Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:133

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Hóa học "Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân" trình bày nghiên cứu, tối ưu hóa quá trình lên men thu sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn; Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn ưa mặn; Tổng hợp liposome có chứa canthxanthin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nhằm nâng cao chất lượng và mầu sắc thịt cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẶNG VIỆT ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẶNG VIỆT ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số chuyên ngành: 9.52.03.01 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Quốc Long 2. TS. Phạm Hồng Hải Hà Nội - 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS Phạm Quốc Long và TS Phạm Hồng Hải. Các kết quả và số liệu thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực, chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Đặng Việt Anh 1
LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với sự kính trọng, cùng tấm lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ sự biết ơn tới GS.TS. Phạm Quốc Long và TS. Phạm Hồng Hải là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin cảm ơn tới tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các Sản phẩm thiên nhiên, phòng Công nghệ và thiết bị hóa học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện công nghiệp thực phẩm, Trung tâm công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 1 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, giúp đỡ, khích lệ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận án Đặng Việt Anh 2
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................1 LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................2 MỤC LỤC ......................................................................................................................3 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. 8 DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................9 DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................11 MỞ ĐẦU .......................................................................................................................13 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................14 1.1. Vài nét về Carotenoid ...........................................................................................14 1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin ...............................................................................14 1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin ................................................................. 15 1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin.............................................................. 15 1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản .................. 16 1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin ........................................................................... 16 1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin......................................17 1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus .................................................................17 1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin ............................................................... 18 1.3.3.1. Nhu cầu về NaCl ............................................................................................. 19 1.3.3.2. Nguồn carbon và nitơ .....................................................................................20 1.3.3.3. Nguyên tố vi lượng.......................................................................................... 20 1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin...............................................................................................................21 1.3.4.1. Tỷ lệ giống .......................................................................................................21 1.3.4.2. Nhiệt độ ............................................................................................................21 1.3.4.3. Sự cung cấp oxy .............................................................................................. 21 1.3.4.4. Độ pH môi trường...........................................................................................22 1.3.4.5. Thời gian lên men ...........................................................................................22 1.3.4.6. Phương pháp lên men ....................................................................................22 1.4. Thu hồi sản phẩm .................................................................................................24 1.4.1. Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật .................................................................. 24 1.4.1.1. Phương pháp lọc ............................................................................................. 25 3
