những đóng góp mới của luận án - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của 08 loài nấm lớn: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc Trung Bộ. - Lần đầu tiên xác định được hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide trong 08 loài nấm trên. - Từ dịch chiết quả thể nấm Daldinia concentrica thu được 09 hợp chất. Trong đó, hợp chất DCM1 là [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18- dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*) là hợp
4 chất mới. - Từ dịch chiết quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum thu được 05 hợp chất bao gồm: Ergosterol (GAM1), 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (GAM2), ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4), 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5). Các hợp chất ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4), 3β- hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5) lần đầu tiên tìm thấy trong loài này. - Lần đầu tiên tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với các dòng tế bào ung thư khác nhau của 5 hợp chất (DCM1, DCM2, DCM3, DCM4, DCM5). Các hợp chất DCM2 và DCM3 cho thấy độc tính tế bào yếu đối với tất cả các dòng tế bào khối u được thử nghiệm với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 23,0 ± 1,1 và 58,2 ± 2,3 M. Các hợp chất DCM4 và DCM5 cho thấy độc tính tế bào yếu đối với các tế bào HepG2 và Hep3B với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 21,5 ± 5,1 và 46,9 ± 3,7 μM và chúng không có hoạt tính đáng kể đối với nồng độ thử nghiệm cao nhất đối với SK- LU-1 và dòng tế bào SW480. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 124 trang với 23 bảng số liệu, 62 hình và 4 sơ đồ với 130 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (24 trang), kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 70 phổ của một số hợp chất chọn lọc.
5 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Nấm lớn Nấm là một loài sinh vật có giá trị to lớn đối với con người, cách đây 3000 năm, con người đã biết dùng nấm làm thức ăn. Mặc dù như vậy nhưng các hiểu biết về nấm là rất khác nhau, phụ thuộc vào sự khác nhau về loài, sự khác nhau về nguồn gốc, về đặc điểm địa lý của chúng. Đối với nấm lớn trong những năm cuối thế kỷ XX, các nhà nghiên cứu đã kết hợp phân loại truyền thống với phân loại dựa trên những tiêu chuẩn hiện đại như: các phản ứng hoá học, sự phân tính, hệ sợi nấm, kiểu gây mục, đặc điểm nuôi cấy, đặc biệt là cấu trúc phân tử ADN. Trong lịch sử nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm lớn, hợp chất chuyển hoá bậc hai được phân lập đầu tiên từ nấm lớn P.glaucoma là axit mycophenolic được công bố bởi Gosio. Đến năm 1929, nhà bác học Alexander Fleming công bố hợp chất penicillin được phân lập từ nấm mốc Penicillium notatum, có khả năng kháng khuẩn hiệu quả được sử dụng rộng rãi trong chiến tranh thế giới lần thứ II. Đây là sự phát hiện vĩ đại, quan trọng mở ra con đường mới cho việc tìm ra các loại thuốc trong y học hiện đại. Năm 1940, các chất chuyển hoá bậc hai từ nấm lớn mới thật sự được sự chú ý đặc biệt. Từ đó đến nay, các nhà khoa học phân lập được khoảng hơn 8.600 hợp chất chuyển hoá bậc hai có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ các loài nấm lớn [33,93,97]. 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nấm 1.2.1. Hàm lượng chất khô Hàm lượng chất khô của nấm tươi tương đối thấp, thông thường khoảng 10%, chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và khoáng chất. Khi nghiên cứu thành phần hóa học của nấm, hàm lượng nước chỉ là thông số có ý nghĩa với nấm tươi, nó phụ thuộc vào điều kiện nuôi trồng, thời tiết, khí hậu, điều kiện thu hái, hàm lượng nước trong quả thể nấm tươi chiếm khoảng 90%. Các dữ liệu được công bố về thành phần chất khô của nấm được trình bày trong bảng 1.1 [31,32].
6 Bảng 1.1. Hàm lượng chất khô của một số loài nấm (%) Loài Carbohydrate Sợi thô Chất đạm thô Chất béo thô Tro B. aereus 34,0 17,0 26,9 2,1 8,5 B. edulis 30,6 15,3 28,7 4,1 9,2 B. speciosus 28,6 21,0 28,1 2,9 7,6 C. aureus 61,5 5,2 14,1 4,0 9,2 Lactarius deliciosus 25,0 36,3 20,2 2,5 7,5 Lactarius hatsudake 38,2 31,8 15,3 1,0 7,3 Lactarius volemus 15,0 40,0 17,6 6,7 13,3 L. crocipodium 12,8 37,9 29,3 1,0 5,8 Lentinula edodes 30,2 39,4 17,1 1,9 4,3 R. virescens 13,4 32,8 28,3 1,5 11,9 S. aspratus 64,6 5,1 12,0 2,8 10,4 T. matsutake 36,7 29,1 14,3 5,0 8,9 Các loài được trình bày ở bảng 1.1 cho ta thấy hàm lượng carbohydrate, protein thô, chất xơ cao, tương đối giàu khoáng chất, và chất béo thô tương đối thấp [68]. 1.2.2. Protein và acid amin Giá trị dinh dưỡng của nấm chủ yếu liên quan đến hàm lượng protein của chúng. Protein nấm được coi là có chất lượng dinh dưỡng cao hơn so với protein thực vật (FAO, 1991) [44]. Hàm lượng protein và acid amin trong nấm không chỉ phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và giai đoạn sinh trưởng của quả thể, mà còn phụ thuộc vào các loài [32]. Do tỷ lệ cao của các hợp chất nitơ phi protein, đặc biệt là chitin khó tiêu hóa, chúng tôi đã sử dụng hệ số chuyển đổi 4,39 để tính hàm lượng protein. Nấm thường chứa protein 12,0–29,3% (bảng 1.1). Tuy nhiên, một số tác giả xác định hàm lượng protein cao hơn cho Cantharellus cibarius và Lepista nuda lần lượt là 54 và 59% dm [21]. Thành phần acid amin trong nấm gần hoặc tốt hơn so với protein đậu nành, thậm chí đối với một số loài nấm, chế phẩm có thể tương tự như trứng gà [123]. Các acid amin thiết yếu không thể được tổng hợp bởi con người nhưng có thể được cung cấp bởi nấm. Do đó, tỷ lệ các acid amin thiết yếu (EAA) với tổng acid amin (TAA) đưa ra một ý tưởng về chất lượng dinh dưỡng của protein trong thực phẩm. Dữ liệu về thiết yếu (Lys, Thr, Val, Ile, Leu, Met, Try, Phe) và không thiết yếu (Arg, Ala, Tyr, Gly, Ser, Pro, của anh, Asp, Glu, Cys) của các acid amin cho một số loài nấm được đưa ra trong bảng 1.2 và 1.3.