Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase và a-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to – Gymnema latifolium Wall. Ex Wight

Chia sẻ: Dopamine Grabbi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:243

Thêm vào BST

Báo xấu

38
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm xác định được thành phần hóa học chủ yếu của thân và lá của hai loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ở Việt Nam và đánh giá được tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase in vitro của các hợp chất phân lập được. Mời các bạn tham khảo nội dung đề tài!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase và a-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to – Gymnema latifolium Wall. Ex Wight

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Dương Thị Hải Yến NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR. EX SM. VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium WALL. EX WIGHT Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Dương Thị Hải Yến NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM -GLUCOSIDASE VÀ -AMYLASE CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH - Gymnema sylvestre (RETZ.) R.BR. EX SM. VÀ DÂY THÌA CANH LÁ TO - Gymnema latifolium WALL. EX WIGHT Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Phan Văn Kiệm PGS. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm Hà Nội – 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Phan Văn Kiệm và PGS. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 22 tháng 7 năm 2021 Tác giả luận án Dương Thị Hải Yến
ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm - người Thầy đã định hướng, tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Xuân Nhiệm - người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học và truyền đạt cho tôi rất nhiều kinh nghiệm quý giá Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, đồng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển về sự quan tâm giúp đỡ, với những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng phân giải cao hiện các phép thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α- amylase. Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm tiên tiến và hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ tôi đã giúp đỡ tôi thực hiện các phép thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α- amylase. Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Việt Nam (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí theo mã số đề tài 104.01-2017.25 Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn!
iii MỤC LỤC CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1. Giới thiệu về chi Gymnema ...........................................................................3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gymnema..................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ........................... 5 1.1.2.1. Loài Gymnema sylvestre .................................................................................. 5 1.1.2.2. Loài Gymnema latifolium ................................................................................ 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema ........................ 6 1.1.3.1. Các hợp chất steroid ......................................................................................... 6 1.1.3.2. Các hợp chất triterpenoid ................................................................................. 9 1.1.3.3. Phenolic và các hợp chất khác ....................................................................... 17 1.1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Gymnema ................................... 19 1.1.4.1. Hoạt tính trị bệnh tiểu đường ......................................................................... 19 1.1.4.2. Hoạt tính chống béo phì ................................................................................. 21 1.1.4.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................................. 21 1.1.4.4. Tác dụng bảo vệ gan ....................................................................................... 23 1.1.4.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định .......................................................... 23 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Gymnema ở Việt Nam............................................ 24 1.2. Khái quát về bệnh tiểu đường .....................................................................26 1.3. Khái quát về vai trò của enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase ....28 1.3.1. Khái niệm về enzyme ............................................................................................. 28 1.3.2. Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)............................................................................ 28 1.3.3. Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20).................................................................... 29 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................31 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................31 2.1.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm....................................................... 31 2.1.2. Loài Gymnema latifolium Wall. ex Wight ........................................................... 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................32 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất ................................................................... 32 2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................................. 32 2.2.1.2. Sắc ký cột (CC) ............................................................................................... 32 2.2.1.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)............................................................... 32 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc............................................................................ 32 2.2.2.1. Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS).................. 32 2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................................ 32 2.2.2.3. Độ quay cực..................................................................................................... 33 2.2.2.4. Phương pháp xác định đường ........................................................................ 33 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ........................................................... 34