1.4.1.2. Phương pháp ly tâm ....................................................................................... 25 1.4.1.3. Phương pháp lắng........................................................................................... 25 1.4.2. Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật ...................................................................... 26 1.5. Các phương pháp trích ly và tinh chế canthaxanthin .......................................27 1.5.1. Các phương pháp phá hủy thành tế bào .........................................................27 1.5.1.1. Các phương pháp cơ học gián đoạn .............................................................. 27 1.5.1.2. Các phương pháp cơ học không gián đoạn ..................................................28 1.5.2. Nguyên lý hoạt động của quá trình chiết xuất bằng siêu âm ........................ 31 1.5.3. Ảnh hưởng các thông số chiết siêu âm ............................................................ 31 1.5.3.1. Thông số vật lý ................................................................................................ 31 1.5.3.2. Thông số môi trường ...................................................................................... 33 1.6. Giới thiệu về liposome và ứng dụng của liposome ............................................ 35 1.6.1. Giới thiệu về liposome ....................................................................................... 35 1.6.1.1. Lịch sử liposome ............................................................................................. 35 1.6.1.2. Cấu tạo của liposome ..................................................................................... 35 1.6.1.3. Ứng dụng của liposome .................................................................................. 36 1.6.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome .............................................. 37 1.6.2. Nghiên cứu và ứng dụng liposome trong nuôi cá hồi vân .............................. 38 1.7. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng trong tối ưu hóa ........... 38 1.8. Giới thiệu về cá hồi vân và nghề nuôi cá hồi nước lạnh ................................... 40 1.8.1. Phân loại ............................................................................................................. 40 1.8.2. Tình hình nuôi cá hồi tại trên thế giới và Việt Nam....................................... 40 1.8.2.1. Tình hình nuôi cá hồi vân trên thế giới ........................................................ 40 1.8.2.2. Tình hình nuôi cá hồi vân tại Việt Nam ....................................................... 40 1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi ................................................... 41 1.8.3.1. Nhiệt độ............................................................................................................ 41 1.8.3.2. Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH ..................................................................... 41 1.8.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng và thức ăn của cá hồi vân .......................................... 42 1.8.3.4. Nhu cầu protein .............................................................................................. 42 1.8.3.5. Nhu cầu về lipid acid béo ............................................................................... 42 1.8.3.6. Nhu cầu vitamin và khoáng chất................................................................... 43 1.8.3.7. Nhu cầu carotenoids ....................................................................................... 44 4
1.8.3.8. Phát triển thức ăn cho cá hồi ở Việt Nam .................................................... 44 1.8.4. Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam ........ 45 CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................................................................46 2.1. Nguyên vật liệu .....................................................................................................46 2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ... 46 2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ............. 46 2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome .............................................. 46 2.2. Thiết bị máy móc ..................................................................................................46 2.2.1. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ................. 46 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ........................... 47 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome ........................................................... 47 2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................47 2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ........................... 47 2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật ............................................ 47 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin ...................................... 47 2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin...................................... 49 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ................. 49 2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid ........................................................... 49 2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ..... 50 2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng ....................................................................... 50 2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................. 50 2.4. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa canthaxanthin .............................................................................................................. 51 2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin ........ 51 2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi ....................................................................................................................................... 51 2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quá trình công nghệ .....52 2.6. Phân tích thống kê ................................................................................................ 54 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ...............................................................................55 3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn .....................................................55 3.1.1. Lựa chọn thành phần môi trường ....................................................................55 5
