Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:162

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được nghiên cứu với mục tiêu nhằm nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim: Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và có cấu trúc hóa học lí thú.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………. NGUYỄN THỊ LIỄU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI LÁ KIM Ở TÂY NGUYÊN, VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TSKH. Trần Văn Sung 2. PGS. TS. Đinh Thị Phòng HÀ NỘI - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TSKH. Trần Văn Sung và PGS.TS. Đinh Thị Phòng. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Liễu
LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tại phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen- Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TSKH. Trần Văn Sung và PGS.TS. Đinh Thị Phòng người thầy, cô đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Xin cảm ơn các cô chú, anh chị phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học và phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành thực nghiệm tại đây. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Thủ Đô Hà nội đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi được đi học và có thời gian hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Liễu
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.................................................................................. 3 1.1. Tổng quan về 3 loài lá kim nghiên cứu .......................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và tình trạng bảo tồn. ................................................... 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia. ..................................... 9 1.2. Ứng dụng kĩ thuật phân tích ISSR và SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật ................................................................................................. 27 1.2.1. Kỹ thuật ISSR ( Inter Simple Sequence Repeat )....................................... 27 1.2.2. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) .................................................. 27 1.2.3. Một số thành tựu về nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài thuộc chi Cephalotaxus, Dacrydium và Nageia. ..................................... 28 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 32 2.1. Nguyên liệu thực vật ..................................................................................... 32 2.1.1. Nghiên cứu thành phần hóa học .............................................................. 32 2.1.2. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền................................................. 32 2.2. Hóa chất và thiết bị ....................................................................................... 33 2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học .............................................................. 33 2.2.2. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền................................................. 34 2. 3. Chiết tách các chất từ 3 loài lá kim nghiên cứu.......................................... 34 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 34 2.3.2. Phân lập, tinh chế các chất từ 3 loài lá kim ............................................. 35 2.4. Hoạt tính sinh học ......................................................................................... 53 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa ................................... 53 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào [63-67]...................... 54 2.5. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền .................................................... 56 2.5.1. Các cặp mồi ISSR và SSR ........................................................................ 56 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 56 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 58
3.1. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.................................................. 58 3.1.1. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết ...................................................... 58 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch tách được từ 3 loài lá kim .................................................................................................................... 59 3.1.3. Hoạt tính sinh học của các chất sạch phân lập từ 3 loài lá kim.............. 117 3.2. Đa dạng di truyền nguồn gen của ba loài lá kim nghiên cứu.................... 125 3.2.1. Đa dạng di truyền .................................................................................. 126 3.2.2. Cây phát sinh chủng loại của 3 loài lá kim ............................................ 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 132 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .................................................. 135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...................................................................................................................... 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 137
