Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe ở vùng Bắc Trung Bộ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:157

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu chiết hỗn hợp các hợp chất từ quả thể bốn loài nấm H. tenuis, P. gilvus, P. baumiivà G. australe; sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của bốn loại nấm trên; xác định cấu trúc hóa học của những hợp chất phân lập được; thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe ở vùng Bắc Trung Bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỖ XUÂN HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN – 2020
2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỖ XUÂN HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ Mã số: 9440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS ĐẶNG NGỌC QUANG 2. GS. TS TRẦN ĐÌNH THẮNG NGHỆ AN - 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Vinh, ngày 28 tháng 10 năm 2020 Ký tên ĐỖ XUÂN HƯNG
ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS Đặng Ngọc Quang - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, GS.TS. Trần Đình Thắng - Trường Đại học Vinh là người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Lê Đức Giang, TS Đậu Xuân Đức cùng tất cả các thầy cô thuộc Viện Sư phạm Tự nhiên - Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình làm luận án. Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Vinh, Phòng Đào tạo Sau đại học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, người thân, đồng nghiệp và các người bạn của tác giả, những người đã luôn động viên và tiếp sức cho tác giả để hoàn thành bản luận án này. Nghệ An, ngày 28 tháng 10 năm 2020 ĐỖ XUÂN HƯNG
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... ii MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ............................................... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN.................................................................................................... 5 1.1. Tổng quan về chi Hexagonia ........................................................................................ 5 1.1.1. Đặc điểm hình thái, phân bố ...................................................................................... 5 1.1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ................................................................ 5 1.2. Nấm Hexagonia tenuis ................................................................................................. 6 1.2.1. Đặc điểm hình thái, phân bố ...................................................................................... 6 1.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ................................................................ 6 1.3. Tổng quan về chi Phellinus .......................................................................................... 7 1.3.1. Đặc điểm hình thái, phân bố. ..................................................................................... 7 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ................................................................ 7 1.4. Nấm Phellinus baumii ................................................................................................ 21 1.4.1. Đặc điểm hình thái, phân bố .................................................................................... 21 1.4.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .............................................................. 21 1.5. Nấm Phellinus gilvus ................................................................................................. 23 1.5.1. Đặc điểm hình thái, phân bố .................................................................................... 23 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .............................................................. 24 1.6. Tổng quan về chi Ganoderma .................................................................................... 25 1.6.1. Đặc điểm, phân bố và phân loại .............................................................................. 25 1.6.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .............................................................. 25 1.7. Nấm Ganoderma australe .......................................................................................... 26 1.7.1. Đặc điểm hình thái, phân bố .................................................................................... 26
iv 1.7.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học .............................................................. 27 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................... 29 2.1. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 29 2.1.1. Phương pháp lấy mẫu .............................................................................................. 29 2.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập ........................................................................... 29 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất ........................................................... 29 2.1.4. Phương pháp thử kháng vi sinh vật kiểm định ........................................................ 29 2.1.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư .................................... 30 2.2. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................................... 31 2.2.1. Hoá chất ................................................................................................................... 31 2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................................... 31 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm Hexagonia tenuis ..................................... 32 2.3.1. Thu mẫu ................................................................................................................... 32 2.3.2. Ngâm chiết và tạo cao chiết..................................................................................... 32 2.3.3. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate .............................................................. 32 2.3.4. Xác định cấu trúc của các hợp chất ......................................................................... 33 2.3.5. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất ..................................................... 33 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm Phellinus gilvus ......................................... 35 2.4.1. Thu mẫu ................................................................................................................... 