3.1.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin .............................................................................................................. 57 3.1.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 57 3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ......................... 58 3.1.5. Lựa chọn mô hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 59 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 60 3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin ...................................................61 3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp .............. 61 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết xuất canthaxanthin ......................................................................................................62 3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết ........................... 62 3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến quá trình chiết ....................................................................................................................................... 63 3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết .............................. 63 3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến quá trình chiết ............... 63 3.2.3. Xây dựng mô hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm ............... 64 3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome .........................................................66 3.3.1. Quá trình tổng hợp liposome ............................................................................ 66 3.3.2. Kích thước hạt ................................................................................................... 66 3.3.3. Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome .................................................... 67 3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc ........................................................................... 67 3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân .......................... 67 3.3.5.1. Cá và chế độ ăn ............................................................................................... 67 3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng ................................................................................ 69 3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi ........................... 69 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................70 4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn.........................70 4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin................... 70 4.1.2. Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ..................... 78 4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin .............................................................................................................. 78 6
4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mô hình RSM- CCD. ............................................................................................................................. 81 4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 90 4.1.4. Quy trình công nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn quy mô 80-100 lít/mẻ ......................................................................... 91 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết xuất ................................................................................................................................ 95 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết .................................................. 95 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết .................... 96 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết .................................................. 97 4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết ................................... 98 4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thông số công nghệ quá trình chiết xuất .............................................................................................................99 4.2.6. Kiểm tra sự tương hợp của mô hình .............................................................. 100 4.2.7. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất ..................................................................... 105 4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin ................................................. 107 4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol ...... 112 4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin .....................................................................................................................................113 4.3.3. Màu sắc cơ của cá hồi ...................................................................................... 115 KẾT LUẬN ................................................................................................................119 KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................121 NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................................121 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..122 BÀI BÁO QUỐC TẾ .................................................................................................122 BÀI BÁO TRONG NƯỚC ........................................................................................122 SÁNG CHẾ ................................................................................................................122 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 123 7