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 Proton Nuclear Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR MagneticResonance Spectrocopy proton 13 Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR Resonance Spectrocopy carbon Distortionless Enhancement by DEPT Phổ DEPT Polarisation Transfer Heteronuclear MultipleBond HMBC Phổ HMBC Coherence Heteronuclear SingleQuantum HSQC Phổ HSQC Coherence COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương tác proton MS Mass Spectrocopy Phổ khối lượng Electron Spray IonizationMass Phổ khối ion hóa bằng phun mù ESI-MS Spectrocopy điện tử High Resolution ElectronSpray Phổ khối phân giải cao ion hóa HR-ESI-MS Ionization- Mass Spectrocopy bằng phun mù điện tử Nuclear Overhauser Effect NOESY Phổ NOSEY Spectrocopy ISSR Inter Simple Sequence Repeat Lặp lại trình tự đơn giản ở giữa IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại Nồng độ ức chế có hiệu lực 50% IC50 Inhibitory concentration 50% cá thể ED50 Effective dose Nồng độ có hiệu quả 50% cá thể KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung bạch cầu cấp tính SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư hắc tố P388 Ung thư bạch cầu ở chuột HT-29 Ung thư tuyến giáp ở nam giới
COLO-205 Ung thư ruột kết CTPT Công thức phân tử STT Số thứ tự ISSR Inter Simple Sequence Repeat Lặp lại trình tự đơn giản ở giữa Lặp lại trình tự nucleotide đơn SSR Simple Sequence Repeat giản TLTK Tài liệu tham khảo EtOAc Ethyl acetat MeOH Methanol DMSO Dimethylsunfoxid Polymorphic Information PIC Hàm lượng thông tin đa hình Content DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase VU Vulnerable Sẽ nguy cấp NT Near threatened Sắp bị đe dọa d Doublet Đôi s Singlet Đơn m Multiplet Phức hợp br Broad Rộng J (Hz) Hằng số tương tác Độ chuyển dịch hóa học tính δ (ppm) chemical shift in parts per million bằng phần triệu RP18 Silica gel pha đảo RP-18
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Cephalotaxus ............................................. 4 Bảng 1.2. Các loài thực vật thuộc chi Dacrydium ................................................. 5 Bảng 1.3. Các kiểu khung carbon của các hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Cephalotaxus ................................................................................ 10 Bảng 1.4. Các alkaloid khung homoerythrine phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus ................................................................................ 16 Bảng 1.5. Bảng giá trị IC50 thử hoạt tính gây độc tế bào đối với 2 dòng tế bào L1210 và KB của các alkaloid phân lập từ lá của loài C. harringtonia var. nana [15] [20]. ........................................................ 25 Bảng 2.1. Nguồn gốc và ký hiệu của các mẫu thuộc 3 loài lá kim dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen ............................................. 32 Bảng 2.2. Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Hoàng đàn giả.......... 42 Bảng 2.3. Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô cây Kim giao núi đất ...... 46 Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết từ loài Kim giao núi đất. ........................................................................................ 58 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết HTE tổng và dịch chiết HĐE với 4 dòng tế bào ung thư ......................................... 58 1 13 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR của hợp chất DT1 và Cephalotaxine ..................................................................................... 60 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của DT2 và Cephalotaxine-- N-oxide .............................................................................................. 63 1 13 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ H-NMR và C-NMR của DT3 và Deoxyharringtonine. ........................................................................... 66 Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT4 và Nordeoxyharringtonine ... 68 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H NMR và 13 C NMR của DT5.1, DT5.2 và Isoharringtonine.................................................................................... 72 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13 C-NMR của các chất DT6, DT7 và 3- epi-schellhammericine. ....................................................................... 77 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất DT8 và Harringtonolide ... 79
Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ1và Lambertic acid .................... 83 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ NMR của HĐ2, Salvinolone [106] và Montbretol .......... 87 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13 CNMR, HMBC, NOESY của HĐ2 đo trong CDCl3........................................................................................ 88 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của HĐ4 và Ponasterone A.................... 92 1 13 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ H và C-NMR của hợp chất HĐ5 và 20- hyđroxyecdysone ................................................................................ 95 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của HĐ6 và ajugasterone C ......... 98 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG1 và Amentoflavone ...... 100 Bảng 3.17. Số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của các chất KG1, KG2, KG3 ..... 103 Bảng 3.18. Dữ liệu phổ NMR của KG4 và 3β-hydroxytotarol ............................ 105 Bảng 3.19. Dữ liệu phổ NMR của KG5 và totarol-19-carboxylic acid ................ 107 Bảng 3.20. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của KG6 và Ferruginol .............. 109 Bảng 3.21. Dữ liệu phổ NMR của KG7 và Sugiol .............................................. 112 Bảng 3.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của chất DT4 ............... 117 Bảng 3.23. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các chất sạch phân lập từ loài Kim giao núi đất. ....................................................................... 117 Bảng 3.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của DT4 với 4 dòng tế bào ung thư....................................................................................... 118 Bảng 3.25. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập từ loài Hoàng đàn giả .................................................................................. 118 Bảng 3.26. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất KG1, KG4, KG5, KG8 và KG9 ... 119 Bảng 3.27. Tổng kết các hợp chất phân lập được từ 3 loài lá kim nghiên cứu ............ 121 Bảng 3.28. Một số thông số di truyền của 3 loài lá kim phân tích tổ hợp với hai chỉ thị ISSR và SSR.......................................................................... 126
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Đỉnh tùng (C. mannii) Tà Nung, Lâm Đồng và mẫu tiêu bản ............................................................................................................. 4 Hình 1.2. Cây Hoàng đàn giả (D. elatum) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản .................. 6 Hình 1.3. Cây Kim giao núi đất (N. wallichiana) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản ............. 8 Hình 1.4. Các hợp chất cephalotaxine không có mạch nhánh tại C-3................... 12 Hình 1.5. Các hợp chất harringtonine phân lập từ chi Cephalotaxus ....................... 14 Hình 1.6. Các hợp chất alkaloid khung Drupacine phân lập từ chi Cephalotaxus ... 15 Hình 1.7. Cấu trúc các hợp chất homoerythrina alkaloid ......................................... 16 Hình 1.8. Các hợp chất flavonoid phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus ........................................................................................... 19 Hình 1.9. Các hợp chất diterpenoid và norditerpen phân lập từ một số loài thuộc chi Cephalotaxus ........................................................................... 21 Hình 1.10. Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ loài C. mannii ......................... 22 Hình 1.11. Các hợp chất từ một số loài thuộc chi Dacrydium ................................... 23 Hình 1.12. Kỹ thuật ISSR và SSR [53]...................................................................... 28 Hình 2.1. Sơ đồ chiết alkaloid tổng từ lá và cành của Đỉnh tùng .......................... 36 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn alkaloid tổng của lá và cành Đỉnh tùng ............ 37 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các chất từ vỏ Đỉnh tùng ............................................... 38 Hình 2.4. Sơ đồ chiết từ mẫu thân và cành Hoàng đàn giả ...................................... 42 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc mẫu thân và cành Hoàng đàn giả .......................................................................................... 43 Hình 2.6. Sơ đồ chiết từ mẫu lá và cành Kim giao núi đất....................................... 47 Hình 2.7. Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết n-hexane lá và cành Kim giao núi đất ...................................................................................................... 47 Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các chất từ cao chiết MeOH lá và cành Kim giao núi đất ............................................................................................................ 48 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc lá và cành Kim giao núi đất ............................................................................................................ 50 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT1 .............................................................. 61 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT1 ............................................. 61 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT2 ............................................................. 64