iv 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase................ 34 2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase...................... 35 2.3. Phân lập các hợp chất ..................................................................................36 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài G. sylvestre .......................................................... 36 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài G. latifolium ........................................................ 39 2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được ........42 2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre .......... 42 2.4.1.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới) ........................................... 42 2.4.1.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới)............................................ 42 2.4.1.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới)............................................ 42 2.4.1.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới) ........................................... 42 2.4.1.5. Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới) ............................................. 42 2.4.1.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới) ..................................... 43 2.4.1.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới) ..................................... 43 2.4.1.8. Hợp chất GS8: vetircilloside M..................................................................... 43 2.4.1.9. Hợp chất GS9: verticilloside D ..................................................................... 43 2.4.1.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F............................................................ 43 2.4.1.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F ........................ 44 2.4.1.12. Hợp chất GS12: stephanoside I ................................................................... 44 2.4.1.13. Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......................................................... 44 2.4.1.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 ........................................................... 44 2.4.1.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......... 44 2.4.1.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX ................................................................ 45 2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium ........ 45 2.4.2.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D (hợp chất mới) ......................................... 45 2.4.2.5. Hợp chất GL5: verticilloside J ...................................................................... 46 2.4.2.6. Hợp chất GL6: lucyoside H........................................................................... 46 2.4.2.7. Hợp chất GL7: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (xem hợp chất GS13) .................... 46 2.4.2.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester.......... 46 2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được .............46 2.5.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ................................. 46 2.5.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất ....................................... 47 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ................................................................49
v 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được ..................................49 3.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất pregnane glycoside đã phân lập được ........................................................................................................................................... 50 3.1.1.1. Đặc điểm phổ 1H NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G. latifolium và G. sylvestre.............................................................................................. 51 3.1.1.2. Đặc điểm phổ 13C NMR của các hợp chất pregnane glycoside phân lập từ G. latifolium và G. sylvestre ........................................................................................ 52 3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre ........... 53 3.1.2.1. Hợp chất GS1: gymsyloside A...................................................................... 53 3.1.2.2. Hợp chất GS2: gymsyloside B ...................................................................... 62 3.1.2.3. Hợp chất GS3: gymsyloside C...................................................................... 64 3.1.2.4. Hợp chất GS4: gymsyloside D...................................................................... 66 3.1.2.5. Hợp chất GS5: gymsyloside E ...................................................................... 68 3.1.2.6. Hợp chất GS6: gymnepregoside R ............................................................... 70 3.1.2.7. Hợp chất GS7: gymnepregoside T................................................................ 73 3.1.2.8. Hợp chất GS8: Vetircilloside M ................................................................... 75 3.1.2.9. Hợp chất GS9: verticilloside D ..................................................................... 