35 2.4.2. Ngâm chiết và tạo cao chiết..................................................................................... 35 2.4.3. Phân lập các hợp chất từ cao chiết ethyl acetate ..................................................... 37 2.4.4. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất. ........................................................... 37 2.4.5. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất ..................................................... 38 2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm Phellinus baumii ....................................... 38 2.5.1. Thu mẫu ................................................................................................................... 38 2.5.2. Ngâm chiết và tạo cao chiết..................................................................................... 38 2.5.3. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate .............................................................. 40 2.5.4. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất ............................................................ 40 2.5.5. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất ..................................................... 40
v 2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm Ganoderma australe ................................. 40 2.6.1. Thu mẫu ................................................................................................................... 40 2.6.2. Ngâm chiết và tạo cặn chiết..................................................................................... 41 2.6.3. Phân lập các hợp chất từ cao chiết ethyl acetate ..................................................... 41 2.6.4. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất ............................................................ 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... 44 3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Hexagonia tenuis ............................... 44 3.1.1. Phân lập các hợp chất .............................................................................................. 44 3.1.2. Xác định cấu trúc ..................................................................................................... 44 3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Phellinus gilvus .................................. 68 3.2.1. Phân lập các hợp chất .............................................................................................. 68 3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ................................................................................ 68 3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Phellinus baumii ................................ 74 3.3.1. Phân lập các hợp chất .............................................................................................. 74 3.3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất ................................................................................ 75 3.4. Nấm Ganoderma australe .......................................................................................... 86 3.4.1. Phân lập các hợp chất .............................................................................................. 86 3.4.2. Xác định cấu trúc ..................................................................................................... 87 3.5.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm Hexagonia tenius ................ 95 3.5.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập từ nấm Phellinus gilvus.............. 96 3.5.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm Phellinus baumi .................. 97 KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 98 DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ....................................... 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 101 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 114
vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất và hoạt tính sinh học của loài nấm H. tenuis ................................. 6 Bảng 1.2. Các hợp chất steroid và hoạt tính sinh học của các loài nấm thuộc chi Phellinus ............................................................................................................................................. 8 Bảng 1.3 Hợp chất terpenoid được phân lập từ Phellinus ................................................. 12 Bảng 1.4. Hợp chất flavonoid được phân lập từ Phellinus ............................................... 17 Bảng 1.5. Các hợp chất styrylpyrone từ các loài Phellinus ............................................... 18 Bảng 1.6. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Phellinus ........................................... 20 Bảng 1.7. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của P. baumii................................. 22 Bảng 1.8. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Phellinus gilvus ...................... 25 Bảng 3.1 Các hợp chất được tách ra từ nấm H. tenuis ...................................................... 44 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H- and 13C-NMR của HTM1 (500 MHz, CD3OD) ..................... 56 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất HTM2 .............................................................. 60 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất HTM3 .............................................................. 63 Bảng 3.5. So sánh các giá trị phổ phổ 1H NMR và 13 C NMR của hợp chất HTM4 và Ergosterol........................................................................................................................... 65 Bảng 3.6. Các hợp chất được tách ra từ nấm Phellinus gilvus .......................................... 68 Bảng 3.7. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất PGE1 và hợp chất 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene........................................................................ 70 Bảng 3.8. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất PGE4 và (E) – 4- (3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one ............................................................................... 73 Bảng 3.9. Các hợp chất được tách ra từ nấm Phellinus baumii ........................................ 74 Bảng 3.10. Các giá trị phổ của hợp chất PBE2 và aldehyde 3,4-dihydroxylbenzoic........ 76 Bảng 3.11. Các giá trị phổ của hợp chất PBE3 và Methyl 3,4-dihydroxybenzoate .......... 77 Bảng 3.12. Giá trị phổ của hợp chất PBE4 và (E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one ... 79 Bảng 3.13. Các giá trị phổ của hợp chất PBE5 và inoscavin A ........................................ 85 Bảng 3.14. Các hợp chất được tách ra từ nấm Ganoderma australe ................................ 87 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GAM1 ........................................................... 88 Bảng 3.16. Số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất GAM2 .................................... 90