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải Tiếng Anh ANOVA Phân tích phương sai Analysis of Variance CMS Chất hoạt động bề mặt Glycerol monostearate CS Cộng sự DL Tải lượng thuốc Drug loading DMAPP Dimethylallyl pyrophosphate Dimethylallyl pyrophosphate EE Hiệu suất đóng gói Encapsulation Efficiency GGPP Geranylgeranyl pyrophosphate Geranylgeranyl pyrophosphate HMG-CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA High-performance chromatography HPCL Sắc ký lỏng cao áp liquid IC Nồng độ ban đầu Initial concentration MeOH CH3OH Methanol PBS Dụng dịch đệm phosphate Phosphate-buffered saline PDI Chỉ số phân tán Polydispersity Index ppm Phần triệu Parts per million RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng Response surface methodology SD Độ lệch chuẩn Standard deviation SKK Sinh khối khô STT Số thứ tự TCA Hợp chất trung gian Tricarboxylic acid THF Tetra hydro furan Tetrahydrofuran TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography TLTK Tài liệu tham khảo Reference TPC Hàm lượng phenolic tổng Total phenolic content UI Cường độ siêu âm Ultrasound intensity UV Tia cực tím Ultraviolet 8
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.8. 1. Nhu cầu một số vitamin của cá hồi vân ....................................................43 Bảng 1.8. 2. Nhu cầu một số khoáng chất của cá hồi vân .............................................44 Bảng 1.8.3. Công thức thức ăn cho cá hồi giai đoạn nuôi thương phẩm ......................44 Bảng 2.5.1. Các thông số kế hoạch ...............................................................................53 Bảng 3.1.1. Thành phần môi trường và nồng độ sử dụng thí nghiệm ...........................56 Bảng 3.1.2. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát ................................................57 Bảng 3.1.3. Ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening ...........................57 Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệm .........................................................58 Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin ............................ 59 Bảng 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ...........................60 Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm ..........................................................64 Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ .....................................65 Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm .....................68 Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 ................................................................ 73 Bảng 4.1.2. Thành phần môi trường ..............................................................................77 Bảng 4.1.3. Ma trận Min Run Screening và mức ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Cx và Biomass .........................................................................................................................80 Bảng 4.1.4. Giá trị biến thực và biến mã hóa trong kế hoạch thực nghiệm Box – Hunter (CCD) ................................................................................................................81 Bảng 4.1.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ....82 Bảng 4.1.6. Kết quả phân tích thống kê ANOVA đối với 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 ..82 Bảng 4.1.7. Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin......................................................88 Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ...........................90 Bảng 4.2.1. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm ..........................................................99 Bảng 4.2.2. Bảng kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm .............................................99 Bảng 4.2.3. Bảng phân tích hồi quy các hàm mục tiêu Y1 và Y2 ................................100 Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ ....................................................105 Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. ........110 9
Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối lượng ướt) ....................................................................................................................115 Bảng 4.3.3. Giá trị đo màu của philê lấy từ cá hồi vân được thí nghiệm bằng các chế độ ăn khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau một, hai và ba tháng cho ăn thử nghiệm (n=3) ............................................................................................................................116 10
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2.1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) .14 Hình 1.3.1. Sơ đồ sinh tổng hợp canthanxanthin .........................................................19 Hình 1.3.2. Sơ đồ lên men liên tục và lên men liên tục có lắng tế bào và lấy bổ sung .24 Hình 1.5.1. Sơ đồ hệ thống chiết siêu âm quy mô công nghiệp ....................................30 Hình 1.6.1. Sơ đồ liposome được hình thành bởi phospholipid trong dung dịch nước 36 Hình 1.8.1. Cá hồi vân ...................................................................................................40 Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin ...........................48 Hình 3.2.1. Đồ thị đường chuẩn của canthaxanthin ......................................................61 Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol......................66 Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan .....................................................................69 Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất các bon và ni tơ đến sự sinh tổng hợp canthanaxanthin của P.carotinifaciens VTP 20181 .......................................................70 Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181.....................................................71 Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vô cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 ..........................................................................................72 Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181 ...................................................................................77 Hình 4.1.5. Thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ..................................78 Hình 4.1.6. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin 80 Hình 4.1.7. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 .......84 Hình 4.1.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hiệu suất tạo canthaxanthin (b) ...........................................................................................................88 Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2 ......................89 Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mô hình xây dựng được .......................................................................................................89 Hình 4.1.11. Quy trình công nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ Paracoccus carotinifaciens VTP 20181 quy mô 80-100 lít/mẻ ........................................................92 Hình 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới quá trình chiết .......................................95 Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết ..................96 Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết ...............................................97 11
Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của công suất siêu âm tới quá trình chiết ................................ 98 Hình 4.2.5. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y1 ........102 Hình 4.2.6. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y2 ........102 Hình 4.2.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng carotenoid tổng (b).......................................................................................................104 Hình 4.2.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ...........................106 Hình 4.2.10. Điều kiện tối ưu các biến công nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu Y1 và Y2 .......................................................................................................................106 Hình 4.2.11. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong phòng thí nghiệm .........................................................................................................107 Hình 4.2.12. Công thức hóa học của hợp chất canthaxanthin .....................................107 Hình 4.2.13. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch ..................................................108 Hình 4.2.14. Canthaxanthin sạch .................................................................................108 Hình 4.2. 15. Sắc ký lớp mỏng canthaxanthin ............................................................108 Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%. ..................................109 Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4 ..................................................................................111 Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol .....................................................................................................................................112 Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được nuôi bằng các chế độ ăn khác nhau. ..........................................................................................................114 Hình 4.3.5. Màu sắc cơ của cá khi kết thúc thí nghiệm ..............................................117 Hình 4.3.6. Hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ ............................................118 12
MỞ ĐẦU Canthaxanthin được sử dụng như một loại phụ gia, chất tạo màu cho thực phẩm và thuốc nhuộm trong mỹ phẩm. Ngoài ra nó cũng được phép cho thêm vào thức ăn cho gia cầm và thuỷ sản. Canthaxanthin được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo màu cho cơ thịt động vật trưởng thành, chống lại các gốc tự do oxy hóa [1], chống khối u [2], ngăn ngừa bệnh tim mạch [3], [4], bảo vệ gan [5], chống tiểu đường [6], chống bức xạ tia cực tím [7], chống viêm [8], thoái hóa điểm vàng [9]. Trong hệ sinh thái biển, canthaxanthin được tìm thấy trong tảo, vi khuẩn và giáp xác. Cá không có khả năng tự sinh tổng hợp carotenoid nhưng có khả năng tích lũy các chất này trong cá khi chúng ăn các loại trên. Trong nuôi thủy sản, hoàn toàn có thể gia tăng màu sắc thịt của chúng bằng cách bổ sung canthaxanthin vào thức ăn. Ngày nay, canthaxanthin được sử dụng khá phổ biến trong việc nuôi cá hồi thương phẩm khi chúng là nguồn bổ sung cần thiết trong thức ăn cho cá giúp nâng cao chất lượng giá trị cá hồi thương phẩm. Cho đến nay, có nhiều con đường khác nhau để thu nhận canthaxanthin từ nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học. Trong số đó, con đường thu nhận canthaxanthin từ quá trình sinh tổng hợp của một số chủng vi khuẩn ưa mặn như Dietzia natronolimnaea, Halobacterium, Paracoccus sp, Micrococcus roseus đã và đang được áp dụng có hiệu quả nhất, việc sử dụng, các sản phẩm từ vi sinh vật ngày càng nhiều do chúng có tính an toàn cao, hiệu quả và thân thiện với môi trường. Do đó việc nghiên cứu xây dựng quy trình sinh tổng hợp, làm sạch và tinh chế canthaxanthin từ vi khuẩn có ý nghĩa lớn về khoa học và thực tiễn. Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân” Nội dung nghiên cứu của luận án gồm: - Nghiên cứu, tối ưu hóa quá trình lên men thu sinh khối giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn - Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi khuẩn ưa mặn. - Tổng hợp liposome có chứa canthxanthin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nhằm nâng cao chất lượng và mầu sắc thịt cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss). 13