77 3.1.2.10. Hợp chất GS10: gymnepregoside F............................................................ 79 3.1.2.11. Hợp chất GS11: 12-O-(E)-cinnamoylgymnepregoside F ........................ 81 3.1.2.12. Hợp chất GS12: stephanoside I ................................................................... 83 3.1.2.13. Hợp chất GS13: 3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......................................................... 84 3.1.2.14. Hợp chất GS14: gymnemoside-W1 ........................................................... 87 3.1.2.15. Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester .......... 89 3.1.2.16. Hợp chất GS16: alternoside XIX ................................................................ 91 3.1.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài G. latifolium .......... 93 3.1.3.1. Hợp chất GL1: gymlatifoside A ................................................................... 93 3.1.3.2. Hợp chất GL2: gymlatifoside B.................................................................... 95 3.1.3.3. Hợp chất GL3: gymlatifoside C.................................................................... 98 3.1.3.4. Hợp chất GL4: gymlatifoside D ................................................................. 100 3.1.3.5. Hợp chất GL5: verticilloside J .................................................................... 102 3.1.3.6. Hợp chất GL6: lucyoside H......................................................................... 104 3.1.3.7. Hợp chất GL7:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester ................................................................ 106 3.1.3.8. Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl ester........ 106 3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được ...............................108 3.2.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất ............................... 108 3.2.2. .Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất .................................... 110 KẾT LUẬN ............................................................................................................112
vi NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.....................................................114 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................116
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13 C NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 spectroscopy 1 H NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton spectroscopy 2-NBDG 2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3- 2-Deoxy-2-[ (7-nitro-2,1,3- benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose 3T3-L1 Tế bào mô mỡ ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid 6-sulfonic acid All 6-Deoxy-3-oxymethylallopyranose Đường 6-deoxy-3- oxymethylallopyranose ALP Alkaline phosphatase Enzymme alkaline phosphatase ALT Alanine aminotransferase Enzymme alanine aminotransferase BHT Butylated hydroxytoluene Butylated hydroxytoluene C.C Chromatography column Sắc ký cột Can Canaropyranose Đường canaropyranose COSY Correlation spectroscopy Phổ COSY Cym Cymaropyranose Đường cymanopyranose DEPT Distortionless enhancement by Phổ DEPT polarization transfer DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Glc Glucose Đường glucose HDL High density lipoprotein cholesterol Lipoprotein mật độ cao HL7702 Tế bào gan ở người HMBC Heteronuclear mutiple bond correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HPLC High pressure liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear singlequantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết correlation IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm LDH Lactate dehydrogenase Enzyme lactate dehydrogenase
viii LDL Low density lipoprotein lipoprotein mật độ thấp MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide diphenyltetrazolium bromide ROESY Rotating frame Overhause Effect Phổ ROESY Spectroscopy OD Optical density Mật độ quang Ole Oleandropyranose Đường oleandropyranose pNPG 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside TBARS Thiobarbituric acid reactive substances Các chất phản ứng với axit thiobarbituric TGs Triglyceride Triglyceride Thv Thevetopyranose Đường thevetopyranose TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo VLDL Very low density lipoprotein Lipoprotein mật độ rất thấp
ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema ............................................... 4 Bảng 1.2. Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam ................................................... 5 Bảng 1.3. Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema........................................................ 7 Bảng 1.4. Các hợp chất triterpennoid khung oleanane từ chi Gymnema ......................... 9 Bảng 1.5. Các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema .................... 16 Bảng 1.6. Phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema ..................................................... 17 Bảng 2.1. Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân...................................... 34 Bảng 2.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G.sylvestre ................................ 47 Bảng 2.3. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G. latifolium ............................. 47 Bảng 2.4. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất phân lập từ G. sylvestre..................... 47 Bảng 2.5. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất từ loài G. latifolium............................ 48 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS1................................................................................ 57 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS2 và hợp chất tham khảo ...................................... 