Hình 3.4. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT2 .............................................. 64 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT3 ...................................................... 67 Hình 3.6. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT3 .............................................. 67 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT4 ............................................................. 69 Hình 3.8. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT4 .............................................. 70 Hình 3.9. Phổ khối phân giải cao HR- ESI- MS của DT5.1 và DT5.2..................... 73 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của DT5.1 và DT5.2.......................................................... 73 Hình 3.11. Phổ 1H-NMR giãn của DT5.1 và DT5.2 .................................................. 74 Hình 3.12. Phổ 13C-NMR và DEPT của DT5.1 và DT5.2 ......................................... 74 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT6 ...................................................... 76 Hình 3.14. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT6 .............................................. 76 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT7 ...................................................... 78 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT8 ...................................................... 80 Hình 3.17. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT8 ............................................. 80 Hình 3.18. Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ1 ............................................................. 84 Hình 3.19. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ1...................................................... 84 Hình 3.20. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ1............................................. 85 Hình 3.21. Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3 .................................... 89 Hình 3.22. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3 ................. 89 Hình 3.23. Phổ HMBC của hợp chất HĐ2 đo trong CDCl3....................................... 90 Hình 3.24. Phổ NOESY của HĐ2 trong CDCl3 ........................................................ 90 Hình 3.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ4 ............................................................. 93 Hình 3.26. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ4...................................................... 94 Hình 3.27. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất HĐ4 ...................................... 94 Hình 3.28. Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ5 ............................................................. 96 Hình 3.29. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ5...................................................... 96 Hình 3.30. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất HĐ5 ............................................. 97 Hình 3.31. Phổ 1H-NMR của hợp chất HĐ6 ............................................................. 98 Hình 3.32. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất HĐ6...................................................... 99 Hình 3.33. Phổ 1H-NMR của KG1 .......................................................................... 101 Hình 3.34. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG1........................................... 102 Hình 3.35. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất KG4.................................................... 106
Hình 3.36. Phổ 13C-NMR và DEPT của KG4 ......................................................... 106 Hình 3.37. Phổ 1H-NMR của hợp chất KG5 ........................................................... 108 Hình 3.38. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG5........................................... 108 Hình 3.39. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất KG6.................................................... 110 Hình 3.40. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG6........................................... 111 Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của KG7 .......................................................................... 112 Hình 3.42. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG7........................................... 113 Hình 3.43. Phổ 1H-NMR giãn vùng trường cao của KG8 ....................................... 114 Hình 3.44. Phổ 1H-NMR giãn vùng trường thấp của KG8 ...................................... 114 Hình 3.45. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất KG8........................................... 115 Hình 3.46. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh tùng phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Hiệp An, b: mẫu ở Tà Nung). .................................................................................... 127 Hình 3.47. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Hoàng đàn giả phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu ở Sơn Lang, A Yun và Kon Chư Răng (Gia Lai); b: mẫu ở Hòa Sơn (Đắk Lắk); c: mẫu ở Đa Chais (Lâm Đồng); d: mẫu ở Xã Hiếu (Kon Tum). . 128 Hình 3.48. Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Kim giao núi đất với chỉ thị ISSR và SSR (Ghi chú: a: mẫu thu ở A Yun, b: mẫu thu ở Hòa Sơn, c: mẫu thu ở Đa Chais, d: mẫu thu ở Tà Nung, e: mẫu thu ở Xã Hiếu......................................................................................... 129
MỞ ĐẦU Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh. Ngày nay với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, việc nghiên cứu các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên nhằm mục đích dẫn đường cho việc tổng hợp thuốc đã và đang diễn ra mạnh mẽ. Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học lí thú và hoạt tính sinh học đa dạng đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học nhằm tìm ra các loại thuốc có giá trị trong điều trị bệnh cho con người, đặc biệt là các bệnh nan y. Trong các loài thực vật có giá trị trong y học phải kể đến các loài cây lá kim (Conifer). Các loài này là nguồn nguyên liệu chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao ví dụ các hợp chất taxol được phân lập từ loài thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia), Hoa Kỳ đã tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và sản xuất thuốc Paclitaxel chống ung thư vú (David et al., 2000) hay hợp chất homoharringtonine được phân lập từ nhiều loài trong chi Cephalotaxus được phát triển thành thuốc omacetaxine mepesuccinate sử dụng trong điều trị bệnh bạch cầu mãn tính. Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, có 4 miền là khí hậu miền Bắc, miền Nam, khí hậu Đông Trường Sơn và khí hậu biển Đông. Đặc điểm địa hình và thời tiết đó đã tạo ra một thảm thực vật vô cùng đa dạng phong phú. Các loài cây lá kim là những loài cây quan trọng cả về sinh thái, kinh tế và văn hóa tại nhiều địa phương như Lâm Đồng, KomTum, Gia Lai, … Các loài lá kim không chỉ giữ vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái rừng trên các vùng núi cao mà còn là nguồn nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, xây dựng, công nghiệp chất béo, hóa mỹ phẩm, dược phẩm…), đặc biệt một số loài còn được dùng trong các bài thuốc dân tộc. Theo số liệu thống kê của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2005), trong số 34 loài lá kim ở Việt Nam có tới 15 loài ở Tây Nguyên (chiếm 44,11%). Vì thế mà Tây Nguyên được coi là “cái nôi” của loài lá kim có tính đa dạng vào hàng thứ hai của Việt Nam, đặc biệt là tại Đắk Lắk, Kon Tum và Lâm Đồng. Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) là những loài cây lá kim có giá trị kinh tế của khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Tuy nhiên, cho tới nay loài Kim giao núi đất vẫn chưa 1
được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cả trong và ngoài nước, trong khi Đỉnh tùng mới chỉ được nghiên cứu hạn chế tại một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản và chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, Hoàng đàn giả mới chỉ có nghiên cứu thành phần hóa học qua tinh của dầu lá.Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài lá kim trên có nhiều triển vọng tìm ra chất có cấu trúc mới và có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có ở vùng Tây Nguyên. Kết hợp với kết quả nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc khai thác, phát triển bền vững và bảo tồn các loài cây lá kim tại khu vực Tây Nguyên, Việt Nam. Xuất phát từ các cơ sở khoa học nêu trên chúng tôi lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam”  Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài lá kim: Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và có cấu trúc hóa học lí thú. - Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim trên cơ sở phân tích hai chỉ thị ISSR và SSR nhằm cung cấp thông tin khoa học có giá trị giúp cho công tác bảo tồn các loài lá kim – một loài cây quan trọng của vùng Tây Nguyên, Việt Nam.  Nội dung luận án 1. Phân lập các hợp chất từ bộ phận lá, thân cành và vỏ của 3 loài Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) và Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) bằng phương pháp sắc ký cột. 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR. 3. Thử hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các chất sạch phân lập được. 4. Đánh giá tính đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim nghiên cứu 2