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về Carotenoid Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong các loài sinh vật quang hợp như là tảo, một vài loài nấm, một vài loài vi khuẩn và thực vật. Đến nay đã tìm được hơn 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyl và carotene [10]. Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử carbon) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprene. Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng thực phẩm có chứa carotenoid trong bữa ăn để tăng sức đề kháng và bảo vệ bản thân mình. Carotenoid còn có tác dụng chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Carotenoid được chia thành 2 loại là: carotene và xanthophyll. + Các carotene: có màu da cam, đỏ, là những hydrocác bon (C40H58) có 1 mạch chính 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 liên kết đôi mạch nhánh, chúng khác nhau ở các đầu chuỗi. Ví dụ: α-carotene, β-carotene và lycopene. + Xanthophyl: là các phân tử chứa oxi, thường có màu vàng. Ví dụ: lutein và zeaxanthin. Một số carotenoid tìm thấy trong thuỷ sản như: canthaxanthin, astaxanthin, zeaxanthin, tuna xanthin, lutein, beta carotene, doradexanthin, erichinenone. 1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin Hình 1.2.1. Công thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) Canthaxanthin có tên khoa học là β-β carotene-4,4’- dione, là một trong những dẫn xuất của β-carotene có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thậm chí trội hơn β- carotene. Hoạt chất này thuộc nhóm diketo-carotenoid (4,4’-oxo-carotenoid) với nhóm keto đối xứng ở vị trí 4 và 4’ của vòng β-ionone, 9 nhóm liên kết đôi C=C ở trung tâm phân tử hoạt động như cấu tử hấp phụ ánh sáng, tạo ra màu đỏ-cam của hoạt chất [11], [12]. Công thức phân tử của canthaxanthin: C40H52O2 14
Khối lượng phân tử M=564.82g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 211  2120C (kèm phân hủy) Hấp phụ cực đại tại bước sóng λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466 nm (ete dầu hỏa). Cúng giống như các carotenoid khác, canthaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh, dễ bị phân hủy khi để trong không khí, hoà tan tốt trong các dung môi kém phân cực. Công thức phân tử của canthaxanthin thì tương tự như β-caroten nhưng phức tạp hơn. canthaxanthin có 13 nối đôi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đôi vì vậy khả năng chống oxi hóa của nó cũng cao hơn β-caroten. Canthaxanthin tồn tại tương đối phổ biến trong tự nhiên, được phân lập đầu tiên từ, loài nấm ăn được Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo [11]. Canthaxanthin cũng được tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trưởng cùng với một số các caroten khác [12]. Ngoài ra, nó còn được phát hiện ở các loài vi khuẩn [10], động vật giáp xác [13] và ở nhiều loài cá như cá chép [14], cá đối vàng, cá tráp biển [15]. Canthaxanthin không được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Đại Tây Dương nhưng được tìm thấy ở loài cá hồi hoang dã Thái Bình Dương và một số loài cá hồi khác [13]. 1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin Tính tan: canthaxanthin rất ít tan trong nước vì nó là hợp chất không phân cực, nó tan trong các dung môi hữu cơ như ete, cồn, pyridine, dầu mỏ, dầu thực vật. Khả năng hấp thụ ánh sáng và màu sắc: canthaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu đỏ cam. Khả năng hấp thụ ánh sáng của canthaxanthin có thể bị thay đổi khi canthaxanthin liên kết với các chất khác. Trong các động vật giáp xác như cua, tôm canthaxanthin thường liên kết với phân tử protein (crutacyanin) có max = 628nm tạo nên màu xanh đặc trưng của các loài giáp xác sống. Khi có tác dụng của nhiệt, liên kết bị phá hủy các canthaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam. 1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin Trong phân tử canthaxanthin có chuỗi polyen, liên kết với các nhóm keto, hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên canthaxanthin rất nhạy với nhiệt độ cao, ánh sáng và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Tốc độ oxy hóa canthaxanthin diễn ra nhanh khi có sự xuất hiện của ion kim loại, sunfit, độ ẩm, hoặc để trong không khí. 15
Tính chất oxy hóa: canthaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxy hóa bởi tác nhân electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi canthaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Tính chất chống oxy hóa của canthaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng giữ lại các gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng. Phản ứng với axít: canthaxanthin phản ứng với, axít yếu làm dịch chuyển cực đại hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài, nhưng trung hòa bằng bazơ yếu, cấu trúc phân tử canthaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như: HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của canthaxanthin làm giảm màu đỏ cam. 1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản - Canthaxanthin có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào, tạo mầu sắc cho cơ thịt, tăng cường khả năng đề kháng, tăng khả năng tăng trưởng, tăng cường năng suất sinh sản, chống lại sự oxy hóa và chống lại các tia tử ngoại của một số loài thủy sản. 1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin Trong thực phẩm thì màu sắc bên ngoài là yếu tố quan trọng thu hút người tiêu dùng. - Canthaxanthin là chất màu chính trong vỏ và các cơ quan bên trong của các loài động vật giáp xác, nó chiếm từ 86 ÷ 98% của tổng lượng carotenoid. Màu đỏ tạo ra do quá trình gia nhiệt, protein bị biến tính làm đứt các liên kết giữa phức hợp carotenprotein làm giải phóng canthaxanthin tự do. Màu sắc cuối cùng phụ thuộc vào hàm lượng của canthaxanthin còn lại trong thịt cơ và vỏ của các loài giáp xác. - Với một số thực phẩm có nguồn gốc từ các loài giáp xác sau chế biến bị giảm mầu hoặc mất mầu, có thể bổ sung canthaxanthin như một phụ gia sẽ làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm. - Mục đích của việc bổ sung chất màu vào thực phẩm nhằm: + Khôi phục lại màu sắc đã bị mất trong quá trình bảo quản, chế biến (khi tiếp xúc với nhiệt độ, độ ẩm, không khí …). + Làm tăng màu của thực phẩm trong giới hạn cho phép. + Điều chỉnh màu sắc tự nhiên của thực phẩm, khi màu tự nhiên không đủ để thể hiện màu sắc cho sản phẩm. 16