63 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS3 và chất tham khảo .............................................. 65 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS4 và chất tham khảo .............................................. 67 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS5 và chất tham khảo .............................................. 69 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS6 và chất tham khảo .............................................. 71 Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS7................................................................................ 74 Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS8................................................................................ 76 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS9 và hợp chất tham khảo ...................................... 78 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS10 và hợp chất tham khảo .................................. 80 Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS11 và hợp chất tham khảo .................................. 82 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS12 và hợp chất tham khảo .................................. 84 Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS13 và hợp chất tham khảo .................................. 86 Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS14 và hợp chất tham khảo .................................. 88 Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS15 và hợp chất tham khảo .................................. 90 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS16 và hợp chất tham khảo .................................. 92 Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL1 ............................................................................. 94 Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL2 ............................................................................. 97 Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL3 ............................................................................. 99 Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL4 ...........................................................................101 Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL5 và hợp chất tham khảo ..................................103 Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL6 và hợp chất tham khảo ..................................105 Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL8 và hợp chất tham khảo ..................................107
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema....................................................................... 3 Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema......................................... 9 Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane từ chi Gymnema ................................. 15 Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema ...... 17 Hình 1.5. Cấu trúc các phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema............................... 19 Hình 1.6. Ý nghĩa của việc ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase trong giảm đường huyết........................................................................................................................................... 27 Hình 2.1. Dây thìa canh (G. sylvestre) .............................................................................................. 31 Hình 2.2. Dây thìa canh lá to (G. latifolium)................................................................................... 31 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. sylvestre ........................................................... 38 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium........................................................... 41 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. sylvestre............................. 49 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. latifolium. .......................... 50 Hình 3.3. Cấu trúc khung pregnane .................................................................................................. 51 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS1................................................................................ 53 Hình 3.5. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất GS1 ........................... 55 Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS1................................................................................. 58 Hình 3.7. Phổ 1H NMR của hợp chất GS1....................................................................................... 58 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS1 ..................................................................................... 59 Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của hợp chất GS1................................................................................... 59 Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất GS1 ........................................................................................ 60 Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất GS1 ....................................................................................... 60 Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất GS1 ......................................................................................... 61 Hình 3.13. Phổ ROESY của hợp chất GS1 ...................................................................................... 61 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS2.............................................................................. 62 Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GS2 ............................................. 