vii Bảng 3.17. Số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất GAM3 .................................... 91 Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất GAM4 ........................................................... 93 Bảng 3.19. Hoạt tính độc tế bào của các hợp chất HTM1-5 từ quả thể nấm của H. tenuis ........................................................................................................................................... 95 Bảng 3.20. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất PGE và PGE1 .................................................................................................................... 96 Bảng 3.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của cao chiết PGE và các hợp chất PGE1-3 ................................................................................... 97 Bảng 3.22. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của các chất PBE1, PBE4 và PBE5 .................................................................................................................................. 97
viii DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Nấm H. tenuis mặt trước và sau ........................................................................... 6 Hình 1.2. Nấm P. gilvus trong tự nhiên (a) và nấm P. gilvus được thu hái và đã xử lí ở Việt Nam (b) ...................................................................................................................... 24 Hình 1.3. Ganoderma australe lâu năm ............................................................................ 27 Hình 3.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất HTM1 ............................................................... 44 Hình 3.2. Phổ IR của hợp chất HTM1 .............................................................................. 45 Hình 3.3. Phổ 1H NMR của hợp chất HTM1 .................................................................... 46 Hình 3.4. Phổ 1H NMR của hợp chất HTM1 .................................................................... 46 Hình 3.5. Phổ 1H NMR của hợp chất HTM1 .................................................................... 47 Hình 3.6. Phổ 13C NMR của hợp chất HTM1 ................................................................... 47 Hình 3.7. Phổ 13C NMR của hợp chất HTM1 ................................................................... 48 Hình 3.8. Phổ 13C NMR của hợp chất HTM1 ................................................................... 48 Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất HTM1 ......................................................................... 49 Hình 3.10. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 49 Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 50 Hình 3.12. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 50 Hình 3.13. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 51 Hình 3.14. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 51 Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất HTM1 ..................................................................... 52 Hình 3.16. Phổ HSQC của hợp chất HTM1 ...................................................................... 53 Hình 3.17. Phổ HSQC của hợp chất HTM1 ...................................................................... 53 Hình 3.18. Phổ HSQC của hợp chất HTM1 ...................................................................... 54 Hình 3.19. Phổ COSY của hợp chất HTM1 ...................................................................... 54 Hình 3.20. Phổ COSY của hợp chất HTM1 ...................................................................... 55 Hình 3.21. Phổ COSY của hợp chất HTM1 ...................................................................... 55 Hình 3.22. Phổ COSY của hợp chất HTM1 ...................................................................... 56 Hình 3.23. Phổ 1H NMR của hợp chất HTM4 .................................................................. 64 Hình 3.24. Phổ 13C-NMR của hợp chất HTM4 ................................................................. 65
ix Hình 3.25. Phổ 1H NMR của hợp chất PGE1 .................................................................... 69 Hình 3.26. phổ 13C NMR của hợp chất PGE1 ................................................................... 69 Hình 3.27. Công thức phổ X-ray của hợp chất PGE1 ....................................................... 70 Hình 3.28. Một phần phổ 1H NMR của hợp chất PGE4 ................................................... 72 Hình 3.29. Một phần phổ 13C NMR của hợp chất PGE4 .................................................. 72 Hình 3.30. Một số tương tác H↔C trên phổ HMBC của hợp chất PGE4 ........................ 73 Hình 3.31. Phổ GC-MS của hợp chất PGE5 ..................................................................... 74 Hình 3.32. Phổ khối của hợp chất PBE5 ........................................................................... 80 Hình 3.33. Phổ 1H–NMR giãn của PBE5 .......................................................................... 81 Hình 3.34. Phổ 13C–NMR giãn của PBE5 ......................................................................... 82 Hình 3.35. Phổ HSQC giãn của PBE5 .............................................................................. 82 Hình 3.36. Phổ HMBC giãn của PBE5 ............................................................................. 83 Hình 3.37. Phổ HMBC giãn của PBE5 ............................................................................. 84
x DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 13 C-NMR Carbon-13 Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy carbon-13 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton CC Column Chromatography Sắc kí cột Đ.n.c. Melting point Điểm nóng chảy DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Phổ khối lượng phun mù điện tử Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết H→C HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-ESI-MS High Relution-Electron Spray Ionization Phổ khối lượng phân giải cao phun Mass Spectroscopy mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp Correlation H→C IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) Hằng số tương tác, tính bằng Hz ppm parts per million Phần triệu RT Retention time Thời gian lưu TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TMS Tetramethyl silane Tetramethyl silane TT Số thứ tự δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của carbon δH Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nấm là một giới riêng biệt, chúng là các sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm Eukaryote), tạo bào tử, không có chất diệp lục mà phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau. Nấm có hàm lượng chất béo thấp, hàm lượng protein cao, hàm lượng cao các vitamin (B, C. D, K), các khoáng chất (kali, photpho) và nguyên tố vi lượng (selen) và các chất xơ [54; 58]. Từ xa xưa, nấm đã được sử dụng rộng rãi trong đời sống không chỉ bởi hương vị, khẩu vị và thành phần dinh dưỡng, mà còn bởi những giá trị chữa bệnh của chúng. Thực tế, nấm được sử dụng làm thuốc được tìm thấy trong nhiều nền văn hoá xưa và nay như ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung và Bắc Mỹ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, nhiều hợp chất có hoạt tính kháng sinh, hoạt tính chống khối u và nhiều đặc tính dược động lực khác nữa được tìm thấy trong các loài nấm lớn [8; 58]. Thời gian gần đây, nguồn tài nguyên vô tận chứa các hợp chất có tác dụng sinh học (PSK (polysaccharide-K), PSP (polysaccharide-K)…) dùng để điều trị bệnh được các nhà khoa học chú ý đến nhiều là các loài nấm lớn [60]. Sự đa dạng về hệ sinh thái nấm ở Việt Nam thể hiện qua sự xuất hiện của ít nhất 651 loài nấm thuộc 182 chi chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học [99], những hợp chất này cho các khả năng chống ung thư, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con người [11; 19]. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ như triterpenoid, flavonoid,… có nguồn gốc từ nấm lớn đã được ghi nhận có khả năng kháng ung thư, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm [129]. Nấm dược liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhưng chưa được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học [2; 3; 6] . Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, là điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loại nấm. Cho đến nay, các nhà khoa học đánh giá sơ bộ nước ta có khoảng 22,000 loài nấm. Từ lâu, người Việt đã biết cách sử dụng nấm làm thực phẩm bổ dưỡng như nấm hương, nấm mỡ… làm các dược liệu điều trị các loại bệnh như nấm linh chi, phục linh…
2 Ngày nay, cuộc sống được cải thiện nhiều nhưng lại xuất hiện nhiều bệnh hiểm nghèo như ung thư… Do vậy, việc nghiên cứu nấm sử dụng trong y học được đặc biệt chú trọng. Nhờ sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật mà các nhà khoa học đã tìm ra nhiều hợp chất có khả năng kháng ung thư, chữa bệnh từ nấm. Trên thế giới đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu về nấm và thực tế đã chỉ ra rằng trong nấm có nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị chữa bệnh rất hữu hiệu. Ở Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc trong nhiều thế kỉ đã sử dụng nấm để ngăn ngừa các bệnh như rối loạn chức năng, xuất huyết, tiêu chảy và ung thư… [3; 7; 8]. Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe ở vùng Bắc Trung Bộ” bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại để phân tích, phân lập và xác định cấu trúc. Kết hợp thử nghiệm các hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng nấm và gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này. 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là quả thể bốn loài nấm H. tenuis, P. gilvus, P. baumii và G. australe được thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ, Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các hợp chất từ quả thể bốn loài nấm H. tenuis, P. gilvus, P. baumii và G. australe. - Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của bốn loại nấm trên. - Xác định cấu trúc hóa học của những hợp chất phân lập được. - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 4. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với pha tĩnh là silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích trên các cột silica gel pha đảo và pha thường. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Cấu trúc hoá học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-
3 NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu trúc lập thể tương đối của các hợp chất này được xác định bằng phương pháp phổ NOESY. - Thử các hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, ức chế tế bào ung thư. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống ở Việt Nam về thành phần hóa học của quả thể bốn loài nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe. 1. Từ dịch chiết quả thể nấm Hexagonia tenuis đã phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất: - 03 hợp chất triterpenoid: Hexagonin F, hexatenuin A, hexagonin B. Các hợp chất hexagonin F, hexagonin B lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này. Trong đó, hexagonin F là hợp chất mới. - 02 hợp chất sterol: Ergosterol, ergosterol peroxide. - Cả năm hợp chất đều có khả năng ức chế tế bào khối u SK-LU-1 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan), Hep3B (ung thư gan), SW480 (ung thư ruột kết) và MCF-7 (ung thư vú). Đây là các hoạt tính lần đầu tiên được khảo sát đối với các hợp chất này. 2. Từ dịch chiết quả thể Phellinus gilvus phân lập được 5 hợp chất: - 03 hợp chất phenolic: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; (E)-4-(3,4- dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one; 4,4’-dihydroxy-3,3’,6,6’-tetramethyl-[1,1’- bi(cyclohexane)]-3,3’,6,6’-tetraene-2,2’,5,5’-tetraone. - 02 hợp chất sterol: Ergosterol, ergosterol peroxide, các chất này đều có khả năng gây độc tế bào KB (ung thư biểu mô). 3. Từ dịch chiết quả thể nấm Phellinus baumii phân lập được 5 hợp chất: - 05 hợp chất polyphenol: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; aldehyde 3,4-dihydroxylbenzoic; methyl 3,4-dihydroxybenzoate; (E)-4-(3,4- dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one và inoscavin A. - Kết quả thử hoạt tính cho thấy hợp chất 1,2,4,5-tetrachloro-3,6- dimethoxybenzene (PBE1) không có hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB, hai hợp chất (E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one (PBE4) và inoscavin A (PBE5) có hoạt tính trung bình.