bằng 2 loại chỉ thị ISSR và SSR. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về 3 loài lá kim nghiên cứu 1.1.1. Đặc điểm thực vật và tình trạng bảo tồn. Các loài lá kim thuộc lớp Thông (Pinopsida), trong ngành Thông (Pinophyta). Trên thế giới cho đến nay đã thống kê được khoảng 630 loài thuộc 68 chi và 8 họ [1]. Chúng rất đa dạng về hình thái, kích thước và các đặc tính sinh thái (cây thân bò, bụi nhỏ, cây gỗ nhỏ hoặc cây gỗ lớn hay rất lớn). Điển hình loài gỗ khổng lồ như Cụ Tùng (Sequoia gigantea) ở vùng núi Sierra Nevada (Hoa Kỳ) có chiều cao tới 142 m với tuổi thọ đạt 3000 - 4000 năm, hay loài Ngân Hạnh (Ginkgo biloba) ở Sơn Đông, Trung Quốc cao tới 25 m với chu vi thân đạt tới 16 m. Nhưng trong đó cũng có loài lại được trồng làm cây cảnh như Thanh tùng (Juniprus chinensis), Tùng xà (Juniperus squamata), Thông la hán (Podocarpus chinensis),… ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [2]. Tại Việt Nam, đã phát hiện và xác định được khoảng 34 loài thuộc 5 họ trong lớp Thông (Pinopsida). Trong số đó 15 loài được tìm thấy ở khu vực Tây Nguyên (gồm các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lăk, Đắc Nông và Lâm Đồng) đó là: Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Pơ mu, Bách xanh núi đất, Thông nước, Du sam núi đất, Thông đà lạt, Thông ba lá, Thông hai lá, Thông lá dẹt, Thông lông gà, Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum), Kim giao núi đất (Nageia wallichiana), Thông tre lá dài, Dẻ tùng nam và Thông đỏ nam. Các loài này đều có giá trị kinh tế và ứng dụng trong y học [3] [4]. 1.1.1.1. Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii) Đỉnh tùng: Tên khoa học Cephalotaxus mannii Hook.f (Taxaceae) Năm 1995 tác giả K. E. Tripp đã xác định chi Cephalotaxus có mười loài [5]. Đến năm 1999 các tác giả L. Fu, N. Li và R. R. Mill đã xác định thêm một loài là C. latifolia Cheng and Fu [6]. Như vậy hiện nay trên thế giới chi Cephalotaxus được công nhận gồm 11 loài. Ở Việt Nam có 2 loài là C. mannii và C. oliveri [7]. 3
Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Cephalotaxus STT Tên khoa học STT Tên khoa học 1 C. fortune Hooker 7 C. latifolia Cheng and Fu 2 C. griffithii Hooker 8 C. mannii Hooker 3 C. hainanensis Li 9 C. oliveri Masters 4 C. harringtonia (Fobers) Koch 10 C. sinensis (Rehder and Wilson) Li 5 C. koreana Nakai 11 C. wilsoniana Hayata 6 C. lanceolata Feng  Mô tả hình thái: Cây gỗ nhỏ, thường xanh, cây trưởng thành có thể cao từ 10 - 15 m. Thân tròn, vỏ trơn nhẵn (vỏ non có màu đỏ, vỏ già bong thành mảng màu trắng). Cành mảnh, mọc đối và xòe ngang. Lá mọc xoắn ốc, xếp thành 2 dãy, hình dải, dài 2 - 4cm, rộng 0,2 - 0,4cm, thẳng hay hơi cong ở gần đầu, ở mặt dưới có 2 dải lỗ khí màu trắng. Mùa ra nón tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 8 - 10 năm sau. Đỉnh tùng tái sinh bằng hạt tốt, mọc rải rác trên các sườn và đỉnh núi đất và núi đá vôi với đội cao từ 600 - 1400 m [7].  Phân bố: Trên thế giới Đỉnh tùng phân bố ở khu vực Nam và Đông Nam Á bao gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Bắc Myanmar, Bắc Thái Lan. Tại Việt Nam loài này được ghi nhận có ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Cao Bằng, Hòa Bình, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia Lai, Lâm Đồng và Thanh Hóa [7]. Hình 1.1. Cây Đỉnh tùng (C. mannii) Tà Nung, Lâm Đồng và mẫu tiêu bản (nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) 4
 Công dụng: Gỗ Đỉnh tùng có chất lượng cao, chịu mối mọt, được sử dụng làm đồ gỗ cao cấp, đồ mỹ nghệ và cán công cụ. Vỏ cây được dùng chữa sốt tại đảo Hải Nam, Trung Quốc. Nó còn được sử dụng làm cây cảnh do các cây có hình dáng đẹp và độc đáo [7].  Đánh giá tình trạng bảo tồn: Trong sách Đỏ Việt Nam (2007) [8], loài Đỉnh tùng được đánh giá là sẽ nguy cấp VU A1,c,d, B1+2b,c. Trong danh lục đỏ của IUCN năm 2012, loài này được xếp VU A1d ở phạm vi toàn cầu. Căn cứ vào các dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn rừng nguyên sinh ở hầu khắp nước ta trong nhiều năm qua và đối chiếu với tiêu chuẩn của các thứ hạng trong Danh lục đỏ của IUCN nhận thấy loài Đỉnh tùng đáp ứng được các tiêu chuẩn VU A4a,c,d, B1,2a,b, C (sự suy giảm quần thể trong quá khứ, hiện tại và dự đoán tương lai nhiều nhất > 30%, EOO < 20.000 km2, AOO < 2.000 km2,, số lượng tiểu quần thể ≤ 20); tuy nhiên số lượng cá thể trưởng thành ước tính ≤ 2.500, thuộc khung EN chứ không phải VU) [3] [4]. 1.1.1.2. Hoàng đàn giả (Dacrydium elatum) Hoàng đàn giả còn có các tên gọi khác Hồng tùng, Bạch đàn, tên khoa học là Dacrydium elatum Wall.ex Hook (Podocarpaceae) [7]. Chi Dacrydium là một chi tương đối lớn, hiện nay chi này gồm 21 loài đã được xác định [9]. Ở Việt Nam theo tác giả Phạm Hoàng Hộ chỉ tìm thấy 1 loài là D. elatum [7]. Bảng 1.2. Các loài thực vật thuộc chi Dacrydium STT Tên khoa học STT Tên khoa học 1 D. araucarioides 12 D. leptophyllum 2 D. balansae 13 D. lycopodioides 3 D. beccarii 14 D. magnum 4 D. comosum 15 D. medium 5 D. cornwallianum 16 D. nausoriense 6 D.cupressium 17 D.nidulum 7 D.elatum 18 D. novoguineense 8 D. ericoides 19 D. pectinatum 9 D. gibbsiae 20 D. spathoides 10 D. gracile 21 D. xanthandrum 11 D. guillauminii 5