63 Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS3.............................................................................. 64 Hình 3.17. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS3 ......................................... 65 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS4.............................................................................. 66 Hình 3.19. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS4 ......................................... 66 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS5.............................................................................. 68 Hình 3.21. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS5 ......................................... 70 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS6.............................................................................. 70 Hình 3.23. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS6 ......................................... 72
xi Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS7.............................................................................. 73 Hình 3.25. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS7 ......................................... 75 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS8.............................................................................. 75 Hình 3.27. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS8 ......................................... 77 Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS9....................... 77 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS10 .................... 79 Hình 3.30. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS11 .................... 81 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS12 .................... 83 Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS13 .................... 84 Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS14 .................... 87 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS15 .................... 89 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS16 .................... 91 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1 ............................................................................. 93 Hình 3.37. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL1 ............................................. 95 Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2 ............................................................................. 95 Hình 3.39. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL2 ............................................. 96 Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3 ............................................................................. 98 Hình 3.41. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL3 ............................................. 98 Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4 ...........................................................................100 Hình 3.43. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL4 ...........................................102 Hình 3.44. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL5 ....................102 Hình 3.45. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL6 ....................104 Hình 3.46. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL8 ....................106 Hình 3.47. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre................................................................................................................................................109 Hình 3.48. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium ...............................................................................................................................................................109 Hình 3.49. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre .....110 Hình 3.50. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium ...............................................................................................................................................................110
1 MỞ ĐẦU Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Trong giai đoạn mới phát bệnh bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước, về lâu dài gây phá hủy các hệ thống trên cơ thể, đặc biệt là các mạch máu và dây thần kinh. Theo thời gian, bệnh tiểu đường có thể dẫn đến mù, suy thận và tổn thương thần kinh. Tiểu đường cũng là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình hình thành xơ vữa động mạch, dẫn đến đột quỵ, bệnh tim mạch. Các biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân. Nhưng nói chung, nếu kiểm soát tốt đường huyết, chúng ta có thể ngăn ngừa hoặc làm chậm hay nhẹ đi các biến chứng mãn tính của bệnh tiểu đường [1]. Xu hướng sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên nói chung, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị một số bệnh nhiệt đới và những bệnh hiểm nghèo đã và đang là mối quan tâm không chỉ của ngành dược ở nước ta mà còn của các nước trong khu vực cũng như các nước trên thế giới. Nhiều cây thuốc bản địa đã được phát hiện có tác dụng làm hạ đường huyết. Đây là một lợi thế vì khả năng cung cấp nguyên liệu để điều trị cũng như ít tác dụng phụ. Theo thống kê, trên thế giới có khoảng 800 loài được cho là có khả năng điều trị bệnh tiểu đường [2]. Tiêu biểu trong số đó là các loài: dây thìa canh (G. sylvestre), mướp đắng (Momordica charantia), cải bẹ xanh (Brassica Juncea), bồ công anh (Elephantopus scaber), cỏ tóc tiên (Liriope spicata), thầu dầu (Ricinus communis), khoai sâm (Smallanthus sonchifolius), trạch lan (Vernonia anthelmintica), … Các loài thuộc chi Gymnema thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) đã nhận được rất nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các loài thuộc chi Gymnema được coi như là nguồn cung cấp các hoạt chất và thể hiện các hoạt tính sinh học (hạ đường huyết, kháng tế bào ung thư, chống oxi hóa, kháng viêm, …). Đặc biệt, loài G. sylvestre được sử dụng rộng rãi như là một loại thảo dược chuyên trị bệnh tiểu đường từ trên 2000 năm ở Ấn Độ. Loài này còn được dùng để điều trị hen suyễn, đau mắt, viêm và rắn cắn. Bên cạnh đó, G. sylvestre có tính kháng khuẩn và bảo vệ tế bào gan. Tuy nhiên ở Việt Nam chỉ mới có một vài nghiên cứu về thành phần hóa học và dược học của loài Gymnema sp. Xuất phát từ điểm đó,