+ Làm đồng nhất màu sắc thực phẩm + Làm thực phẩm có màu hấp dẫn đối với người tiêu dùng Đến nay, có rất nhiều tài liệu đã chứng minh rằng canthaxanthin là một chất an toàn về mặt thực phẩm. 1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin 1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus Năm 1992, các tác giả đã mô tả Paracoccus là một Prokaryote gồm có 2 loài là P.denitrificans và P.halodenitrificans [16]. Sau đó, chủng Paracoccus halodenitrificans bị loại trừ bởi vì nó được chứng minh là một thành viên của chi Halomonas thuộc ngành Proteobacteria [17]. Tính đến năm 2006, tổng cộng đã phát hiện 14 loài mới của Paracoccus dựa trên mô tả và phân tích trình tự gen bao gồm các loài: vi khuẩn hóa tự dưỡng lưu huỳnh P.pantotrophus và P.Versutus Các chủng thuộc chi Paracoccus thuộc cầu khuẩn có đường kính từ 0,4 ÷ 0,9µm, hoặc trực cầu khuẩn (coccobacilli) có chiều dài lên đến 2 µm ở dạng tế bào đơn, tế bào đôi, chuỗi tế bào. Paracoccus là vi khuẩn gram âm và hầu hết các loài đều không di động. Các loài thuộc Paracoccus là vi khuẩn hiếu khí, phát triển nhanh trên môi trường các chất hữu cơ, một số loài có khả năng phát triển trọng môi trường yếm khí với nitrate hoặc oxide ni tơ là tác nhân oxy hóa và tạo ra sản phẩm cuối cùng là dinito. Khả năng lên men của Paracoccus chưa được biết đến nhiều trong các công bố. Paracoccus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-37°C, pH= 6,5-8,5, ngoại trừ P.alcaliphilus phát triển ở pH=8-9.5 và phát triển yếu ở pH= 7.0 [18]. Tất cả các chủng Paracoccus được kiểm tra cho đến nay đều chứa ubiquinone-10 là một quinone hô hấp, như mong đợi đối với các thành viên thuộc phân lớp α-3 của Proteobacteria, ngoài ra còn một lượng nhỏ ubiquinone-9 và ubiquinone-11 cũng được báo cáo ở một số chủng. Một số chủng có thể tích lũy poly-β-hydroxybutyrate trong điều kiện đủ các bon và có hoạt tính catalase và oxydase. Để mô tả các đặc điểm chung của chi là xuất phát từ các đặc tính của P.denitriﬁcans, P.pantotrophus và P.versutus, không áp dụng cho một số chủng được phân lập gần đây. Các quy trình nuôi cấy làm giàu (tăng mật độ giống) một số chủng Paracoccus phụ thuộc vào việc lựa chọn một trong hai con đường là tự dưỡng hoặc chuyển hóa methan (methylotrophic) trong môi trường oxy hóa với hydro hoặc methylamine (với sự có mặt của các bon dioxide) hoặc của các chủng khử nitơ trong điều kiện anoxic 17
(nitrat hóa và khử nitrat) với nitrat là chất oxy hóa và các hợp chất hữu cơ như là nguồn các bon và năng lượng [19]. Sự tăng, trưởng của hầu hết các vi khuẩn oxy hóa hydro tự dưỡng ưa ấm trung bình (mesophilic) là chậm hoặc không thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy khử nitơ và kỵ khí [20]. Một số, chủng cũng có khả năng tăng trưởng tự dưỡng tốt trên formate và trong số đó có ba chủng là P.denitriﬁcans, P.versutus và P. kocurii. Do đó, làm giàu lượng giống bằng lên men kỵ khí với formate, các bon dioxide và nitrate (hoặc nitrous oxide) có thể phù hợp với 2 chủng P.denitriﬁcans và P.versutus. P.denitriﬁcans tăng trưởng tự dưỡng yếu trên methanol trong điều kiện khử nitrat. Một số chủng Paracoccus có thể phát triển tự dưỡng bằng cách sử dụng quá trình oxy hóa thiosulfate để cung cấp năng lượng, trong khi P.pantotrophus có thể sử dụng, các hợp chất cacbon disulﬁde (CS2) và methyl hóa hợp chất sulfur [21] và P.thiocyanatus có thể phát triển tự dưỡng hiếu khí trên thiocyanate [22]. Những cơ chất này đã giúp làm giàu mẫu và phân lập, được các chủng Paracoccus mới. Hiện nay, các chủng Paracoccus là nguồn sản phẩm sinh học tiềm năng chưa được khai thác một cách hiệu quả, khai thác thương mại mới sử dụng một số chủng. Hỗn hợp tế bào cố định 2 chủng P.denitriﬁcans và Corynebacterium đã dùng để sản xuất liên tục L-phenylalanine từ acid acetamidocinnamic và 2 chủng P.carotinifaciens và P.marcusii sản xuất quy mô công nghiệp canthaxanthin [16], [23]. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi sử dụng chủng: Paracoccus carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme - Viện Công nghiệp Thực phẩm để tiến hành thực hiện các nghiên cứu. 1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin Quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bắt đầu bởi sự chuyển hóa, acetyl CoA thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA, (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA synthase. HMG-CoA tiếp tục được chuyển hóa thành mevalonic acid (MVA), tiền chất đầu tiên của chu trình sinh tổng, hợp terpenoid. Các bước chuyển hóa tiếp theo gồm 2 xúc tác kế tiếp phosphoryl hóa bởi mevalonate kinase và phosphomevalonate decarboxylase để tạo thành IPP. 3 phân tử IPP được isome hóa thành dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) xúc tác bởi prenyltranssferase, tạo thành geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP). Phản ứng trùng hợp 2 phân tử GGPP tạo thành phytoene (carotene C40 đầu tiên của chu trình chuyển hóa canthaxanthin) sau đó bị khử tạo thành 18