 Mô tả hình thái: Cây gỗ mọc đứng với thân ít cành nhánh, các cành mọc hướng lên tạo thành tán hình vòm nhỏ, chiều cao tới 30 m với đường kính ngang ngực tới 0,8 m. Cây mọc trong rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp, đôi khi ở vùng đất thấp hoặc núi trung bình trên các sườn núi (nhiệt độ trung bình năm khoảng 16-22 oC, lượng mưa trên 1700 mm) trên cả đất phong hóa từ granit hoặc các đá silicat khác cũng như trên các động núi đá vôi kết tinh trắng bị bào mòn mạnh. Gặp chủ yếu ở độ cao 700-2000 m trên mặt biển, hoặc có khi xuống gần mực nước biển như Kiên Giang (đảo Phú Quốc, nơi có nhiệt độ trung bình năm 26oC, lượng mưa năm trên 3000 mm). Trên thế giới, loài này chỉ hạn chế ở các vùng núi có độ cao trên 1000 m trên mặt biển. Ở các vùng núi thấp và trung bình loài này mọc cùng với Thông lá dẹt (Pinus krempfii), Thông đà lạt (Pinus dalatensis), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), Pơ mu (Fokienia hodginsii) và Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus) [7].  Phân bố: Trên thế giới loài Hoàng đàn giả được tìm thấy ở Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia. Ở Việt Nam loài này phân bố rộng khắp từ Hà Giang, Lai Châu, Tuyên Quang, xuống dọc dải Trường Sơn, từ Bắc (Hà Tĩnh) qua Trung (từ Quảng Bình, Kon Tum đến Gia Lai) đến Nam (Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa và Ninh Thuận) và kết thúc ở Nam Đông Dương (Kiên Giang) [7]. Hình 1.2. Cây Hoàng đàn giả (D. elatum) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản (Nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) 6
 Công dụng: Gỗ Hoàng đàn giả chịu ngâm và được sử dụng làm thuyền và cầu, đóng đồ gỗ. Nhựa dùng làm hương. Loài này còn có thể là nguồn cung cấp hoạt chất làm thuốc trừ sâu. Một số nơi ở Việt Nam loài này được dùng kết hợp với những cây khác để chữa kiết lị [9].  Đánh giá tình trạng bảo tồn: Căn cứ vào các dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn rừng nguyên sinh ở hầu khắp nước ta trong nhiều năm qua và đối chiếu với tiêu chuẩn của các thứ hạng theo danh lục đỏ của IUCN thấy loài đáp ứng được các tiêu chuẩn sẽ nguy cấp: VU A4a,c,d, B2b(ii, iii, v), C (sự suy giảm quần thể trong quá khứ, hiện tại và dự đoán tương lai nhiều nhất < 30%, EOO < 20.000 km2, AOO < 1.000 km2,, số lượng tiểu quần thể ≤ 20, số lượng cá thể trưởng thành ≤ 2500) [3] [4]. 1.1.1.3. Kim giao núi đất (Nageia wallichiana) Kim giao núi đất hay Thông mụ có tên khoa học là Nageia wallichiana (Presl) O. Ktze (Podocarpaceae), các tên đồng nghĩa khác là Podocarpus wallichianus (Presl), Decussocarpus wallichianus (Presl) de Laubenf [7]. Chi Kim giao (Nageia) là một chi nhỏ gồm 5 loài là N. nagi, N. wallichiana, N. fomosensis, N. motleyi và N. fleuryi [10]. Ở Việt Nam theo tác giả Phạm Hoàng Hộ chi này có 2 loài là N. nagi và N. wallichiana [7].  Mô tả hình thái: Cây gỗ mọc đứng, đơn tính khác gốc với tán hình nón, đạt chiều cao tới 30 m với đường kính ngang ngực tới 1 m. Vỏ màu nâu thẫm hay nâu xám, nhẹ, nhẵn, bóc tách thành các mảnh lớn không đều. Lá mọc đối hay gần đối nhau, chéo chữ thập, màu xanh đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn, dài tới 16 cm và rộng 5 cm ở cây trưởng thành, hình bầu dục hay hình trứng (dài tới 23 cm và rộng 7 cm ở cây non) với đỉnh nhọn, các dải lỗ khí ở cả hai mặt. Nón phân tính khác gốc. Cấu trúc mang hạt đơn độc ở nách lá, cuống dài tới 1,7 cm, đế phình ra dưới hạt, màu đen khi chín, phần quanh hạt màu đỏ hồng. Nón đực ở nách lá, cụm 3 - 5, dài tới 5 mm. Hạt hình cầu, đường kính 1,5 - 1,8 cm, có một mỏ nhỏ ở gần đầu. Cây gặp trong rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗ giao và cây lá rộng nhiệt đới gió mùa núi thấp và núi trung bình (nhiệt độ trung bình năm 14-230C, lượng mưa trên 1700 mm) trên đất phong hóa từ granit hoặc các loại đá silicat khác ở 7
độ cao 500-2100 m trên mặt biển. Đôi khi gặp ở mức mặt nước biển. Mọc cùng với Thông nàng (Dacrycarpus imbricatus), Đỉnh tùng (C. mannii), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), Thông đỏ nam (Taxus wallichiana) (phía Nam Việt Nam). Thỉnh thoảng có tái sinh tự nhiên, cây con hiếm (mặc dù gặp tương đối ít ở khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống) [7][10].  Phân bố: Trên thế giới loài này được bắt gặp ở Brunei, Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Myanmar, Malaysia, Indonesia, Philippine, và Papua New Guinea. Trong nước ở Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Quảng Ninh, Phú Thọ, Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên–Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm Đồng, Ninh Thuận, Bình Phước và Kiên Giang [7][10]. Hình 1.3. Cây Kim giao núi đất (N. wallichiana) ở Lâm Đồng và mẫu tiêu bản (nguồn Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam)  Công dụng: Gỗ Kim giao núi đất có giá trị cao, dùng làm nhạc cụ, đũa, đồ mỹ nghệ và các công cụ gia đình. Lá có thể dùng trong phương pháp chữa bệnh truyền thống chữa ho và cây đẹp trồng làm cảnh [7][10].  Đánh giá tình trạng bảo tồn: Độ suy giảm quần thể Kim giao núi đất ở Việt Nam trong quá khứ, hiện tại và tương lai ước tính không vượt quá 30% nên không thể 8