4 4. Từ dịch chiết quả thể nấm Ganoderma australe phân lập được 6 hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoid: Ganoderic acid Sz, ganoderic acid Y, ganoderal A, ganoderol B; - 02 hợp chất sterol: Ergosterol, ergosterol peroxide. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 115 trang với 30 bảng số liệu, 49 hình và 4 sơ đồ với 129 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: Mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (14 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (9 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 90 trang công thức cấu tạo và phổ của các hợp chất chọn lọc.
5 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Hexagonia 1.1.1. Đặc điểm hình thái, phân bố Hiện nay, theo Index Fungorum ghi nhận sự tồn tại của 41 loài nấm thuộc chi Hexagonia [36], [57]. Đặc điểm của chi Hexagonia thường mọc trên cây thân gỗ, không cuống, chia đôi, hình bán nguyệt, luôn dai, bề mặt thường trơn tru; thân nấm thường mỏng, có ba màu chủ đạo: màu nâu, tối, hoặc vàng; lỗ chân lông lục giác lớn, thường có một màu sắc nhẹ hơn; bào tử trong suốt, hình trụ, dài hơn 12 µm, mịn, mỏng, và có các bào tử ngắn hơn loài Coriolopsis [8]. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi, một số loài ở Châu Âu. Ở Châu Á gặp ở Trung Quốc, Việt Nam, Philippin... [23; 58]. 1.1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Số lượng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Hexagonia còn chưa nhiều. Mặc dù, hoạt tính sinh học của các loài trong chi này cũng rất đáng quan tâm khi chúng thể hiện một loạt các hoạt tính sinh học như khả năng chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng khối u,... Trong các năm 2009-2011, loài nấm H. speciosa là loài đầu tiên được tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học bởi nhóm Jiang M. Y. và cộng sự, đã phân lập từ dịch chiết ethyl acetate được 21 hợp chất cyclohexanoid từ loài này. Chúng có hoạt tính chống oxy hóa cao, hoạt tính kháng khối u bao gồm speciosin A-T, 5’-O- acetylaporpinon A và aporpinon A [46; 47]. Khi nghiên cứu thành phần hóa học của quả thể nấm H. tenuis năm 2014, nhóm nghiên cứu Akemi Umeyama đã phân lập được 3 hợp chất triterpenoid là hexatenuin A-C. Các hợp chất này có hoạt tính chống ung thư [113]. Ở Việt Nam, công trình luận án tiến sĩ của Nguyễn Thị Bích Ngọc (2015) đã báo cáo về thành phần dịch chiết quả thể nấm H. apiaria gồm có 7 hợp chất triterpenoid hexagonin A-E, hexatenuin A, ursolic acid và hai hợp chất sterol phổ biến trong các loài nấm là ergosterol, ergosterol peroxide. Các hợp chất này đều có khả năng kháng viêm [5; 110]. Như vậy cho đến nay, mới chỉ có ba loài nấm H. speciosa, H. tenuis và H. apiaria được nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy các hợp chất phân lập được chủ
6 yếu là cyclohexanoid, triterpenoid và steroid. Chúng có hoạt tính sinh học chủ yếu là chống oxi hóa, kháng u và kháng viêm. 1.2. Nấm Hexagonia tenuis 1.2.1. Đặc điểm hình thái, phân bố Họ: Polyporaceae Chi: Hexagonia Fr. Tên khoa học: Hexagonia tenuis (Hook.) Fr., syn. Hình 1.1 Nấm H. tenuis mặt trước và sau Mũ nấm tròn hoặc hình bán nguyệt, bề mặt hơi lõm, có các vòng đồng tâm, tạo thành rãnh, màu vàng. Nấm một năm, mọc đơn, không có cuống. Lỗ chân lông lục giác, màu vàng nâu khi già có màu xám nâu, thường lớn hơn ở trung tâm. Mọc trên các loài gỗ rụng lá, gây chết cây chủ [8]. Phân bố: Châu Á và một số đảo ở Thái Bình Dương và Úc [23; 58]. 1.2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Công trình đầu tiên về thành phần hóa học của loài nấm H. tenuis do Akemi M. và cộng sự thực hiện vào năm 2014, cho thấy sự hiện diện của 3 hợp chất antitrypanosomal là hexatenuin A-C. Các hợp chất này biểu hiện khả năng chống ung thư, đây là tiềm năng để phát triển dược liệu từ sản phẩm thiên nhiên [113]. Bảng 1.1 Các hợp chất và hoạt tính sinh học của loài nấm H. tenuis TT Hợp chất Hoạt tính TLTK 1 Hexatenuin A [113] 2 Hexatenuin B Chống ung thư [113] 3 Hexatenuin C [113]