2 chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. ex Wight”. Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án là xác định được thành phần hóa học chủ yếu của thân và lá của hai loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ở Việt Nam và đánh giá được tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase in vitro của các hợp chất phân lập được. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ thân và lá loài G. sylvestre và G. latifolium ở Việt Nam. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học. 3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Gymnema 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gymnema Chi Gymnema (chi Lõa ti) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Các cây thuộc chi này là cây leo, không có rễ phụ trên thân, lá mọc đối, không nạc, cụm hoa xim, tán hoặc chùm, hoa nhỏ, có thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai hoa vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, thường có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót dính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị- nhụy hình ống nhọn đầu. Gymnema sylvestre [3] Gymnema reticulatum[3] Gymnema foetidum [3] Gymnema inodorum[4] Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema Theo thống kê của hiệp hội các nhà thực vật học thế giới “http://www.theplantlist.org”, thư viện trực tuyến về danh mục các loài thực vật học trên thế giới, chi Gymnema hiện nay có 52 loài được công nhận (xem Bảng 1.1).
4 Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema TT Tên khoa học Phân bố TT Tên khoa học Phân bố 1 G. acuminatum Wall. Nepal, Ấn Độ, 27 G. Trung Quốc Malaysia longiretinaculatum Tsian g 2 G. albidum Decne. Timor 28 G.lushaiense M.A.Rahm Assam an & Wilcock 3 G. albiflorum Costantin Việt Nam 29 G. macrothyrsa Warb. Sulawesi 4 G. brevifolium Benth. Úc 30 G. maingayi Hook.f. Malacca 5 G. calycinum Schltr. Luzon 31 G. mariae Schltr. Philippin 6 G. chalmersii Schltr. New Guinea 32 G. micradenium Benth. Queenland 7 G. cumingii Schltr. Philippin 33 G. molle Wall. ex Wight Myanmar 8 G. cuspidatum Ấn Độ, Sri 34 G. montanum Hook.f. Ấn Độ (Thunb.) Kuntze Lanka 9 G. decaisneasum Tamil Nadu 35 G. montanum var. beddo mei Hook.f. 10 G. dissitiflorum Ridl. Malaysia 36 G. muelleri Benth. Úc 11 G. dunnii (Maiden & Úc 37 G. pachyglossum Schltr. Luzon Betche) P.I.Forst. 12 G. elegans Wight & Tamil Nadu 38 G. piperii Schltr. Mindanao Arn. 13 G. erianthum Decne. New 39 G. pleiadenium F.Muell. Queenland Caledonia 14 G. foetidum Tsiang Việt Nam, 40 G. recurvifolium Blume New Guinea Trung Quốc 15 G. glabrum Wight Myanmar 41 G. rotundatum Thwaites Sri Lanka 16 G. griffithii Craib Thái Lan, Việt 42 G. rufescens Decne. Madagasca Nam 17 G. hainanense Tsiang Trung Quốc 43 G. Philippin schlechterianum Warb. 18 G. hirtum Ridl. Malaysia 44 G. spirei Costantin Lào 19 G. inodorum (Lour.) Trung Quốc, 45 G. New Guinea Decne. Ấn Độ, Đông suborbiculare K.Schum. Nam Á 20 G. javanicum Koord. Java 46 G. sylvestre (Retz).R.Br. Việt Nam, ex Sm. Trung Quốc, Ấn Độ 21 G. Maharashtra 47 G. syringaefolium Việt Nam, khandalense Santapau (Decne.) Costantin Timor 22 G. Ấn Độ 48 G. thorelii Costantin Lào kollimalayanum A.Ram ach & M.B.Viswan 23 G. lacei Craib Myanma, 49 G. tricholepis Schltr. New Guinea Bangladesh 24 G. lactiferum (L.) R.Br. Ân Độ, 50 G. trinerve R.Br. Úc ex Schult. Siriranka 25 G. latifolium Wall. ex Trung Quốc, 51 G. uncarioides Schltr. Luzon Wight Việt Nam 26 G. littorale Blume Java 52 G. yunnanense Tsiang Trung Quốc
5 Theo danh lục các loài thực vật Việt Nam [2], chi Gymnema tại Việt Nam hiện có 8 loài là G. albiflorum Cost, G. alternifolium (Lour.) Merr., G. foetidum Tsiang, G. griffithii Craib, G. inodorum (Lour.) Decne, G. latifolium Wall ex Wight, G. reticulatum (Moon) Alston và G. sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult. Bảng 1.2. Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam TT Tên khoa học Tên thường dùng Phân bố 1 G. albiflorum Cost Lõa ti hoa trắng Hà Tây 2 G. alternifolium (Lour.) Lõa ti xen Ninh Thuận Merr 3 G. foetidum Tsiang Lõa ti thối Đắc Lắc, các tỉnh phía bắc 4 G. griffithii Craib Kon Tum 5 G. inodorum (Lour.) Rau mỏ Bắc Kạn, Thái Nguyên, Decne Hòa Bình, Ninh Bình, 6 G. latifolium Wall ex Thìa canh lá to Hòa Bình, Ninh Bình, Wight Kon Tum 7 G. reticulatum (Moon) Lõa ti mạng, Dây Bà Rịa-Vũng Tàu Alston thìa canh gân mạng 8 G. sylvestre (Retz) R. Br. Lõa ti rừng, Dây Bắc Giang, Hải Phòng, ex Sm thìa canh, Dây Hải Dương, Ninh Bình, muôi. Thanh Hóa, Kon Tum 1.1.2. Giới thiệu về loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium 1.1.2.1. Loài Gymnema sylvestre Tên khoa học: Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex. Sm Tên thường gọi: Dây thìa canh, Dây muôi Chi: Gymnema Họ: Apocynaceae Mô tả về thực vật: Loài G. sylvestre, tên tiếng Việt là Dây thìa canh, Dây muôi, là loại dây leo cao 6-10m, nhựa mủ màu vàng, thân có lông dài 8-12 cm, to 3 mm, có lỗ bì thưa. Lá có phiến bầu dục thon ngược xoan dài 6-7 cm, rộng 2.5-5 cm, đầu nhọn, có mũi, gân bên 4-6 đôi, rõ ở mặt dưới, nhăn lúc khô, cuống dài 5-8 mm. Hoa nhỏ màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, cao 8 mm, rộng 12-15 mm, đài có lông mịn và rìa lông, tràng không lông ở mặt ngoài, tràng phụ là 5 răng. Quả đại dài 5.5 cm, rộng ở nửa dưới, hạt dẹt, lông mào dài 3 cm [3]. Sinh thái : mọc leo lên các bờ bụi, hàng rào.