7 1.3. Tổng quan về chi Phellinus 1.3.1. Đặc điểm hình thái, phân bố. 1.3.1.1. Giới thiệu chi Phellinus Họ: Hymenochaetaceae Chi: Phellinus Cho đến nay, trên thế giới đã tìm thấy 41 chi thuộc họ Hymenochaetaceae và 138 loài nấm thuộc chi Phellinus [16]. Một số loài nấm Phellinus đã được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung và Bắc Mỹ. Nhiều loài thuộc chi Phellinus đã được nghiên cứu và sử dụng làm thuốc chữa bệnh điển hình như: P. igrliurius, P. linteus, P. baumii, P. rhabarbarinus, P. pini…[3; 8; 19]. Chi Phellinus phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và Đông Á [3; 8]. 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới, hiện nay có khoảng 12 loài (P. igniarius, P. rhabarbarinus, P. linteus, P. pini, P. adamantinus, P. tremulae, P. tuberculosus, P. pomaceus, P. gilvus, P. torulosus, P. ribis, P. baumii) được nghiên cứu về thành phần hóa học. Các hợp chất được tìm thấy chủ yếu của các loài nấm thuộc chi Phellinus là các hợp chất steroid, terpenoid, flavonoid, polysaccharide và protein-polysaccharide, styrylpyrone, furane và polychlorinate... [72; 74; 128]. 1.3.2.1. Steroid Theo các tài liệu nghiên cứu về các loài nấm thuộc chi Phellinus cho thấy thành phần hóa học của chúng có nhiều hợp chất steroid. Năm 1969, Eﬁmenko đầu tiên công bố phân lập được ergosterol từ P. pini [24]. Trong các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học của các loài trong chi này cũng cho thấy cấu trúc khung của các steroid chủ yếu là ergostane và pregnane. Năm 2006, phellinol được nhóm nghiên cứu của Đặng Ngọc Quang phân lập từ một loài thuộc chi Phellinus, cùng với senexonol và ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one [97]. Năm 2007, các steroid tiếp tục được phân lập và xác định cấu trúc từ loài P. linteus bao gồm episterol, dehydroperoxide ergosterol, ergosterol peroxide, 6-O-
8 methyl cerevisterol [86]. Năm 2009, 5α-ergosta-7,22-dien-3-one được công bố phân lập từ loài P. gilvus bởi Liu và các cộng sự [80]. Năm 2010-2015, sáu hợp chất steroid là thành phần hóa học của loài P. igniarius bao gồm 3R,4S,5S,17R,20R-3,17,20-trihydroxy-4-methylpregn-8-en-7-one và ba dẫn xuất của heptanorergosterane phellinignincisterol A-B, 3α,17α,19,20- tetrahydroxy-4α-methylpregn-8-ene và 3α,12α,17α,20-tetrahydroxy-4α-methylpregn- 8-ene [120; 124]. Năm 2016, Liu tiếp tục phân lập được năm steroid là (22E,24R)-ergosta-5,7,22- trien-3β-ol, (22E,24R)-5α,6α-epoxyergosta-8-(14),22-dien-3β,7α-diol, (22E,24R)- 5α,6α-epoxyergosta-8,22-dien-3β,7α-diol, (22E,24R)-ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol, (22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxyergosta-7,22-dien-6-one từ loài P. rhabarbarinus [25]. Bảng 1.2. Các hợp chất steroid và hoạt tính sinh học của các loài nấm thuộc chi Phellinus TT Hợp chất Nguồn nấm Hoạt tính TLTK 1 Phellinol [97] 2 Senexonol [97] Phellinus sp. Ergosta-4,6,8(14),22- 3 [97] tetraen-3-one 4 Episterol [86] Dehydroperoxide 5 [86] ergosterol P. linteus 6 Ergosterol peroxide [86] 7 6-O-methyl cerevisterol [86] 5α-ergosta-7,22-dien-3- 8 P. gilvus [80] one 9 3R,4S,5S,17R,20R- [120] 3,17,20-trihydroxy-4- methylpregn-8-en-7-one P. igniarius 10 Phellinignincisterol A [120] 11 Phellinignincisterol B [120] 12 Phellinignincisterol C [120]