6 Công dụng trong y học cổ truyền: trị tiểu đường, rắn cắn. Ngoài ra, phần trên mặt đất còn có thể dùng để trị phong thấp tê bại, chữa các vết thương do dao, đạn [3]. Phân bố: Bắc Giang, Hải Phòng, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum. 1.1.2.2. Loài Gymnema latifolium Tên khoa học: G. latifolium Wall. ex Wight Tên thường gọi: Lõa ty lá rộng, Thìa canh lá to Chi: Gymnema Họ: Apocynaceae Mô tả về thực vật: Loài G. latifolium có tên tiếng Việt là Lõa ti lá rộng, Thìa canh lá to, là loại cây thân leo, có thể dài tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1.5-4 cm. Lông dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm, cuống cụm hoa 1-1.5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [5]. Phân bố: Hòa Bình, Ninh Bình, Kon Tum. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema Các loài thuộc chi Gymnema đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu. Đặc biệt, các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào loài G. sylvestre. Số còn lại ít được nghiên cứu về hóa học (chủ yếu là G. tingens, G. griffithii, G. montanum, G. inodorum và G. alternifolium). Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này đã chỉ ra sự có mặt của các hợp chất steroid, terpenoid, phenolic, flavonoid. Các hợp chất này thể hiện hoạt tính hạ đường huyết, chống béo phì, kháng khuẩn, bảo vệ gan và chống oxy hóa. 1.1.3.1. Các hợp chất steroid Steroid là một nhóm chất đặc trưng của chi Gymnema, các hợp chất steroid xuất hiện chủ yếu dưới dạng khung pregnane với các chuỗi phần tử giả đường, bao gồm cymarose (cym), 6-deoxy-3-oxymethylallopyranose (all), D-thevetopyranose (thv), oleandropyranose (ole) và canaropyranose (can) và digitoxose (dig).
7 Bảng 1.3. Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema TT Tên chất Bộ phận Loài TLTK 1 Gymnepregoside A Rễ G. alternifolium [6] 2 Gymnepregoside B Rễ G. alternifolium [6] 3 Gymnepregoside C Rễ G. alternifolium [6] 4 Gymnepregoside D Rễ G. alternifolium [6] 5 Gymnepregoside E Rễ G. alternifolium [6] 6 Gymnepregoside F Rễ G. alternifolium [6] 7 Stephanoside O Rễ G. alternifolium [6] 8 Stephanoside J Rễ G. alternifolium [6] 9 Gymnepregoside G Rễ G. alternifolium [7] 10 Gymnepregoside H Rễ G. alternifolium [7] 11 Gymnepregoside I Rễ G. alternifolium [7] 12 Gymnepregoside J Rễ G. alternifolium [7] 13 Gymnepregoside K Rễ G. alternifolium [7] 14 Gymnepregoside L Rễ G. alternifolium [7] 15 Gymnepregoside M Rễ G. alternifolium [7] 16 Gymnepregoside N Rễ G. alternifolium [7] 17 Gymnepregoside O Rễ G. alternifolium [7] 18 Gymnepregoside P Rễ G. alternifolium [7] 19 Gymnepregoside Q Rễ G. alternifolium [7] 20 Stephanoside J Rễ G. alternifolium [7] 21 Gymsylvestrosides A Thân G. sylvestre [8] 22 Gymsylvestrosides B Thân G. sylvestre [8] 23 Gymsylvestrosides C Thân G. sylvestre [8] 24 Gymsylvestrosides D Thân G. sylvestre [8] 25 Gymnemogriffithoside A Quả G. grifﬁthii [5] 26 Gymnemogriffithoside B Quả G. grifﬁthii [5] 27 Gymnemogriffithoside C Quả G. grifﬁthii [5] 28 Gymnemogriffithoside D Quả G. grifﬁthii [5] 29 Gymnemogriffithoside E Quả G. grifﬁthii [5] 30 Gymnemogriffithoside F Quả G. grifﬁthii [5] 31 Gymnemogriffithoside G Quả G. grifﬁthii [5] 32 Gymnemogriffithoside H Quả G. grifﬁthii [5]